Artigo de método

Síntese e avaliação de um inibidor de absorção de cálcio mitocondrial rutênio-baseado

DOI:

10.3791/56527

⸱

26 de outubro de 2017

 , 
1Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um protocolo para a síntese, purificação e caracterização de um inibidor de rutênio-baseado da absorção de cálcio mitocondrial é apresentado. Um procedimento para avaliar a sua eficácia em células de mamíferos permeabilized é demonstrado.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Detalhamos a síntese e purificação de um inibidor de absorção cálcio mitocondrial,5 +[(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]. A síntese otimizada deste composto começa de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 em 1 M NH4OH em um recipiente fechado, produzindo uma solução verde. Purificação é realizada com a cromatografia de permuta catiónica. Este composto é caracterizado e verificado ser puro por espectroscopia UV-vis e IR. As propriedades inibitório de absorção de cálcio mitocondrial são avaliadas em pilhas HeLa permeabilized por espectroscopia de fluorescência.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cálcio mitocondrial é um regulador chave para um número de processos que são críticos para a função celular normal, incluindo apoptose e produção de energia. 1 , 2 , 3 o uniporter cálcio mitocondrial (MCU), uma proteína de transporte de íon que reside na membrana mitocondrial interna, regula o influxo de íons cálcio na mitocôndria. 4 , 5 , 6 químicos inibidores do MCU são ferramentas valiosas para continuar os esforços para estudar a função e funções celulares deste transporte de proteína e cálcio mitocondrial. O composto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, é um dos único conhecidos inibidores seletivos para o MCU com um valor ded K relatado de 24 µM.7 ,8,9,10 , este complexo é uma impureza comum encontrada em comerciais formulações de rutênio vermelho (RuRed), um triruthenium di-µ-oxo em ponte hexacation da fórmula [(NH3) 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, que também tem sido usado como um inibidor de absorção de cálcio. Embora Ru360 seja disponível comercialmente, é muito caro. Além disso, a síntese e isolamento de Ru360 é desafiado por processos de purificação difícil e métodos de caracterização ambíguo.

Recentemente informamos procedimentos alternativos para acessar um Ru360 análogo, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 este composto inibe a MCU com alta afinidade, semelhante ao Ru360. Neste protocolo, descreveremos nossa mais eficaz síntese deste composto, que se inicia a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificação do produto usando resina permutadora de catiões fortemente ácida é detalhada, juntamente com armadilhas comuns para este procedimento. Podemos também apresentar métodos para caracterização e avaliação da pureza de compostos e delinear uma abordagem simples para testar a sua eficácia em bloquear a absorção de cálcio mitocondrial.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nota: ácidos concentrados e bases são usadas nesta síntese. Usar todas as práticas de segurança adequadas ao realizar a reação, incluindo o uso de controles de engenharia (coifa) e equipamentos de proteção individual (EPI) incluindo óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida e sapatos fechados.

1. preparação de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5

  1. síntese de [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12
    1. dissolver 1,00 g de RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru por peso, 4,1 mmol) em 5 mL de H 2 Cool O. a solução de marrom escura a 0 ° C em banho de gelo. Adicione 11 mL (0,23 mol) da solução de hidrato de hidrazina 80% de forma gota a gota. A reação inicial será vigorosa com o gás de evolução, resultando em uma solução de marrom. Deixe a solução resultante agitar à temperatura de 16 h; a solução final será vermelho escuro
      Cuidado: Hidrazina é extremamente tóxico e cancerígeno. Além disso, formas anidra estes reagentes são explosivas. Como sempre, use capuzes PPE e emanações apropriados ao manusear. Não se concentrar essas soluções à secura.
    2. a esta solução, adicionar cerca de 5-10 mL de HCl concentrado para ajustar o pH a 2. Neste ponto, a solução será amarelo-marrom na cor.
    3. Calor esta solução a 105 ° C, agitando para 1-2 h. Um sólido amarelo irá precipitar fora da solução. Quando não mais visivelmente precipitar formas, retire do fogo.
    4. Permitir a mistura de reação para arrefecer à temperatura ambiente e em seguida, coloque em banho de gelo a 0 ° C por 10 min. recolher o sólido amarelo por vácuo filtração e lavagem com 5 mL de etanol e éter dietílico.
    5. Dissolver completamente o produto bruto em 15-25 mL de água quente. Fica frio 10 mL de uma solução de HCl concentrada em um frasco de filtro, colocando-o em um banho de gelo. Filtre a solução amarela para a solução de HCl refrigerada para induzir a precipitação de um sólido puro amarelo pálido. Esse precipitado de filtrar e lavar com 5 mL de HCl 0,5 M, etanol e éter.
    6. Caracterizar o composto usando espectroscopia de IR. Verificar a pureza pela identificação de alongamento as frequências de 3226 cm -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1 e 801 cm -1. Uma impureza comum menor em 2069 cm -1 é atribuída ao [Ru (NH 3) 5 N. 2] Cl 3.
  2. Síntese de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
    1. dissolver 100 mg (0,34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 em 50 mL de 1 M NH 4 OH em uma embarcação de pressão redondo de parede pesados de 200 mL. Vagamente tampar o frasco com uma rolha e aquecer a mistura de reação a 75 ° C, durante 6 h. Retire do fogo e misture à temperatura ambiente durante 4 dias produzir uma solução verde escura.
      Cuidado! Um resultado de recipiente selado em um acúmulo de pressão de aquecimento. Certifique-se de usar produtos vidreiros de pressão-seguro apropriado. Para esta reação, a finalidade de selar o recipiente é minimizar a perda de gases NH 3. Portanto, coloque a rolha frouxamente para permitir a liberação do excesso de pressão.
  3. Purificação por cromatografia de permuta catiónica
    1. em uma proveta de 25 mL, suspender resina permutadora de catiões de 5 g (por exemplo, malha Dowex 50WX2 200-400 (formulário H +) em 10 mL de 0.1 M HCl.
    2. Carregar este chorume em uma coluna de 10 mL (10 mm de diâmetro, 15 cm de altura) afixado com um reservatório de solvente de 50 mL. Lave a resina com cerca de 20-30 mL de 0.1 M HCl, até que o eluído esteja incolor.
    3. Voltar para a solução de verde de reação isolada na etapa 1.2.1. Para esta solução, adicionar HCl concentrado para ajustar o pH a 2, no ponto em que a cor da solução muda para marrom.
    4. Carregar esta solução acidificada à coluna de resina permutadora de catiões, preparada na etapa 1.3.2 pipetando suavemente em cima da resina. Deixe o eluato completamente escorra e continuar a carregar a solução. Repita este processo até que toda a solução foi adicionada. O topo da resina será castanho escuro/preto. A resina irá diminuir volume ligeiramente.
    5. , Grânulos de vidro de uso para cobrir o topo da resina. Estas impedirá a resina de ser incomodado quando novas soluções são adicionadas.
    6. Eluir a coluna com 20 mL de 1 HCl, M.
    7. Eluir a coluna com uma maior concentração de HCl de 1,5 M (≈ 50 mL). Uma solução amarela começará a sair da coluna. Aumentar a concentração de HCl a 2 M e continuar até o eluato é incolor de eluição ou um verde-amarelo muito pálido. Um volume total de 150-200 mL serão necessário para este processo.
    8. Aumentar a concentração de HCl a 2,5 M (20-50 mL). Recolha o eluato em fracções em tubos de ensaio. Aumentar para 3 M HCl. O produto vai eluir da coluna como uma solução verde-marrom. Uma fração de vermelho-marrom também pode começar a sair da coluna. Como estas frações são impurezas oxidadas rutênio vermelho, não da piscina com as frações de verde-marrom.
  4. Caracterização e verificação de pureza de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
    1. testar todas as frações de Passo 1.3.8. por espectroscopia UV-vis. Para realizar essa tarefa, adicionar 100 µ l de uma fração dada em 2 mL de 3 M de NH3 e analisar por espectroscopia UV-vis. Frações que contêm o produto puro terá uma banda grande absorvância a 360 nm e uma absorvância menos intensa em 600 nm. Absorvância a 480 ou 533 nm é indicativa de oxidado rutênio vermelho e impurezas de rutênio vermelho, respectivamente.
    2. Piscina frações contendo o produto puro e evaporar a solução para o ressecamento por evaporação rotativa. O produto será isolado como um sólido verde-marrom. Rendimentos são tipicamente da ordem de 5-15 mg (10-20% de rendimento). Single-cristais, apropriados para difração de raios x, podem ser obtidas através da difusão de vapor de etanol em solução aquosa do composto.
    3. Para verificar a pureza, analisar o composto por espectroscopia UV-vis em uma solução de pH 7,4 fosfato salino (PBS). Pureza pode ser avaliada tendo a relação de intensidade do 360 nm e 600 nm de picos. Esta proporção é 31 para um composto puro. Para compostos impuros, a proporção será menor.
    4. Analisar a amostra no estado sólido por espectroscopia de IR. Bandas de diagnósticos estão no 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 cm -1 e 815 cm -1. Bandas de impureza comum são vistas em 1762 cm -1 e 1400 cm -1, característico de NH 4 vermelho de rutênio CL pode ser identificado por bandas em 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 e 800 cm -1.
  5. Avaliação da inibição de absorção de cálcio mitocondrial por espectroscopia de fluorescência
    cuidado! Os procedimentos a seguir usam células de mamíferos. Trabalho deve ser efectuado em capas de adequado fluxo laminar que são certificadas para a segurança biológica de nível 2 (BSL2) pesquisa.
    ​ Nota: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (µ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 será referido como [Ru] nesta seção
    1. fazer buffer glicose contendo solução salina (BGSS) como a mídia de ensaio. BGSS é uma solução composta por 110 mM KCl, 1mm KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, ácido de-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic de 20 mM 4 (HEPES), succinato de sódio de 5 mM, 30 µM glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA). Combinam com tudo, exceto o EGTA, ajustar o pH para 7,4. Adicionar EGTA e reajustar o pH para 7,4. Para 50 mL de mídia de ensaio, adicionar 0,5 mL de glicose 1 mg/mL.
    2. Células HeLa cultura em 500 cm 2 placas de Petri em Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% soro bovino fetal (FBS) numa incubadora umidificado com 5% CO 2 a 37 ° C. amplificar as células HeLa crescendo em uma placa de Petri de 100mm por semeadura -os em um prato de petri de 2 500 cm. O volume total de mídia no prato grande é 115 mL. Cada prato grande produzirá cerca de 18 milhões células, suficiente para dois experimentos de espectroscopia de fluorescência.
      1. Crescer as células até atingirem 90-95% Confluencia. Remova a mídia e lave as células com PBS pH 7,4 de 15 mL. Adicionar 15 mL de ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS e incubar durante 10 min separar as células. Transferir as células para 14 mL redonda Falcão tubos
    3. contar células usando trypan azul e um hemocytometer com um microscópio invertido e calcular o número total de células e o volume dos meios necessários para atingir 7,5 milhões de células por volume de 1,8 mL do meio. Centrifugar as células durante 10 minutos a 5310 × g. decantar o sobrenadante e adicionar o volume calculado de BGSS. Ressuspender as células suavemente.
      1. Para este ensaio, preparar soluções estoque de digitonin de 40 mM em dimetilsulfóxido (DMSO), 1mm verde de cálcio-5N em H 2 O e 10 mM CaCl 2 em H 2 O. [Ru] Soluções conservadas em estoque, preparadas em água pura, pode variar de 1 a 3 mM.
        ​ Nota: cálcio Green-5N é sensível à luz. Armazenar no escuro e minimizar a exposição à luz.
    4. Configurar o fluorímetro para excitar a 506 nm e leitura das emissões em 532 nm com a cubeta do titular controlada em 37 ° C. Prepare uma cubeta do acrílica com uma barra de agitação ou roda, suspensão de células de 1,8 mL de 1.5.2 acima, 1,8 µ l digitonin de solução, 3.6 & #181; L cálcio Green-5N (solução) e 9 µ l [Ru] (para solução estoque de 1 mM, concentração final de 5 µM). Incube as células durante 15 min no fluorímetro.
      1. Ler os dados como a relação de excitação/emissão, em vez da absorção bruta. Esta prática minimiza os erros associados com as flutuações da intensidade da fonte de luz.
      2. Análise da primeira amostra na ausência de [Ru] para medir o efeito da adição de CaCl 2 sobre a resposta das células.
      3. Begin análise sobre o fluorímetro com as configurações descritas na 1.5.4. Espere aproximadamente 2 minutos para estabelecer uma base estável de emissão e em seguida, adicionar 1,8 µ l de CaCl 2 (concentração final de 10 µM). A intensidade de emissão vai aumentar imediatamente após a adição do CaCl 2 e então irá decair ao longo dos minutos como os íons cálcio entram na mitocôndria. Esperar até que tenha terminado a decadência (≈ 5 min). Adicionar bolus de cálcio adicional para determinar a resposta de absorção de cálcio mitocondrial das células não tratadas com [Ru].
    5. Em uma outra cubeta contendo 5 µM [Ru], repetir a experiência, como descrito acima em 1.5.4.3. Na presença do inibidor, intensidade de emissão vai aumentar, mas não decadência. Esta observação significa que bloqueou a absorção de cálcio mitocondrial.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este método descreve uma síntese do cálcio mitocondrial absorção inibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, um matérias-primas ruthenium(III) conhecidos. [Ru (NH3)5Cl] CL2 caracteriza-se por espectroscopia de IR, com modos vibracionais em 3200 cm-1, cm 1608-1, 1298 cm-1e 798 cm...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O cálcio mitocondrial absorção inibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 pode ser sintetizada de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, um ruthenium(III) bem conhecido começando o material, conforme descrito neste procedimento. A síntese de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 é facilmente alcançada com pouca dificuldade. Após agitação RuCl3 para 16 h na hidrazina hidrato, o pH da solução deve ser a...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada pela Universidade de Cornell. Este trabalho fez uso do centro Cornell para materiais compartilhados instalações de pesquisa, que são suportados pelo programa NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconhece apoio por uma bolsa de pesquisa da pós-graduação NSF (Grant DGE - 1650441) e Dr. Dave Holowka para assistência com os experimentos de cálcio. Qualquer opinião, conclusões e conclusões ou recomendações expressadas neste material são as dos autores (s) e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Hidrato de tricloreto de rutênioPressão Química3750
Ácido clorídrico concentradoJ.T. Baker9535
Hidróxido de amônio concentradoMallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 MeshAlfa Aesar13945
Cálcio Verde 5NInvitrogenC3737
DigitoninAldrich260746
DMSOAldrich471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
Succinato de SódioAlfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
GlicoseAldrichG5000
200 Balão de fundo redondoChemGlassCG-1506-14
Rolha de vidroChemGlassCG-3000-05
Coluna de vidro de 10 mm x 15 cm com reservatóriosPersonalizado - semelhante às colunas ChemglassSemelhante a CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
Tubos Falcon de fundo redondoFisher Scientific14-959-11B 
Placas de Petri de 500 cm2Corning431110
Trypan bluede 15250061Científico ThermoFisher
AldrichZ359629
Cuvetes de AcrílicoVWR 58017-875
Espectrômetro UV-VisAgilent Modelo Cary 8454 
EspectrofluorímetroSLM Modelo 8100C
Espectrômetro IRBruker Hyprion FTIR com anexo
CentrífugaALC Modelo PM140R
Microscópio de luz invertidaVWR 89404-462
Hemacitômetro ATR

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
  3. Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
  4. De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
  5. Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
  6. Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
  7. Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).
  8. Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
  9. Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
  10. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  11. Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
  12. Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
  13. Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
  14. Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

An logo de Rut nio 360Cromatografia de Troca Cati nicaEspectroscopia UV VisEspectroscopia de IVEspectroscopia de Fluoresc nciaC lulas HeLa PermeabilizadasImpurezas de Rut nio MarromFra es Verde MarromS ntese com Hidr xido de Am nio

Artigos relacionados