Este manuscrito descreve a análise de variação número da cópia realizada em DNA de soro ou plasma utilizando a abordagem PCR em tempo real. Este método é adequado para a previsão da resistência a drogas em pacientes com câncer de próstata resistente a castração, mas poderia ser informativo também para outras doenças.
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Artigo de método
Soro e Plasma cópia número deteção usando PCR em tempo real
Neste artigo
Resumo
Resumo
Soro e plasma cell DNA gratuito (cfDNA) tem sido demonstrado como fonte informativa, não-invasivo de biomarcadores para diagnóstico de câncer, prognóstico, acompanhamento e previsão da resistência do tratamento. A partir da hipótese de que a ganhar o número de cópia de gene do andrógeno receptores (AR) (CN) é um evento frequente no cancro da próstata de castração metastático resistência (Abiraterona), propomo-na analisar este evento em cfDNA como um potencial biomarcador preditivo.
Nós avaliamos AR CN em cfDNA usando 2 diferentes ensaios PCR em tempo real e 2 genes de referência (RNaseP e AGO1). Quantidade de DNA de 60 ng foi usado para cada combinação de ensaio. AR Ganho de CN foi confirmado usando PCR Digital como um método mais preciso. Análise de variação de CN já foi demonstrado ser informativo para a previsão da resistência do tratamento no cenário do Abiraterona, mas pode ser útil também para outros fins em diferentes configurações de paciente. Análise CN na cfDNA tem várias vantagens: é não-invasiva, rápida e fácil de executar, e começa de um pequeno volume de material de soro ou plasma.
Introdução
Circular célula DNA gratuito (cfDNA) no sangue tem demonstrado para ser uma óptima fonte de biomarcadores para diagnóstico de câncer, prognóstico, acompanhamento e previsão de tratamento resistência1,2. Muitos estudos têm mostrado uma boa concordância entre alterações de DNA (mutações, variações de número de cópia, modificações epigenéticas em tecidos) e aqueles encontrados no correspondente plasma amostras1, confirmando que circulam o DNA do tumor (ctDNA) é informativo para o tumor primário e metastático tecido alterações3. A possibilidade de estudar ctDNA permi....
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Protocolo
O protocolo consiste o isolamento do DNA de amostras de soro ou plasma para realizar o PCR em tempo real para análise de número de cópia. Extração de DNA, controle de quantidade de DNA (espectrofotômetro) e PCR em tempo real para alvos específicos foram realizados. Na Figura 1, um resumo dos procedimentos e linha do tempo são relatados.
O protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa humana IRST.
1. processamento e coleta de soro
- Colete aproximadamente 5 mL sangue total em um tubo de soro sem anticoagulante para obter o soro. Manter os tubos de sangue a 4 °....
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Resultados
CfDNA total concentração era quantificável por espectrofotometria para todas as amostras analisadas, apresentando uma mediana de 6,12 ng / µ l (intervalo: 2,00-23.71 ng / µ l) para amostras de soro e uma mediana de 3,21 ng / µ l (intervalo: 2.31-8.49 ng / µ l) para as amostras de plasma. Foram analisados um total de 115 amostras por experimentos PCR em tempo real.
Teste de sensibilidade foi avaliada utilizando DNA misto de soro .......
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Discussão
AR Análise CN em amostra de soro e plasma representa uma abordagem nova, não-invasivo para a estratificação de pacientes com câncer de próstata resistente a castração (CRPC). Foi recentemente demonstrado que a CN AR é capaz de prever os resultados no CRPC pacientes tratados com abiraterone e enzalutamide, antes e depois da quimioterapia7,8,9,10.
A p.......
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Divulgações
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Agradecimentos
Agradecemos a Chiara Molinari e Filippo Martignano para apoio na análise de dados.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de soro BD Vacutainer | Becton Dickinson | 367814 | tubo de sangue total para soro |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | tubo de sangue total para plasma |
| Etanol absoluto | VWR | o usuário pode usar também outras empresas | |
| TaqMan Copy Number ensaio | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Ensaios pré-projetados e validados com corante FAM. Usamos o seguinte ensaio: AR_assay1: hs04107225 e AR_assay2: hs04511283 |
| Ensaio de número de cópia TaqMan (modificado) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Ensaio pré-projetado modificado com corante VIC: AGO1: Hs02320401_cn |
| Ensaio de referência do número de cópia TaqMan, humano, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix para PCR em tempo real |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | Kit de extração de DNA |
| MicroAmp 96-Well Placas Thermo | Fisher Scientific | N8010560 | placas para PCR em tempo real |
| NanoDrop 1000 Espectrofotômetro | Thermo Fisher | Scientific-o | usuário pode usar também outros métodos espectrofotométricos para quantificar o |
| DNA 7500 Sistema de PCR em tempo real rápido | Applied | Biosystem-o | usuário pode usar também outro instrumento em tempo real |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem-Software | para análise do número de cópias |
Referências
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
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Reimpressões e permissões
