Method Article

Um protocolo para Decellularizing Cochleae Mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno

DOI:

10.3791/56523

⸱

January 1st, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo do presente protocolo é demonstrar um método eficaz para decellularize e descalcificar cochleae rato para utilização como andaimes para aplicações de engenharia de tecidos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos mamíferos, mechanosensory células ciliadas que facilitam a falta de audiência a capacidade de regenerar, que limitou a tratamentos para perda auditiva. Estratégias atuais de medicina regenerativa concentraram-se no transplante de células-tronco ou manipulação genética de em torno de células de suporte na orelha interna para incentivar a substituição de células-tronco danificadas para corrigir a perda de audição. Ainda, a matriz extracelular (ECM) pode desempenhar um papel fundamental na indução e manutenção da função das células de cabelo e não tem sido suficientemente estudada. Usando o coclear ECM como um andaime para cultivar células-tronco adultas pode fornecer insights exclusivos sobre como a composição e arquitetura do ambiente extracelular aids células em sustentar a função auditiva. Aqui nós apresentamos um método para isolar e decellularizing cochleae de ratos para usar como andaimes aceitando perfundidas células-tronco adultas. O protocolo atual, cochleae são isolados da eutanásia de ratos, decellularized e descalcificadas. Depois, células de geleia humana da Wharton (hWJCs) que foram isoladas a partir do cordão umbilical foram cuidadosamente pintadas em cada cóclea. Os cochleae foram usados como biorreatores, e as células foram cultivadas por 30 dias antes de sofrer a transformação para análise. Decellularized cochleae mantidos identificáveis estruturas extracelulares, mas não revelou a presença de células ou fragmentos visíveis de DNA. Células perfundidas na cóclea invadiram a maior parte do interior e exterior da cóclea e cresceram sem incidentes em uma duração de 30 dias. Assim, o método atual pode ser usado para estudar como coclear ECM afeta células desenvolvimento e comportamento.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A cóclea é uma estrutura espiral intrincado encontrada no osso temporal. Ele é composto de um labirinto ósseo exterior e interior, concêntricos labirinto membranoso1. O labirinto membranoso é composto por três espaços fluidos: Scala vestibuli, Scala Scala tympani1e mídia. A mídia scala abriga o epitélio sensorial, que é composto de uma infinidade de tipos de células, mas as células sensoriais de cabelo (HC), que transduce energia mecânica em ondas sonoras para impulsos nervosos2, são de particular interesse. Exposição ao trauma acústico3,4,5, medicação6, doença7,8e envelhecimento9 tudo o que pode resultar em insuficiência auditiva através da morte HC. Perda de cabelo celular em mamíferos é permanente, ao contrário de HCs aviária, que podem se regenerar após lesão10.

Uma variedade de esforços de pesquisa contemporânea procuraram restaurar perdidos HCs, embora as abordagens experimentais específicas variam. Manipulação da expressão do gene no epitélio sensorial e implante de células-tronco diferenciadas fora do corpo são abordagens dominantes no campo, apesar de tem sido métodos de indução que buscam diferenciar as células-tronco em organoids coclear tentativa de11,12,13. Cada uma dessas abordagens é também dependente diretamente as células-tronco, ou as pistas do desenvolvimento, usadas por células-tronco; no entanto, um segundo compartilhados, e potencialmente crítico, o elemento é o ECM da cóclea em si14,15.

O ECM não só fornece suporte físico para as células e tecidos, que inclui uma superfície de adesão celular, sobrevivência, proliferação e migração, mas também tem um papel crítico no desenvolvimento de HCs e a espiral do gânglio15,16 ,17. Naturalmente ocorrendo ECM fornece sinais indutivos que podem orientar a determinação do fenótipo celular e/ou18, de adesão, proliferação e sobrevivência celular. Consequentemente, o uso da cóclea decellularized em combinação com hWJCs cultivadas oferecem uma oportunidade única de explorar o papel da regeneração ECM e HC. HWJCs são um tipo de célula prontamente disponível, sem controvérsias, isolado de humanos cordões umbilicais que se comportar como células-tronco mesenquimais19. HWJCs tem demonstrado a capacidade de diferenciar-se abaixo de20,de linhagens de célula marcante21. Assim, o atual protocolo detalha o isolamento, decellularization e perfusão de cochleae de carcaças de rato C57BL com hWJCs para engenharia de tecidos do ouvido interno.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos, incluindo a eutanásia de animais, foram conduzidos de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) protocolo aprovado (cálice #2014-2234) da Universidade de Kansas Medical Center (KUMC).

Nota: HWJCs foram isoladas de humanos cordões umbilicais que foram doados pelos pacientes que forneceram consentimento informado e as amostras foram utilizadas em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comité de assuntos humanos da Universidade de Kansas (KU-IRB #15402).

1. osso Temporal colheita e isolamento da cóclea

  1. Decapitar um rato apropriadamente sacrificado, 15 semanas cortando entre o crânio e a primeira vértebra cervical com uma afiada tesoura cirúrgica e, em seguida, pulverizar a cabeça com etanol a 70% para desinfetar (figura 1A).
  2. Bissetriz do crânio em um médio sagital usando o mesmo par afiado de uma tesoura cirúrgica (figura 1B-C, linhas tracejadas).
  3. Remova o tecido cerebral do crânio utilizando um par de pinças (Figura 1, ponta de seta).
  4. Identifica o osso temporal através da presença do auditivo e o nervo vestibular raízes (Figura 1E-F, pontas de seta) no interior do crânio e do canal auditivo do exterior (Figura 1F, seta). Corte com cuidado através do crânio para isolar o osso temporal do resto do crânio (Figura 1).
    Nota: Em alguns casos, pode ser possível intrometer-se delicadamente os circundantes ossos do crânio longe do osso temporal sem a necessidade de corte.
  5. Insira a pinça bem a abertura do canal auditivo aproximadamente 5 mm (Figura 1 H), então as dicas não arrisque puncionando a cóclea. Suavemente quebrar o osso do bulla (Figura 1 H, top vermelha área sombreada) então ele fraturas (linhaFigura 1I, vermelha pontilhada).
    Nota: Se necessário, um microscópio de dissecação pode ajudar neste processo para garantir a colocação exata e manipulação de instrumentos.
  6. Usando a pinça fina, embora bisbilhotar o restante o bulla do osso temporal, expondo o labirinto ósseo da cóclea (Figura 1J, suportes de vermelhos).
  7. Coloque um prato de Petri grande o suficiente para segurar o osso temporal (por exemplo, 30 mm ou maior) por baixo da dissecação campo de visão do escopo e preenchê-lo com suficiente fosfato tamponado salino (PBS) para cobrir o osso temporal (por exemplo, 0,5 a 1 mL).
  8. Mergulhe no osso temporal com o bulla removido na PBS com as janelas ovais e redondas da cóclea virada para cima.
    Nota: A remoção do sistema vestibular da cóclea não é necessária, como o sistema vestibular serve bem como um identificador para a manipulação e orientando recursos da cóclea (Figura 1I e Figura 2B).
  9. Usando um par de microfuros de fórceps, remova a artéria estapédica, que atravessa o estribo.
  10. Inserir uma ponta da pinça ultra fina através do arco do estribo onde passou a artéria e delicadamente Levante o estribo para cima. O estribo desarticulado deve levantar fora a janela oval.
  11. Usando uma ponta da pinça ultra fina, fure o oval e redonda windows.
  12. Usar um 1X PBS preenchido 28,5 calibre seringa com tubo (diâmetro interno de 0,28 mm, diâmetro externo 0,61 mm) anexada, posicione o tubo sobre a janela oval (Figura 2A -B).
    Nota: A abertura do tubo pode ser manipulada usando fórceps ultra-fina, ajudando a garantir a colocação exata.
    1. Use uma seringa fresca e tubulação para cada cóclea.
  13. Perfundir 2ml de 10%-antibiótico antimicótico (anti-anti) e 10% penicilina-estreptomicina (pen-estreptococos) em PBS através da cóclea mais 5 min para remover a perilinfa. Perfusing muito rápido com muita pressão danificará as belas estruturas dentro da cóclea.
    Nota: Manualmente, dirigindo a seringa com a mão para perfundir o fluido através da cóclea é eficaz, embora uma bomba de perfusão pode ser usada como uma alternativa.
    1. Se perfusing manualmente, use um par de bem, fecho automático fórceps para estabilizar a cóclea (Figura 2A) durante a perfusão, agarrando-se a porção vestibular do osso temporal.
      Nota: Embora não seja obrigatório, isto deixa ambas as mãos livres para lidar com instrumentos; uma mão pode conduzir a seringa (Figura 2A), enquanto o outro pode posicionar o tubo adequadamente (Figura 2B).
    2. Desta etapa da frente, tome cuidado para evitar expor a cóclea desnecessariamente ao ar. Introdução de bolhas de ar nos espaços fluidos irá bloquear a circulação do fluido, e mais a secar irá danificar as belas estruturas dentro da cóclea.
  14. Remover e descartar qualquer restantes fragmentos de tecidos e ossos de músculo usando pinça fina.
  15. Se necessário, armazene cochleae isolado a 4 ° C em anti-anti 10% e 10% solução de caneta-estreptococos em PBS durante sete dias com mudanças regulares de solução antibiótica cada 48 h.

2. coclear processamento

  1. Decellularization
    1. Para cada cóclea, encha um frasco de cintilação de vidro de 20 mL com um 1% de sódio Dodecil sulfato solução (SDS) em água deionizada (DI), que é usada para decellularize a cóclea.
    2. Corte a ponta de uma pipeta de transferência de 7 mL plástico usando uma lâmina de barbear, de modo que a abertura é grande o suficiente para uma cóclea a passagem.
    3. Com a pipeta de transferência suavemente elaborar a cóclea na pipeta então só passa por alguns milímetros da borda de corte.
    4. Expulse da cóclea para o frasco de solução cintilação SDS 1%.
    5. Circule de 2 mL de SDS 1% em água desionizada de (DI) através da cóclea no frasco de cintilação, com uma pipeta de transferência.
    6. Coloque o frasco de cintilação em rotacao e permitir que o frasco de cintilação girar a 10 rpm para 72 h à temperatura ambiente.
      1. Altere a solução de SDS 1% cada 24 h ao longo de um período de 72 h. Tenha cuidado quando alterar SDS para Nunca exponha a cóclea ao ar.
    7. Lave a cóclea três vezes por 30 min cada com água.
Executar as lavagens no frasco de cintilação mesma usado para as acusações de SDS; nesta fase, a cóclea é decellularized.
  • Descalcificação
    1. Remova a água restante do DI o frasco de cintilação, deixando apenas o suficiente para manter a cóclea submergida.
    2. Para começar a descalcificação, adicione 5 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (0,02 M) a 10% em água para o frasco de cintilação que contém a cóclea.
    3. Circule de 2 mL de EDTA 10% em água DI através da cóclea no frasco de cintilação, com uma pipeta de transferência.
    4. Coloque o frasco de cintilação no rotador e permitir que o frasco de cintilação girar a 10 rpm para 72 h à temperatura ambiente. Altere a solução de EDTA 10% cada 24 h ao longo de um período de 72 h. Tenha cuidado quando alterar soluções para que a cóclea não é exposta ao ar.
    5. Enxágue a cóclea 3 vezes durante 2 h com PBS 1x; nesta fase, a cóclea é descalcificada.
  • Armazenamento
    1. Armazenar os cochleae por até 72 h em uma solução 10% anti-anti, 10% caneta-estreptococos em PBS a 4 ° C.
      Nota: Os períodos de armazenamento podem ser possíveis com mudanças regulares de solução antibiótica; no entanto, armazenagem prolongada de cochleae transformados não foi validada neste protocolo.

    • 3. a colheita e a expansão de hWJCs

    1. Isole o hWJCs de acordo com protocolos previamente publicados22. Brevemente, segmento cordões umbilicais em seções de 3 cm.
    2. Com cuidado faça uma incisão superficial com um bisturi longitudinalmente em cada segmento de cordão umbilical para desenrolar e expor a geleia de Wharton, do cordão umbilical. Use a pinça para remover os vasos sanguíneos.
    3. Lave o cordão umbilical segmentos duas vezes com suficiente PBS (por exemplo, 40 mL em uma placa de Petri de 60 mm) para submergir o tecido. Picar finamente segmentos de tecido com um bisturi. Digerir o tecido em uma placa de Petri com 50 mL de meio de digestão de 100mm (colagenase tipo 2 de 0,2%, 1% penicilina-estreptomicina, em baixo-glicose médio (DMEM modificado águia de Dulbecco)).
    4. Coloque o tecido em digerir médio em um agitador orbital a 50 rpm durante a noite em um 5% CO2, incubadora 37 ° C. No dia seguinte, diluir meio digestão na proporção de 01:16 em 2% antibiótico antimicótico em PBS, pelota e células por centrifugação a 500 x g à temperatura ambiente (~ 27 ° C) por 10 min. Discard sobrenadante.
    5. Resuspenda pelotas em Mesenchymal Stem Cell crescimento médio (MSCGM) e recombinar as células. Células de placa em uma densidade de 7 x 103 células/cm2 em cultura de tecidos trataram frascos de T-75. Cultura HWJCs em MSCGM e expandir a passagem 5 para experimentos.
      Nota: HWJCs pode ser sub cultivadas em T-frascos maiores (p. ex., T-150, T-300) quando a passagem para aumentar o rendimento de hWJCs para experimentos.

    4. infusão de hWJCs em Decellularized Cochleae

    1. Preparar cochleae decellularized
      1. Utilizando técnica asséptica, lave cochleae armazenado em 1X PBS três vezes para 30 min cada.
      2. Transferir cochleae em separado poços de uma placa de 24 e adicionar 1 mL de 37 ° C pré aquecido MSCGM.
      3. Incube cochleae em um 5% CO2, incubadora de cultura de célula de 37 ° C por um período mínimo de 1 h antes da infusão de células.
    2. Dissociar a hWJCs e ressuspender
      1. HWJCs de lavagem com 37 ° C pré aquecido 1X PBS duas vezes.
      2. Adicionar suficiente 37 ° C pré aquecido tripsina com 0,5% de EDTA para cobrir a superfície do vaso de célula.
      3. Incube a hWJCs para até 5 min em um 5% CO2, incubadora de cultura de células de 37 ° C.
        1. Verifique-se que 90% das células ter retirado a superfície de cultura de células exibindo células sob um microscópio invertido.
          Nota: As células que se movem quando o navio de cultura suavemente é aproveitado, tem destacado. As células que permanecem estacionárias, não ter destacado.
        2. Bata levemente os lados do balão para desalojar mais células anexadas.
      4. HWJCs transferência do navio cultura para um tubo cônico de 50 mL, contendo uma quantidade equivalente de MSCGM para o volume de tripsina utilizando técnica asséptica, usado para dissociar as células.
      5. O hWJCs de pelotas por centrifugação a 500 x g, à temperatura ambiente (~ 27 ° C) por 5 min.
      6. Aspire o sobrenadante e ressuspender o hWJCs em MSCGM em uma concentração de 500.000 células/mL.
    3. Perfundir cochleae
      1. Transferência cochleae para uma nova placa de 24 usando uma pipeta de transferência.
      2. Adicione uma gota de MSCGM para cada cóclea para impedir qualquer cóclea desseque.
      3. Delicadamente, Oriente a cóclea usando fórceps ultra fino, de modo que as janelas ovais e redondas estão virada para cima.
        Nota: Tenha muito cuidado ao manusear diretamente cada cóclea cóclea é facilmente marcado.
      4. Utilizando uma seringa de insulina estéril de 28,5 mm com tubos conectados, elaborar 0,2 mL resuspended hWJCs (100.000 células).
      5. Usando a pinça bem esterilizada, posicione tubulação sobre a janela oval.
      6. Delicada e lentamente perfundir a cóclea com 0,2 mL de ressuspensão hWJCs utilizando uma seringa de insulina 28,5 mm conectada à tubulação de polietileno (diâmetro exterior: 0,61 mm, diâmetro interno: 0,28 mm) ao longo de cerca de 5 min.
      7. Após a perfusão, adicionar 0,8 mL de 37 ° C pré aquecido MSCGM para o bem que contém a cóclea para trazer o volume total no poço de 1 mL.
      8. Repita as etapas 4.3.3-4.3.7 para cada cóclea, utilizando uma seringa de fresca e tubos cada vez.
      9. Lugar perfundidos cochleae em um 5% CO2, incubadora de cultura de células de 37 ° C e mudança mídia três vezes por semana.

    5. preservação e colheita de cóclea

    Nota: Cochleae podem ser cultivadas e colhidas em qualquer ponto do tempo de post-perfusão de até 30 dias.

    1. Para preservar os cochleae, corrigir em paraformaldeído 4% em 1X PBS durante a noite a 4 ° C, em uma plataforma de balanço.
    2. Após a fixação, lave cochleae com PBS 1x, três vezes por 5 min cada.
    3. Gradualmente, desidratar a cóclea com etanol e limpar com um solvente Hidrocarboneto alifático antes de incorporação em parafina.
    4. Secção de amostras a uma espessura de 10 µm usando um micrótomo e montar em vidro corrediças do microscópio.
      Nota: As amostras agora estão prontas para histológica ou imuno-histoquímica de processamento usando protocolos padrão.

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    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Usando os métodos apresentados aqui, sucesso decellularization de cochleae foi avaliado examinando-se a presença ou ausência de DNA através de 4', coloração 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Cochleae foram considerados totalmente decellularized, se o DNA não foi identificado dentro da cóclea decellularized. Uma cóclea nativa de uma experiência anterior que não passam por decellularization ou descalcificação foi usada como controle positivo para ilustrar as estruturas e células tradiciona...

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Temos com sucesso demonstrado que células cocleares nativas podem ser removidas da cóclea através de um processo de decellularization, que permite a utilização da cóclea como um andaime de tecido tridimensional, intrincado. Santi et al. 15 desenvolveu o método inicial para decellularizing cochleae e estimaram com precisão os volumes de muitas estruturas cocleares através com o auxílio de microscopia de luz folha23. Tal trabalho inicial serviu como uma base forte pa...

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    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Os autores não têm nada para divulgar.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    O projeto atual foi financiado pela Universidade de Kansas prova de conceito de fundo. Gostaríamos de agradecer a equipe de enfermagem no KUMC (Kansas City, KS) para nos auxiliar na obtenção de humanos cordões umbilicais e David Jorgensen para ajudar com culturas cochleae.

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Centrífuga Allegra X-14RBeckman-CoulterB08861
    Tubulação Semi-Rígida IntramédicaBecton Dickinson427401
    New Brunswick Innova 2000 Orbital ShalerEppendorfM1190-0002
    Tesoura CirúrgicaFerramentas de Ciência Fina14060-10
    Pinça FinaFerramentas de Ciência Fina11370-40
    Pinça Ultra-FinaFerramentas de Ciência Fina18155-13
    Tubos Cônicos de 50 mLFisher Scientific12565271
    Placa de PetriFisher ScientificFB087579B
    Seringa de Insulina U-100Fisher Scientific14-829-1B
    Frasco de Cintilação FisherScientific03-341-73
    RotatorFisher Scientific88-861-049
    Pipeta de TransferênciaFisher Scientific22-170-404
    Lâmina de BarbearFisher Scientific12-640
    Antibiótico-AntimicóticoFisher Scientific15-240-062
    Penicilina-EstreptomicinaFisher Scientific15-140-122
    Placade 24 PoçosLâminas07-200-84
    Pipeta de Transferência Fisher Scientific12-550-15
    Fisher Scientific22-170-404
    ProLong Gold Antifade Mountant com DAPIFisher ScientificP36935
    Clear-Rite 3Fisher Scientific22-046341
    Incubadora de CO2 Thermo Scientific Forma Series II 3110Fisher Scientific13-998-078
    Meio de Crescimento de Células-Tronco MesenquimaisLonzaPT-3001
    Tripsina-EDTALonzaCC-3232
    TPP T-75 Frasco de CulturaMidSciTP90076
    TPP T-150 Frasco de CulturaMidSciTP90151
    TPP T-300 Frasco de Cultura MidSciTP90301
    Microscópio de DissecçãoNikon InstrumentsSMZ800
    Nikon Eclipse Ts2R-FL Microscópio InvertidoNikon InstrumentsMFA51010
    NuAire Classe II, Tipo A2 Gabinete de BiossegurançaNuAireNU-425-600
    1X PBSSigma-AldrichP5368-10PAK
    Solução SDS 1%Sigma-Aldrich436143-100G
    10% EDTASigma-AldrichE9884-100G
    de Microscópio de Vidro SuperFrost PLUS da Fisher Scientific

    References

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