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Artigo de método

Um método simples e eficiente para estabelecer linhas de células T de pacientes com infecção crônica ativa vírus Epstein - Barr e NK

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DOI:

10.3791/56515

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30 de março de 2018

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1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

Um método simples para a obtenção de clones NK e células T de pacientes CAEBV foi desenvolvido com alta eficiência, uma pequena quantidade de sangue periférico e uma baixa dose de Il-2.

Resumo

Vários métodos têm sido descritos para estabelecer linhas de células NK/T de pacientes com síndrome de linfoma ou linfoproliferativa. Estes métodos empregados alimentador células, purificado de células NK ou T com tanto quanto 10 mL de sangue ou uma dose elevada de Il-2. Este estudo apresenta um novo método com uma estratégia simples e poderosa para estabelecer linhas NK e células T pelo cultivo do periférico sangue células mononucleares (PBMC) com a adição de Il-2 humana recombinante (rhIL-2) e usa tão pouco quanto 2 mL de sangue total. As células podem proliferar rapidamente em duas semanas e ser mantidas por mais de 3 meses. Com este método, 7 linhas de NK, ou células T se estabeleceram com uma elevada taxa de sucesso. Este método é simples, confiáveis e aplicáveis ao estabelecimento de linhagens celulares de mais casos de linfoma de células CAEBV ou NK/T.

Introdução

Vírus de Epstein - Barr (EBV) é onipresente e infecta não apenas as células B, mas também T e as células killer naturais (NK), que faz com que um número de doenças linfoproliferativas de EBV-associados NK/T (LPD) e linfoma/leucemia, tais como hemofagocítica EBV-associados hemophagocytosis, hydroa vaciniforme, como linfoma, linfoma de células T/NK extranodal, tipo nasal e NK agressiva células leucemia1,2,3. Entre estes é crônica ativa EBV (SCAEBV) doença grave, que é incidente principalmente no leste da Ásia, e que é agora considerado um LPD causada pela expansão clonal de infectadas por EBV T ou NK células4,5,6, 7, mas sem a aparente da imunodeficiência presentes na mononucleose infecciosa (IM)-como sintomas que incluem febre, hepatoesplenomegalia, linfadenopatia e disfunção hepática persistentemente ou periódica, bem como alta EBV-DNA carregar na sangue periférico8,9. Pacientes com CAEBV têm um prognóstico pobre10,11e sua patogênese e desconhece-se o papel do EBV. Portanto, cela linhas derivadas de doenças linfoproliferativas de EBV-associados NK/T e linfomas são muito úteis como modelos de celular para esclarecer o mecanismo de EBV induzida proliferação NK, ou células T e a sua relação com alta incidência de leucemia ou linfoma.

Até à data, foram estabelecidas várias linhagens celulares com diferentes técnicas12,13,14,15,16. Uma linhagem de células NK humana, NK-YS, estabeleceu-se de leucemia/linfoma de células NK, por co cultivo com uma linhagem de células do estroma do rato como alimentador e na presença de rhIL-2 em uma concentração de 20U por mL15. KAI3 era uma outra linha de célula NK estabelecida de pacientes com alergia severa mosquito ou SCAEBV com linha de células autólogas lymphoblastoid (LCL), células B, transformadas por EBV, como células de alimentador e adição de rhIL-2 em 100U/mL16. SNK6 e SNT8 foram derivados de tecidos de tumor da nasais pacientes de linfoma de células NK/T pela adição de altas doses de rhIL-2 (700U/mL)12. Com uma técnica semelhante, a célula de SNK-1 foi de pacientes CAEBV, cultivados de PBMC, removendo as células T e adicionando 700U/mL de rhIL-213,17. SNT13 e SNT15 foram estabelecidas através da remoção de CD4 + e CD8 + células18. Até agora, outras linhas de celular de células T e NK de pacientes EBV-NK/T LPD foram todos desenvolvidas com este método de19.

As desvantagens dos métodos existentes acima mencionados incluem o emprego de células do alimentador, a exigência de uma alta dose de IL-2, a utilização de sangue tanto quanto 10 mL ou a purificação de células NK/T, que é muito desafiador na clínica devido a a necessidade de verificar quais os tipos de célula que EBV Latentemente infecta antes de começar a cultura. Como CAEBV ocorre principalmente em crianças na Ásia, 10 mL sangue não é fácil de adquirir em todas as regiões. Neste estudo, nós desenvolvemos um novo método simples com uma elevada taxa de sucesso para estabelecer linhas NK e/ou células T pelo cultivo PBMC de pacientes CAEBV, usando uma dose baixa de rhIL2 e um volume de 2 mL de sangue total sem células de alimentador. Os resultados deste método provaram sua eficiência elevada e economia de tempo.

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Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética do Instituto de genética e biologia do desenvolvimento, da Academia Chinesa de Ciências, e o protocolo segue as diretrizes institucionais para o bem-estar humano.

Nota: Consulte a Figura 1 para um esquema de fluxo de trabalho.

1. isolamento de PBMC de pacientes CAEBV

  1. Purificar o primário PBMC de 2 mL de sangue total de pacientes CAEBV por gradiente (por exemplo, Ficoll-placa) centrifugação seguindo as instruções do fabricante. Alternativamente, o degelo criopreservado PBMC de nitrogênio líquido com meio RPMI 1640.
  2. Adicionar 2 µ l de azul de trypan (0,4%) de suspensão de células 18 µ l, espere 3 min para manchar as células, a suspensão de transferência para a placa de contador de células e medir concentração e viabilidade com um contador de célula automatizada das células.
  3. Preparar a suspensão de células em uma densidade de 2-3 × 106 células/mL suplementado com meio de cultura RPMI 1640 completo contendo 20% de soro humano (calor inativado a 56 ° C), 2 mM L-glutamina e antibióticos (estreptomicina 100 de µ g/mL, 100 penicilina U/mL). 1 mL de suspensão PBMC por bem em placas de cultura de células 24 poços de semente.
  4. Adicione 150 U rhIL-2 por bem.
  5. Colocar as placas de cultura numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C.
  6. No dia 2, observar a morfologia celular sob um microscópio (ampliação de X 200); as células estão em boas condições quando eles são brilhantes e redondos.

2. a expansão das células e as células viáveis de numeração

  1. Observar a morfologia celular sob um microscópio (ampliação de X 200) e monitorar a condição do crescimento celular, numerando as células antes de alterar o médio: adicionar 2 µ l de azul de trypan (0,4%) de suspensão de células 18 µ l e calcular a concentração das células (ver 1.2, Figura 2).
  2. Descartar a 500 µ l de meio em uma placa de 24 e adicionar 500 µ l completa cultura meio fresco. Adicione 150U rhIL-2 por bem.
  3. Mude o meio duas vezes por semana como no passo 2.2.
  4. Traçar a curva de crescimento de célula (Figura 3).
  5. Quando a concentração de células viáveis excede 5 × 106/mL, divida células em novos poços na concentração de 1 a 2 × 106 células/mL em cada poço. Este processo demora de 2 a 4 semanas.

3. célula fenotipagem por citometria de fluxo

  1. Quando as células têm se expandido, colete 1 × 106 células para determinar os fenótipos de linhas celulares. Centrifugar as células a 240 x g por 5 min à temperatura ambiente (células NK/T irão precipitar no fundo do tubo).
  2. Desprezar o sobrenadante, lave a precipitação pela adição de 7 mL de PBS. Centrifugue por 5 min a 240 x g , à temperatura ambiente. Repeti uma vez.
  3. Adicionar 200 µ l de soro humano para cada tubo, misture bem e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  4. Centrifugar as células a 240 x g por 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 × 106/mL com PBSA frio (PBS+0.2%BSA). Divida células em 5 tubos, cada tubo contendo 2 × 105 células.
  5. Células de centrífuga a 240 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células com PBSA buffer ou PBSA contendo 10 µ l PE (ou PE-Cy7) e 10 µ l FITC rotulado anticorpos para manchar os receptores celulares de células T ou NK no gelo como é indicado pela Figura 4. Células suspendidas com buffer PBSA são usadas como um controle negativo.
  6. Incube as células com anticorpos para 20-30 min no gelo no escuro.
  7. Lavar as células duas vezes com frio PBSA, re-suspender as células com 300 µ l PBSA frio.
  8. Analise o fenótipo da célula com um citômetro de fluxo.
    1. Configure o citômetro de fluxo, na condição de "Criar planilha". Configure o modelo experimental com uma trama de pontos que exibe a dispersão para a frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC).
    2. Carregar o isotipo controle tubo para otimizar as tensões SSC e FSC e otimizar o valor de limiar do FSC para eliminar detritos sem interferir com a população de células de interesse. Exclua todos os parâmetros, exceto o FSC, SSC, FITC, PE e PE-Cy7.
    3. Realize a compensação usando o isotipo controle e um único controlo positivo em cada grupo de análise de 2 cores.
    4. Carregar amostras e criar HLA-DR VS CD19, CD4 CD8 VS, CD56 VS CD16 e CD3 VS CD16 lotes do ponto mostrando diferente população de células.
      Nota: PBMC foram utilizados para realizar a compensação usando o controle negativo/isotype e o único controle positivo. 2-cor imunofluorescência com citômetro de fluxo foi usada rotineiramente para analisar a expressão de marcadores de superfície. Os anticorpos seguintes estão incluídos: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3, conjugado com ficoeritrina (PE) e anti-CD19 conjugados com PE-Cy7.

4. expansão e criopreservação de células NK/T

  1. Mude o meio quando for concluída a análise do fenótipo celular. Retire metade do líquido sobrenadante cuidadosamente e evite tocar as células na parte inferior da placa. Adicione o mesmo volume de meio de cultura fresco contendo 300 U/mL rhIL-2 para as placas da célula.
  2. Mudar metade do meio de cada 3 dias (como 2.2) até a célula clusters são claramente visíveis sob o microscópio (Figura 2). Normalmente, este processo leva 2-3 semanas.
  3. Transferi as células de placas de 24 poços para frascos de cultura T25 após a mistura de diferentes poços da mesma linhagem. Dobro do volume do meio de cultura é o que parece amarelo até o volume do meio de expande para 10-15 mL. Adicione rhIL-2 com a concentração de 150 U/mL.
  4. Mudar o médio 24 h antes de congelar após 2-3 semanas, crescendo, quando a célula massa pode ser observada a olho nu. Medir a concentração de células com um contador de célula.
  5. Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 5 min à 240 x g e ressuspender o pellet de células em uma densidade de 5-10 x 106 células/mL com a solução de estoque congelada que contém 90% de soro fetal bovino e 10% dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar a uma taxa de 1 ° C / min a-80 ° C e depois transferir diretamente para o nitrogênio líquido.

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Resultados

Depois de 3 dias cultura durante o estabelecimento de linhas de células, as células polimórficas começam a aparecer (Figura 2). Após 7 dias, as células crescem rapidamente, como o número e a viabilidade das células aumentam em uma taxa elevada (Figura 3). Pequenos grupos de células são claramente visíveis após 10-14 dias de crescimento, quando a concentração de células pode exceder 3-6 × 106. Neste período, as células ...

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Discussão

Neste protocolo, desenvolveu uma nova técnica para o estabelecimento de linhas de células NK/T do sangue inteiro de pacientes CAEBV. Comparado com os métodos existentes, a grande vantagem deste método é sua simplicidade e sua exigência de apenas um pequeno volume de sangue, enquanto que apresenta uma elevada taxa de sucesso e boas condições de viabilidade celular. Além disso, as linhas de células NK/T podem ser estabelecidas por PBMC de cultivo sem determinar os tipos de célula, o EBV Latentemente infectada com antecedên...

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Divulgações

D.Z., X.Z. e X.C. são co-inventores em pendentes pedidos de patentes cobrindo potenciais usos deste método para o estabelecimento de linhas de células NK/T e a linha celular estabelecida neste estudo. D.Z., X.Z. e X.C. declaram sem interesses financeiros concorrentes neste trabalho. Os restantes autores declaram que têm sem interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela projetos chave da Academia Chinesa de Ciências (KFZD-SW-205), estratégico biológicos recursos tecnologia sistema de suporte de chinês Academia de Ciências (CZBZX-1 e ZSSB-004) e por doações de (Fundação Nacional de ciência da China 81401640) e o fundo de ciências naturais (14ZR1434800) de Shanghai.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Hu HLA-DR FITCBD560944 anticorpo para FACS
Hu CD4 FITCBD555346 anticorpo para FACS
Hu / NHP CD8 PEBD557086 anticorpo para FACS
Hu CD3 PEBD555340anticorpo para FACS
Hu CD16 FITC 3G8BD555406anticorpo para FACS
Hu / NHP CD56 PE MY31BD556647anticorpo para FACS
hu/CD19 PE-Cy7BD560728anticorpo para FACS
IL-2 humanoRoche11147528001
soro humanoMRCCCC118-125
Incubadora de CO2SANYO
CentrifugeTechcompCT6TMicroscópio de centrifugação
OLYMPUS CKX53CKX53
Contador de Células AutomatizadoCountstarIC 1000Para contagem de células
24 poços cluster de cultura de célulasCorning Incorporated3524Placas de poliestireno
25cm2 frasco de cultura de célulasNest707001Poliestireno
FBSGibco10270Componente do meio celular
RPMI Medium 1640life22400089Para meio celular
L-GlutaminaAmresco374Componente do meio celular
100 x solução de estreptomicina penicilina BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Componente do meio celular
Ficoll paque plusGE Healthcare17-1440-03Para isolamento in vitro de linfócitos
DMSOSigmaD2650Para congelamento de células
citômetro de fluxoBDBD FACSAria II
softwareBDBD FACSDiva softwareFACS análise FACS

Referências

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