Artigo de método

Protocolo melhorado por imunoprecipitação da cromatina do músculo esquelético de rato

DOI:

10.3791/56504

⸱

6 de novembro de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Functional Genomics and Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire

Neste artigo

Resumo

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É apresentado um novo protocolo para a preparação da cromatina do músculo esquelético de rato adulto adaptado para o estudo da regulação gênica em fibras musculares por imunoprecipitação da cromatina.

Resumo

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Descreveremos um protocolo eficiente e reproduzível para a preparação da cromatina do músculo esquelético de rato adulto, um tecido resistente fisicamente com um alto teor de proteínas estruturais. Músculos de membros dissecados de ratos adultos fisicamente são rompidos por homogeneização mecânica, ou uma combinação de picagem e douncing, em um buffer hipotônica antes da fixação de formaldeído do lisado celular. Os núcleos fixos são purificados por mais ciclos de homogeneização mecânica ou douncing e filtrações sequenciais para remover os resíduos de célula. Os núcleos purificados podem ser sonicated imediatamente ou posteriormente após congelamento. A cromatina pode ser sonicated com eficiência e é apropriado para experimentos de imunoprecipitação da cromatina, conforme ilustrado pelos perfis obtido por fatores de transcrição, RNA polimerase II e modificações do histone covalente. Os eventos de ligação detectados usando cromatina preparada pelo presente protocolo predominantemente são aqueles que ocorrem no núcleo da fibra muscular apesar da presença de cromatina de outro satélite de fibra-associado e células endoteliais. Este protocolo, portanto, é adaptado para estudar a regulação gênica no músculo esquelético rato adulto.

Introdução

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Imunoprecipitação da cromatina (ChIP) acoplado a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e sequenciamento de alto throughput (ChIP-seq) tornaram-se os métodos de escolha para estudar a transcrição e epigenética regulação da expressão gênica em diversos tecidos e tipos de células1. Esta técnica permite a criação de perfil de todo o genoma de modificações covalentes cromatina, ocupação variante de histona e32,ligação do fator da transcrição.

Enquanto executando o ChIP de células cultivadas está bem estabelecida, ChIP de tecidos de mamíferos permanece mais desafiador. Preparação da cromatina para ChIP envolve várias etapas críticas que precisam ser otimizados para cada tipo de tecidos e células. Cromatina pode ser preparada do lisado celular de células cultivadas ou seguir a purificação de seus núcleos. No caso de tecidos de mamíferos, Lise eficiente, fixação de formaldeído e purificação dos núcleos são críticos para garantir ótima recuperação da cromatina. Além disso, a escolha de se corrigir os núcleos antes ou depois da sua purificação tem de ser determinado experimentalmente. Apesar destes obstáculos, ChIP tem sido realizado com sucesso de tecidos como o fígado, testículo ou cérebro4,5,6. No caso de músculo esquelético, o rompimento de um tecido tão fisicamente resistente, que apresenta um alto teor de proteínas estruturais e isolamento de seus núcleos é particularmente desafiadora. Tendo em conta esta especificidade, protocolos otimizados para outros tecidos não dão resultados satisfatórios para os músculos esqueléticos.

Aqui descrevemos um protocolo para isolar a cromatina ChIP-grau de tecido de músculo esquelético de rato que envolve fisicamente, rompendo o tecido, fixação de formaldeído e então o isolamento dos núcleos e sonication. A eficiência deste método para preparar a cromatina apropriada para ChIP deste tecido foi demonstrada por realização de ChIP-qPCR e ChIP-seq para vários fatores de transcrição, RNA polimerase II e de modificações do histone covalente7.

Esta nova técnica é muito mais rápida do que um protocolo relatado anteriormente8 composto por etapas de digestão tempo colagenase durante esse tempo, mudanças na localização de genômica de factores de transcrição e alterações na expressão do gene podem ter lugar. A rapidez com que os núcleos são isolados e fixa faz com que o método descrito aqui particularmente atraente para preparar a cromatina que capta mais fielmente o estado de ocupação genômica nativo. Além disso, apesar de tem outros métodos de extração de isolamento ou proteínas da cromatina de tecido muscular foram descritas8,9,10 e usado para experiências de ChIP-qPCR genes selecionados, sem ChIP-seq dados tem sido relatados como usá-los. O método relatado aqui é apropriado para transcrição fator e histona modificação ChIP-seq e, portanto, deve ser também apropriado para aplicações de captura do HiC cromatina conformação ou 3 / 4C.

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Protocolo

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os ratos foram mantidos em conformidade com as diretrizes institucionais em matéria de cuidados e uso de animais de laboratório e em conformidade com as diretrizes nacionais de cuidado Animal (Comissão Europeia a Directiva 86/609/CEE; Francês o decreto 848-87). Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética nacional francês.

1. isolamento de tecido muscular

rato
  1. sacrifício um adulto 6 a 8 semanas de idade por deslocamento cervical. Sterlise o membro lavando-o com 70% de etanol e dissecar os músculos do membro posterior (gastrocnêmio, tibial Anterior, quadríceps) usando uma tesoura de ponta fina e pinças.
    Nota: Um rato deve render cerca de 500 mg de tecido.
  2. Picar os músculos num tubo de ensaio 2 mL contendo 1 mL de tampão de hipotônica gelada para uma preparação homogênea de pequeno (< 2-3 mm 3) peças usando muito bem a tesoura e deixe o tubo tremendo em um agitador de bancada superior a 4 ° C, durante 5-10 min.

2. Lise do tecido

Nota: consulte a tabela 1 para todas composições de buffer.

  1. Transferir o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de 14 mL e Resuspenda em 5 mL frio hipotônica buffer (EDTA-free inibidor da protease cocktail e PMSF).
    1. Homogenise tecido do músculo picada usando um solto homogenizacao (20-30 traços dentro 3min) ou um homogeneizador mecânico por 15 a 30 s em tubos de fundo redondo 14 mL.
      Nota: A eficiência de Lise pode ser avaliada nesta fase, por microscopia de luz, e se necessário, perturbações adicionais podem ser realizadas.
  2. Transferir o homogeneizado para os tubos de 15 mL e encher o volume de 10 mL com tampão hipotônica frio. Corrigir o homogenate conforme descrito abaixo antes de prosseguir com o próximo mouse.

3. Fixação

  1. Adicionar formol a concentração final de 1% e agitar durante 10 min à temperatura ambiente.
  2. Adicionar glicina a uma concentração final de 0,125 M em cada tubo de parar a fixação e agitar durante 5-10 min à temperatura ambiente.

4. Preparação de núcleos

Nota: consulte a tabela 1 para todas composições de buffer.

  1. Homogenise a fixo usando lisado um solto homogenizacao (traços de 5-10).
    1. Transferência para um tubo de 15 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C para obter núcleos e restos celulares.
  2. Remover o sobrenadante e ressuspender o precipitado no buffer hipotônica fresco 5ml. Filtre o lisado através de um filtro de célula de 70 µm em um tubo de 50 mL. Re-filtro filtrado através de um filtro de célula de 40 µm.
  3. Transferir o filtrado para um tubo de 15 mL e centrifugar a 1.000 x g por 5 minutos a 4 ° C para obter a pelota nuclear.
    Nota: Nesta fase, os núcleos podem ser imediatamente sonicated, ou partir congelado como um sedimento seco em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C.

5. Sonication

  1. avaliar o volume da pelota nuclear (cerca de 50 µ l para homogeneização mecânico e homogenizacao) e ressuspender-no buffer sonication até 3 a 4 vezes do volume nuclear embalado e proceda à sonicação durante 10-15 min a 4 ° C, usando um sonicador .
    Nota: A cromatina pode ser analisada imediatamente, conforme descrito abaixo (6) ou congelada e armazenada a -80 ° C.

6. Avaliar o tamanho do fragmento de cromatina seguindo Sonication

Nota: consulte a tabela 1 para todas composições de buffer.

  1. De-crosslink, tomar 30 µ l de cromatina em um tubo de ensaio de 1,5 mL e adicionar 20 µ l 5 M NaCl. Completar o volume a 500 µ l e incubar a 65 ° C durante a noite.
    1. No dia seguinte, realizar um tratamento com 1 µ l da protease K (20 mg/mL de caldo), 10 µ l 2 M Tris pH 6,8 e 10 µ l de EDTA 0,5 M para 1 h, a extração de executar um fenol-clorofórmio clorofórmio/42 ° C. e precipitar o DNA com 1 volume de sódio acetat e (3 M) e 2 volumes de etanol 100% para um h-80 ° c, ou durante a noite em -20 ° C.
  2. O DNA de pelotas por centrifugação a 13.500 x g, durante 15 min. decantar o sobrenadante e lavar o sedimento completamente com álcool etílico 70% frio e centrifugar novamente por 5 min. decantar o sobrenadante e secar o sedimento.
  3. Resuspenda o pellet no volume original (30 µ l) de tampão TE. Medir a concentração de DNA em um Espectrofotômetro de absorvância a 260 nm/280 nm. Pipetar 500-1.000 ng de DNA juntamente com uma escada de tamanho de DNA em corredores separados de um gel de agarose 1,5% e executar eletroforese para avaliar o tamanho do fragmento da cromatina.
    Nota: Tamanho do fragmento deve estar entre 200-500 pares de bases e não deve haver nenhum fragmento detectável de alto peso molecular correspondente à não - ou mal-fragmentado DNA. Se necessário, a solução de cromatina (etapa 5) pode ser re-lisada por mais tempo e então re-analisada conforme descrito acima, até o tamanho ideal é obtido.

7. Imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

Nota: consulte a tabela 1 para todas composições de buffer.

  1. Contas de sepharose bloco a proteína G por alíquotas de 1 mL do chorume em etanol a 50%. Pelota as contas por centrifugacao a 400 x g por 1 min em uma bancada centrífuga e lavagem com 1 mL de 400g de x de centrifugar TE reserva e repita o Wash.
    1. Após a segunda centrifugação, re-suspender em 1 mL de tampão de diluição de ChIP com 25 µ l de BSA (estoque 20 mg/mL) e 20 µ l do fermento tRNA (estoque 10 mg/mL). Bloquear as contas pelo menos 2 h antes da sua utilização por rotação (40-60 rpm) em 4 ° C.
    2. Diluir 50 µ g de cromatina (etapa 5) 8 a 10 vezes com tampão de diluição do ChIP. Adicionar 50 µ l de chorume bloqueados do grânulo e incubar durante 2 h (40-60 rpm) de giro a 4 ° C. centrifugar a 400 x g a 4 ° C para obter previamente limpo da cromatina e transferi-lo para um tubo novo.
  2. Para a imunoprecipitação, adicionar a quantidade apropriada de anticorpo primário (por exemplo, 1-2 µ g por 10 µ g de cromatina) e incubar durante uma noite com rotação em 4 ° C.
    Nota: A quantidade ideal de anticorpo pode ser recomendada pelo fornecedor, ou pode ser determinada empiricamente através da realização de ChIP-qPCR com diferentes quantidades de anticorpos até enriquecimento ideal é observado. Também sepharose proteína G pode ser substituída pela proteína um sepharose dependendo do subtipo de anticorpo usado.
  3. Adicionar as contas bloqueadas no dia seguinte e incubar durante 1 h com rotação (40-60 rpm) em 4 ° C. centrifugar a 400 x g por 20-30 s para granular os grânulos, remover o sobrenadante e começar o ChIP lava.
  4. ChIP lavagens: executar as lavagens seguintes com os buffers: uma vez com baixa reserva de sal e depois duas vezes com tampão de sal alta, duas vezes com LiCl Buffer e finalmente duas vezes com tampão TE.
    1. Pelota os grânulos entre cada lavagem por centrifugação a 400 x g, durante 20-30 s em uma centrífuga de bancada e executar cada lavagem durante 10 min com rotação (40-60 rpm) a 4 ° C.
  5. Para a eluição, retire a última lavagem e ressuspender os grânulos em tampão de eluição 250 µ l (preparadas) durante 15 minutos à temperatura ambiente e agitando.
  6. Centrífuga em 400 x g e recolher o eluato num tubo de fresco. Realizar essa etapa duas vezes e, em seguida, de-crosslink o eluído durante a noite com 20 µ l M de NaCl 5 e 1 µ l do RNase A (10 mg/mL), tratar com proteinase K e fenol-clorofórmio/clorofórmio extragir como na etapa 6.
  7. Resuspenda em 50 µ l de tampão TE e usar alíquotas para ChIP-qPCR conforme protocolos padrão 15, para verificar a qualidade do ChIP.

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Resultados

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Para isolar núcleos, realizamos a homogeneização mecânica do tecido muscular dissecado e picada para 15 ou 45 s, 18.000 e 22.000 rpm (ver Tabela de materiais). Em todas as condições, núcleos poderiam separar os restos de tecido, mas o rendimento foi otimizado usando a velocidade mais baixa (figura 1A-B). Núcleos também podem ser preparados por douncing por 3-5 min (figura 1Ae dados não mostrados)...

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Discussão

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Aqui nós descrevemos um novo protocolo para a preparação de cromatina de músculos esqueléticos de rato adulto e mostrar que este cromatina é adequada para experimentos de ChIP que detectar a ligação do fator de transcrição e modificações do histone covalente no núcleo da fibra muscular. Este protocolo envolve várias etapas críticas. O primeiro é rompimento de tecido que pode ser executado por homogenizacao ou por cisalhamento mecânico. O corte mecânico é mais rápido e mais reprodutíveis e é, portanto, o método de escolha...

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Divulgações

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

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Agradecemos a todos os funcionários da facilidade de sequenciamento de alta taxa de transferência IGBMC, um membro do consórcio "França Génomique" (ANR10-INBS-09-08) e todos os serviços IGBMC gerais em particular os funcionários do centro de animais IGBMC. Este trabalho foi apoiado por concessões do CNRS, o INSERM, o AFM, a Ligue Nationale contre le Cancer, do Estado francês fundo através da ANR no âmbito do programa d'Avenir Investissements rotulados ANR-10-IDEX-0002-02, o Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 e a ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sambakana foi suportada pelo Ligue Nationale contre le Cancer e o ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 e V.U o Ministère de l'Enseignement et de la Recherche. ID é uma 'équipe labellisée' da Ligue Nationale contre le Cancer.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
T 25 digital ULTRA-TURRAXT 18 ULTRA-TURRAX0009022800
PMSFSIGMA-ALDRICH CHIMIE SARLP7626-25G
Inibidor de Protease Livre de Cocktail-EDTARoche Diagnostics11873580001
Proteína G Grânulos de SepharoseSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-3296
Proteinase KSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-2308
Filtros de células 70umCorning BV431751
Filtros de células 40umCorning BV352340
Formaldeído EM grauEuromedex15710-S
Rnase AFischer Scientific12091039
Fenol: Clorofórmio: Álcool isoamílico 25:24:1SIGMA-ALDRICH CHIMIEP3803
BSASIGMA-ALDRICH CHIMIEB4287-25G
levedura tRNASIGMA-ALDRICH CHIMIER5636
Glicogênio AzulAMIBIONAM9516
Pol II ChIP AnticorpoSanta CruzSC-9001
H3K27ac ChIP AnticorpoMotivo Ativo39133
Tead4 ChIP AnticorpoAviva Systems Biology(ARP38276_P050)
IGEPALSIGMA-ALDRICH CHIMIEI-3021
E220 Ultrasonicator FocalizadoCovaris E220
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Itens adicionais
Tesouras
Loose Dounce
15 ml e 50 ml tubos
14 ml tubos de fundo
1,5 ml e 2 ml Eppendorf tubes
70 μ m e 40 μ filtros de células m (Corning)
de falcãoredondo

Referências

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  1. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  2. Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
  3. Wade, J. T. Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq. Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).
  4. Alpern, D., et al. TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation. Elife. 3, e03613(2014).
  5. Martianov, I., et al. Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells. BMC Genomics. 11, 530(2010).
  6. Achour, M., et al. Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice. Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).
  7. Joshi, S., et al. TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo. PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).
  8. Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Myogenesis: Methods and protocols. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).
  9. Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue. BMC Res Notes. 5, 513(2012).
  10. Thomas, J. L., et al. PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression. Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).
  11. Kuo, T., et al. Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).
  12. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  13. Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation. Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).
  14. Cowling, B. S., et al. Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy. J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).
  15. Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html (2017).

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