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Artigo de método

Um modelo murino de gastrectomia de manga Vertical

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DOI:

10.3791/56534

⸱

18 de dezembro de 2017

 , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

Neste artigo

Resumo

A seguir descreve o desempenho de gastrectomia de manga vertical em camundongos. Este é um tipo de cirurgia de perda de peso que envolve a remoção de aproximadamente 70% do estômago.

Resumo

Cirurgia bariátrica, como gastrectomia de manga vertical (VSG), é uma cirurgia do tracto gastrointestinal é executada com a finalidade de perda de peso. Cirurgia bariátrica é atualmente o tratamento mais eficaz a longo prazo para a obesidade. Além de perda de peso, cirurgia bariátrica produz benefícios adicionais de saúde como remissão do diabetes tipo 2, remissão de hipertensão e diminuiu o risco de desenvolver certos tipos de câncer. Os mecanismos, além da perda de peso, para estes benefícios permanecem incompletamente definidos. Portanto, os modelos animais de cirurgia bariátrica estão sendo desenvolvidos e validados para identificar os mecanismos, levando a estes benefícios, com o objetivo de melhorar a compreensão da fisiologia gastrointestinal e identificação de novos alvos terapêuticos. VSG, tornou-se o procedimento mais comumente realizado bariátrico na clínica nos Estados Unidos porque é altamente eficaz em produzir perda de peso e melhoria metabólica e é simples de realizar do que outros procedimentos bariátricos. Portanto, temos desenvolvido e validado um modelo murino de VSG. Este modelo murino de VSG recapitula a muitos dos efeitos da VSG nos seres humanos, incluindo o Regulamento melhorado de glicose e pressão arterial. O método baseia-se no isolamento do estômago, ligadura dos vasos gástricos e remoção de 70% do estômago por cruza ao longo da curvatura maior do estômago. Nós bem sucedida deste protocolo cirúrgico para várias linhas de rato geneticamente modificado para definir os contribuintes mecanicistas para os benefícios de VSG. Além disso, este modelo murino de VSG foi combinado com outras técnicas cirúrgicas, para alcançar a visão mecanicista mais profunda. Portanto, este é um modelo simples e versátil para estudar fisiologia gastrointestinal e os benefícios de saúde de cirurgia bariátrica.

Introdução

Como a epidemia de obesidade continua a crescer em todo o mundo cirurgia bariátrica ganhou popularidade como é o tratamento mais eficaz a longo prazo para obesidade1. Infelizmente, perda de peso dieta e exercício é difícil de alcançar e relativamente ineficaz sobre o longo prazo2,3. Cirurgia bariátrica, como gastrectomia de manga vertical (VSG), é definida como a manipulação do trato gastrintestinal com a finalidade de1,de perda de peso4. Embora a perda de peso é um resultado proeminente da cirurgia bariátrica, cirurgia bariátrica oferece outros benefícios de saúde como melhorar comorbidades da obesidade e estender a vida útil de5. Por exemplo, a cirurgia bariátrica resulta em altas taxas de remissão do diabetes tipo 2 e hipertensão e redução do risco de vida do desenvolvimento de certos tipos de câncer,1,6,7. Digno de nota, o efeito da cirurgia bariátrica causando remissão da diabetes tipo 2 e hipertensão é frequentemente observado logo após a cirurgia e antes da perda de peso8,9. Isso realça o conceito de que existem mecanismos independentes do peso corporal, contribuindo para os benefícios de saúde observados após a cirurgia. Modelos animais de cirurgia bariátrica têm sido desenvolvidos e são utilizados para estudar os mecanismos pelos quais estes benefícios de saúde ocorrem de11,10,12.

Podemos ter validado um modelo do rato da VSG, que temos aplicado aos vários modelos de rato geneticamente modificado para estudar os mecanismos pelos quais a cirurgia bariátrica melhora comorbidades da obesidade como diabetes tipo 2, hipertensão e câncer colorretal10 , 11 , 12. modelos de roedores permitem controle mais experimental e a capacidade para executar a manipulação genética ou farmacêutica para definir o papel de genes específicos ou sinalização de percursos turísticos. Estamos focando principalmente VSG porque VSG é o procedimento mais comumente realizado bariátrico na clínica no Estados Unidos13. Além disso, o VSG é um modelo cirúrgico simples, com poucas modificações anatômicas em comparação com outros procedimentos como Roux-en-Y gastric bypass ou biliopancreatic desvio.

Nosso modelo de rato da VSG recapitula os seguintes efeitos da cirurgia bariátrica, observados em humanos: perda de peso, ingestão de alimentos reduzida, regulamento de glicose melhorou, melhorou a função ilhéu, aumento da secreção pós-prandial glucagon-como peptide-1 (GLP-1), redução da pressão arterial e aumento circulante ácidos biliares concentrações10,11,12,13,14,15. Portanto, este é um modelo ideal para estudar os corpo peso dependentes e independentes mecanismos pelo qual VSG melhora ou resolve comorbidades da obesidade. Além disso, é um modelo confiável que pode ser combinado com outros procedimentos cirúrgicos, permitindo a investigação do impacto da VSG sob várias condições de doença com maior visão mecanicista12.

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Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso e Cornell University institucional Cuidado Animal.

1. pré-cirúrgica preparação

Nota: Os ratos do estudo são tipicamente em um C57BL induzida por dieta obeso fundo fazer estudos translationally relevantes a obesidade humana e resistência à insulina. Ratos machos e fêmeas podem ser estudados, conforme descrito nas etapas subsequentes.

  1. Com uma idade de 2 meses, coloque os ratos em uma dieta de gordura alta 45% ou 60% por 2 meses (ver Tabela de materiais).
    Nota: Os ratos são alimentados uma dieta de alta gordura para criar um fenótipo resistente à insulino e obeso. Períodos mais curtos ou mais longos de alta gordura dieta alimentar podem ser utilizados dependendo os objetivos do estudo.
  2. Continuar a alimentar os ratos ad libitum até cirurgia. Se são necessárias medições de base, depois de 7 semanas de alto teor de gordura da dieta alimentar, rápido ratos para 6 h ou durante a noite e tirar uma amostra de sangue da linha de base para a medição de metabólitos de interesse (por exemplo, glicose).
  3. Continue a permitam ratos uma semana para se recuperar após a coleta de sangue antes da cirurgia de farsa ou VSG e dieta de ratos no alto teor de gordura. Coloque os ratos em um líquido (veja a Tabela de materiais) da dieta por 4 dias antes da cirurgia.
    Nota: Os ratos são mantidos em uma dieta líquida antes e após a cirurgia para limpar o aparelho digestivo das partículas que podem afectar a resposta curativa.
  4. Esterilizar os itens a seguir antes da cirurgia: folha, gaze, algodão com ponta aplicadores (CTAs) e instrumentos cirúrgicos (pinça, tesoura, tesoura de íris, pinça de dumont, de funcionamento serrilhada pinça Adson-Brown, agulha de gavagem, motorista de microneedle, tesoura de mola ).

2. vertical Sleeve gastrectomia e procedimentos de Souza

  1. No dia da cirurgia pesar ratos para obter uma medida de peso de referência.
  2. Equipe a sala cirúrgica com uma almofada de aquecimento, banho de água aquecida e sistema de anestesia. Conjunto banho-maria a 37 ° c e usá-lo para aquecer a solução salina 0,9% para a irrigação. Limpe o campo cirúrgico com 70% de etanol e utilizar técnica asséptica para abrir ferramentas e cirurgia autoclavado pack.
    Nota: A almofada de aquecimento é usada para manter o animal aquecido durante a cirurgia e a recuperação da anestesia.
  3. Utilizando uma câmara de indução, anestesia o mouse com 5% de isoflurano e O2 vazão de 1 L/min. Confirme se o mouse está no plano adequado de anestesia, realizando uma pitada de dedo do pé. Manter o mouse com isoflurano 1-3% e uma taxa de fluxo de2 O de 0,6 L/min, uma vez que um plano consistente de anestesia foi alcançado.
  4. Uma vez que o mouse é anestesiado, colocar pomada (ver tabela de materiais) em seus olhos para mantê-los húmida durante a cirurgia. Neste momento também administrar um analgésico, como o meloxicam (2 mg/kg por via subcutânea). Corte o cabelo a partir do umbigo para a axila, mantendo a pele suavemente para fornecer a tensão.
    1. Como pele do mouse é fina e delicada, tome cuidado para não causar lesões na pele quando cortar o cabelo. Limpe a pele com iodo-povidona e álcool.
    2. Use luvas estéreis e prepare o campo cirúrgico estéril e instrumentos. Execute o resto do procedimento utilizando uma técnica estéril. Prepare o campo cirúrgico estéril, colocando cortinas cirúrgicas estéril em ambos os lados do rato. Use folha de estanho autoclavada para criar um pano cirúrgico para o mouse.
    3. Corte um pequeno buraco na folha de estanho para permitir acesso ao abdômen do rato.
  5. Fazer uma incisão da pele do abdômen médio (umbigo) ao nível da cartilagem xifoide usando uma tesoura de íris. Identificar o linea alba e uso íris tesoura para cortar através da parede do corpo ao longo da linea alba. Use CTAs para elevar suavemente o estômago fora do abdômen e então sem rodeios dissecar o omento maior fora da curvatura maior do estômago.
  6. Ligam as artérias gástricas curtas que se estende entre o fundo do estômago e do baço, colocando duas ligaduras usando sutura de monofilamento de 7-0. Use tesoura de mola para cortar entre as duas ligaduras. Uma vez que a artéria é transecção, totalmente exteriorize o estômago da cavidade abdominal. Coloque gaze sob o estômago e molhado com soro fisiológico para manter o tecido úmido.
  7. Procedimento de Souza
    1. Para o procedimento de Souza, coloque um padrão contínuo simples solto da sutura usando sutura de monofilamento de 6-0 com uma agulha cónica. Começa com 2 mm para a direita (direito do cirurgião) do esôfago. Coloque a linha de sutura ao longo da parede gástrica ventral e em seguida, continuar ao longo da parede gástrica dorsal.
      Nota: Para todas as manipulações gástricas, use apenas a sutura absorvível monofilamento para diminuir o risco de infecção. Além disso, use apenas a sutura com uma agulha cónica para todas as manipulações gástricas, como o uso de uma agulha de corte aumenta o risco de sutura "puxar-através de" levando a danos no tecido gástrico e deiscência.
    2. Passe a agulha completamente através de uma parede gástrica ao colocar a sutura. Certifique-se a sutura está deitado, mas não restringindo o estômago. Delicadamente, amarrar a sutura fora de usar lances de 3-4 e pule para o passo 2.9.
    3. Para o procedimento VSG pular etapa 2.7 e prossiga com a etapa 2.8.
  8. Procedimento VSG
    1. Para o procedimento VSG, ligate proeminentes ramos da artéria gástrica e veia com sutura de monofilamento com uma agulha cónica usando 3 lança para cada nó de 7-0. Coloque as ligaduras logo abaixo (ou seja, em direção a curvatura menor do estômago) a linha pretendida de transecção.
      Nota: A linha pretendida de transecção começa em ~ 2 mm acima (ou seja, no sentido da curvatura maior do estômago) o entalhe cardíaco do estômago e pelo menos 2 mm abaixo do pilcatus de margo e estende-se até a extremidade proximal do lobo direito do pâncreas. Normalmente, existem 4 vasos por parede gástrica que precisam ser ligados; no entanto, pode variar entre ratos.
    2. Para evitar o derrame do conteúdo gástrico durante a gastrectomia, coloque uma linha simples contínua da sutura passando por ambas as paredes gástricas apenas abaixo da linha pretendida de transecção usando sutura de monofilamento de 6-0 com uma agulha cónica. Começa a linha de sutura para a direita do cirurgião do esôfago e abaixo a margo pilcatus e final logo acima do pâncreas.
    3. Coloque a ponta fina hemostatos acima da linha de sutura e use tesoura de mola para cortar entre a linha de sutura e hemostatos. Remova o tecido gástrico necrosante do campo cirúrgico estéril.
Use CTAs para limpar o sangue e digesta fora do estômago.
  • Reforça a aposição das paredes gástricas usando sutura de monofilamento de 6-0 com uma agulha cónica usando um simples padrão descontínuo.
    Nota: Um padrão simples sutura descontínua é recomendado já que este fornece o fechamento mais seguro do que o padrão de sutura contínua simples.
  • Irrigue o remanescente gástrico com soro fisiológico durante o procedimento a fim de manter o tecido úmido e limpo. Use uma agulha de gavagem 20g anexada a uma seringa de 20 mL para realizar lavagem gástrica com soro fisiológico. Use este tamanho para garantir a pressão adequada é fornecida sem o risco de danos no tecido gástrico de pressão excessiva ou danos acidentais tecido gástrico do uso de uma agulha pontiaguda regular.
  • Use um mínimo de 20 nós para fechar firmemente o estômago; Preste atenção ao encerramento ao longo do lado do esôfago, como deste lado é mais difícil de acessar e, portanto, muitas vezes é um site de deiscência.
  • Certifique-se de que não existem fugas pressionando suavemente sobre o estômago com CTAs. Se vazamentos são identificados, coloque knots descontínuos simples adicionais sobre as áreas de vazamento e em seguida vazar o teste novamente. Teste de vazamento até que nenhum vazamento é detectado.
  • Fazer uma lavagem completa final do estômago usando pelo menos 60 mL de solução salina para garantir que não há partículas infecciosas tem sido deixada para trás.
  • Coloque o estômago volta na cavidade abdominal sob o fígado usando um CTA. Coloque CTAs ao longo do aspecto dorsal da cavidade abdominal para absorver todos os fluidos em excesso. Usando uma agulha 18G, injete solução de Ringer lactato (RL) com ou sem antibióticos (0,5 mL LRS + /-20 mg/kg de enrofloxacina) diretamente na cavidade abdominal, pouco antes do encerramento.
    Nota: Isto substitui experientes durante a cirurgia de perda de fluido e fornece um método para a aplicação direta de antibióticos para o sítio cirúrgico ajudar com a recuperação.
  • Feche a camada muscular abdominal usando sutura de monofilamento de 6-0 com uma agulha cónica em um simples padrão descontínuo. Em seguida, feche a camada de pele com sutura absorvível do monofilamento de 6-0 em um padrão contínuo simples.
  • Coloque o adesivo de tecido sobre a pele e dobre a pele sobre a linha de sutura para enterrar a sutura para que o mouse não pode interromper o fechamento da ferida no período pós-operatório.
  • Desligue o isoflurano e deixe o mouse recuperar na rampa de aquecimento para 10-15 minbefore devolvê-lo à sua gaiola em casa. Não deixe o animal autônoma até que recuperou a consciência e é capaz de se mover.
  • Manter os animais alojados individualmente até totalmente recuperado de uma cirurgia.
    Nota: Se medições de ingestão de alimentos precisos são obtidos ao longo do estudo, os ratos devem continuar a ser alojados individualmente ao longo do estudo. Há um risco de obstrução de corpo estranho de roupa de cama de gaiola em casa a comer. Os animais devem ser alojados em gaiolas sem fundamento, exceto o material para fornecer enriquecimento de nidificação (ver Tabela de materiais).

    • 3. pós-operatório Mouse cuidados e medidas

    1. Retorne o mouse para sua gaiola em casa e coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento. Manter os ratos em uma dieta líquida pelo menos 7 dias após a cirurgia. Administrar um analgésico, como o meloxicam (2 mg/kg por via subcutânea), por 2 dias após a cirurgia.
      Nota: Um antibiótico, como enrofloxacina (20 mg/kg), pode ser dada por até 7 dias após a cirurgia. Antibióticos são dadas para minimizar o risco de infecção pelo procedimento cirúrgico e podem ou podem não ser necessários, dependendo do nível de esterilidade, mantida durante todo o procedimento. No entanto, se os antibióticos são usados, eles devem ser administrados a ratos todas no mesmo estudo para manter a consistência.
    2. Durante o período pós-operatório avalie o peso corporal, ingestão de alimentos, defecação, nível de atividade e disposição pelo menos diariamente para garantir cura adequada e recuperação. Conduta de acompanhamento pós-operatório durante 14 dias após a cirurgia.
      Nota: Falha cirúrgica é normalmente vista ou imediatamente após a cirurgia, ou no prazo de três dias pós-operatório. Animais que não estão comendo ou bebendo no segundo dia após a cirurgia devem ser acompanhados por complicações cirúrgicas.
    3. Após a conclusão bem-sucedida do período pós-operatório, medir a ingestão de comida e peso de corpo regularmente ao longo do estudo para garantir a manutenção do fenótipo adequado.
    4. Executar um teste de tolerância de glicose oral (OGTT) para avaliar a tolerância à glicose, a secreção de insulina glicose-estimulada e intestino a secreção de hormônio.
      1. Executar o OGTT em ratos após jejum por 6 h e, em seguida, os ratos gavage com solução de glicose 50% com uma dose de 1g/kg.
      2. Colete amostras de sangue de cauda em 0, 2,5, 5, 15, 30, 60 e 120 minutos após a intubação. Medir a glicose no sangue com um glicosímetro para estes pontos de tempo. Colete amostras de soro em cada ponto de tempo para a medição de vários hormônios, como insulina e GLP-1.
      3. Camundongos rápidos para 6 h antes da eutanásia. Tome uma medida de amostra e glicose de sangue final. Compare a medição final de glicose para a medição de referência. Eutanásia em ratos com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital em uma dose de 200 mg/kg.
      4. Use a linha de base e as amostras de soro final para medir analitos adicionais e comparar valores cirúrgicos pré e pós-operatório.

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    Resultados

    A farsa e VSG procedimentos são descritos na Figura 1. A figura 1A mostra onde a linha de sutura é colocada ao longo das paredes gástricas durante o procedimento de Souza. Nesta mesma área é onde o estômago é cortado durante a cirurgia VSG. A figura 1B mostra o remanescente tubular de estômago esquerda após realização de VSG.

    Estatí...

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    Discussão

    Cirurgia bariátrica é o tratamento mais eficaz a longo prazo para a obesidade e resulta em outros benefícios de saúde, tais como taxas elevadas de tipo 2 diabetes e hipertensão remissão1,9,15. Modelos de murino de cirurgia bariátrica fornecem uma poderosa ferramenta para a identificar os mecanismos pelos quais cirurgia bariátrica provoca melhorias rápidas e pronunciadas em comorbidades da obesidade. Além disso, modelos murino de...

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    Divulgações

    Os autores declaram não há conflitos de interesses, exceto Dr. Cummings recebeu financiamento da Eli Lilly e Company.

    Agradecimentos

    Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH/ICN R21CA195002-01A1, Conselho o Presidente das mulheres de Cornell e da SUNY pós-graduação diversidade comunhão. Laboratório da Dr. Cummings também recebido financiamento durante o período do projeto de Cornell programa de treinamento de biologia comparativa de câncer e Eli Lilly e Company.

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Dieta rica em gordura com 45%Dietas de pesquisaD12451
    Dieta rica em gordura 60%Dietas de pesquisaD12492
    BoostNestlé160-67538sabor rico de chocolate
    6-0 SuturaEthiconZ432monofilamento absorvível/cônico
    7-0 SuturaCovidien8866127-01monofilamento absorvível/cônico
    Cotonetesde algodão Fisherbrand23-400-118pequenos
    cotonetesFisherbrand233-400-101gaze grande
    Vários4x4 4 camadas e 2x2 4 camadas
    Folha
    cortinas cirúrgicasVários
    0,9% solução salinaVários
    LRSHospira170RX
    BetadineVários
    ÁlcoolVárias
    Pomada para os OlhosParalube® Pomada Veterinária17033-211-38
    Adesivo de TecidoVetbond1469SB
    Meloxicam (Metacam)Boehringer Ingelheim141-2135 mg/ml
    EnrofloxacinaBaytril08713254-18659922,7 mg/ml
    Hemostáticos de ponta finaFerramentas de Ciência Fina13021-12
    Metzenbaum Tesourade Ciência Fina14018-18
    Tesoura de írisFerramentas de Belas Ciências14058-09
    Dumont FórcepsFerramentas de Belas Ciências11251-20
    Pinça Serrilhadade Belas Ciências11020-12
    Agulha de gavagemFerramentas de Belas Ciências18060-20
    Driver de microagulhaFerramentas de Belas Ciências12075-14
    A mola Scissorda insulina das ferramentas15396-00
    ciênciafina Vária
    seringa 1mLVárias
    seringas 20mLVários
    glicosímetro (um toque ultra mini)Lifescan70021208
    Insulina multiplex e o jogo GLP-1 DescobertaK15171C-1da escala Meso
    GraphPad Prism 6.00Software
    NestletsAncareNES3600
    Várias Ferramentas Ferramentas a seringa da GraphPad

    Referências

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    Reimpressões e permissões

    Etiquetas

    Cirurgia BariátricaLigação de Vasos GástricosTransecção EstomacalTolerância à GlicoseSecreção de InsulinaPeptídeo Semelhante ao Glucagon 1Dieta Rica em GorduraProtocolo Cirúrgico
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