Artigo de método

Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK

DOI:

10.3791/56515

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30 de março de 2018

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1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

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Um método simples para a obtenção de clones NK e células T de pacientes CAEBV foi desenvolvido com alta eficiência, uma pequena quantidade de sangue periférico e uma baixa dose de Il-2.

Resumo

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Vários métodos têm sido descritos para estabelecer linhas de células NK/T de pacientes com síndrome de linfoma ou linfoproliferativa. Estes métodos empregados alimentador células, purificado de células NK ou T com tanto quanto 10 mL de sangue ou uma dose elevada de Il-2. Este estudo apresenta um novo método com uma estratégia simples e poderosa para estabelecer linhas NK e células T pelo cultivo do periférico sangue células mononucleares (PBMC) com a adição de Il-2 humana recombinante (rhIL-2) e usa tão pouco quanto 2 mL de sangue total. As células podem proliferar rapidamente em duas semanas e ser mantidas por mais de 3 meses. Com este método, 7 linhas de NK, ou células T se estabeleceram com uma elevada taxa de sucesso. Este método é simples, confiáveis e aplicáveis ao estabelecimento de linhagens celulares de mais casos de linfoma de células CAEBV ou NK/T.

Introdução

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Vírus de Epstein - Barr (EBV) é onipresente e infecta não apenas as células B, mas também T e as células killer naturais (NK), que faz com que um número de doenças linfoproliferativas de EBV-associados NK/T (LPD) e linfoma/leucemia, tais como hemofagocítica EBV-associados hemophagocytosis, hydroa vaciniforme, como linfoma, linfoma de células T/NK extranodal, tipo nasal e NK agressiva células leucemia1,2,3. Entre estes é crônica ativa EBV (SCAEBV) doença grave, que é incidente principalmente no leste da Ásia, e que é agora considerado um LPD causada pela expansão clonal de inf....

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Protocolo

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Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética do Instituto de genética e biologia do desenvolvimento, da Academia Chinesa de Ciências, e o protocolo segue as diretrizes institucionais para o bem-estar humano.

Nota: Consulte a Figura 1 para um esquema de fluxo de trabalho.

1. isolamento de PBMC de pacientes CAEBV

  1. Purificar o primário PBMC de 2 mL de sangue total de pacientes CAEBV por gradiente (por exemplo, Ficoll-placa) centrifugação seguindo as instruções do fabricante. Alternativamente, o degelo criopreservado PBMC de nitrogênio líquido com meio RPMI 1640.
    2. ....

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Resultados

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Depois de 3 dias cultura durante o estabelecimento de linhas de células, as células polimórficas começam a aparecer (Figura 2). Após 7 dias, as células crescem rapidamente, como o número e a viabilidade das células aumentam em uma taxa elevada (Figura 3). Pequenos grupos de células são claramente visíveis após 10-14 dias de crescimento, quando a concentração de células pode exceder 3-6 × 106. Neste período, as células .......

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Discussão

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Neste protocolo, desenvolveu uma nova técnica para o estabelecimento de linhas de células NK/T do sangue inteiro de pacientes CAEBV. Comparado com os métodos existentes, a grande vantagem deste método é sua simplicidade e sua exigência de apenas um pequeno volume de sangue, enquanto que apresenta uma elevada taxa de sucesso e boas condições de viabilidade celular. Além disso, as linhas de células NK/T podem ser estabelecidas por PBMC de cultivo sem determinar os tipos de célula, o EBV Latentemente infectada com antecedên.......

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Divulgações

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D.Z., X.Z. e X.C. são co-inventores em pendentes pedidos de patentes cobrindo potenciais usos deste método para o estabelecimento de linhas de células NK/T e a linha celular estabelecida neste estudo. D.Z., X.Z. e X.C. declaram sem interesses financeiros concorrentes neste trabalho. Os restantes autores declaram que têm sem interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pela projetos chave da Academia Chinesa de Ciências (KFZD-SW-205), estratégico biológicos recursos tecnologia sistema de suporte de chinês Academia de Ciências (CZBZX-1 e ZSSB-004) e por doações de (Fundação Nacional de ciência da China 81401640) e o fundo de ciências naturais (14ZR1434800) de Shanghai.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Hu HLA-DR FITCBD560944 anticorpo para FACS
Hu CD4 FITCBD555346 anticorpo para FACS
Hu / NHP CD8 PEBD557086 anticorpo para FACS
Hu CD3 PEBD555340anticorpo para FACS
Hu CD16 FITC 3G8BD555406anticorpo para FACS
Hu / NHP CD56 PE MY31BD556647anticorpo para FACS
hu/CD19 PE-Cy7BD560728anticorpo para FACS
IL-2 humanoRoche11147528001
soro humanoMRCCCC118-125
Incubadora de CO2SANYO
CentrifugeTechcompCT6TMicroscópio de centrifugação
OLYMPUS CKX53CKX53
Contador de Células AutomatizadoCountstarIC 1000Para contagem de células
24 poços cluster de cultura de célulasCorning Incorporated3524Placas de poliestireno
25cm2 frasco de cultura de célulasNest707001Poliestireno
FBSGibco10270Componente do meio celular
RPMI Medium 1640life22400089Para meio celular
L-GlutaminaAmresco374Componente do meio celular
100 x solução de estreptomicina penicilina BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Componente do meio celular
Ficoll paque plusGE Healthcare17-1440-03Para isolamento in vitro de linfócitos
DMSOSigmaD2650Para congelamento de células
citômetro de fluxoBDBD FACSAria II
softwareBDBD FACSDiva softwareFACS análise FACS

Referências

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  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompro....

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