Ilustramos um método direto para derivar murino macrófagos primários de células da medula óssea e um método simples para preparar o ácido graxo-BSA conjuga. Em seguida, demonstraremos que ácidos graxos saturados pode induzir a morte celular de macrófagos, e essa morte celular é positivamente associado com o acúmulo celular de ceramida níveis.
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Artigo de método
Ácidos graxos saturados induzir a morte celular de macrófagos associada a ceramida
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os macrófagos altamente expressam epidérmica proteína ligadora de ácidos graxos e adiposa proteína ligadora de ácidos graxos. Eles ativamente captação saturados e ácidos graxos insaturados, o que pode desempenhar um papel crítico na regulação de suas funções imunológicas. Numerosos estudos têm demonstrado que vários ácidos graxos saturados ou insaturado, podem possuir diferentes impactos sobre o crescimento celular e função. No entanto, variam as abordagens utilizadas para preparação de ácidos graxos, que pode conduzir a resultados não-fisiológica. Albumina de soro, um portador natural de ácidos graxos no sangue periférico dos mamíferos, é recomendada para formando um conjugado complexo com o sal de sódio de ácidos graxos para estudar a função do ácido graxo em células de mamíferos, minimizando assim a toxicidade do sabão de ácidos graxos. Assim, um simples, relativamente rápido aquecimento e sonicating método é desenvolvido e apresentado aqui para formação de conjugado ácida graxos BSA. Descreveremos um protocolo utilizando ácidos graxos saturados, especialmente os ácidos esteárico para induzir a morte celular grave em macrófagos derivado de medula óssea de rato. Mais demonstramos que a morte celular induzida por ácido graxo saturado é positivamente associada com níveis de ceramida celular acumulada. Esse método pode ser estendido para estudos do impacto do ácido graxo em outras células de mamíferos.
Introdução
Ácidos gordos desempenham um papel fundamental no metabolismo energético e na síntese de fosfolipídios da membrana em diferentes tipos de células. Ácidos graxos tem uma baixa solubilidade na água. Preparação adequada dos ácidos graxos é de importância crítica para estudar as funções biológicas de ácidos graxos em células de mamíferos. Quando os ácidos graxos são preparados com etanol, muitos ácidos graxos podem mostrar seu efeito tóxico sabão (detergente) na membrana celular, mesmo em concentrações relativamente baixas1. Como um transportador de ácidos graxos livres no soro natural, major, albumina de soro é considerada uma boa operadora para á....
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Protocolo
o protocolo foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Louisville e institucional Cuidado Animal.
1. macrófagos derivados do Mouse da medula óssea (BMDMs)
- Euthanize um mouse de 6 a 8 semanas de idade, saudável tipo selvagem usando CO 2. Fixá-lo até uma placa de espuma e pulverizá-la com 70% de etanol até que esteja encharcada. Remova os ossos fêmur/tíbia com pinças e tesouras. Colocá-los em um tubo de ensaio com 5 mL 1 x tampão fosfato salino (PBS). Executar todos os procedimentos sob condições estéreis.
- Abrir ambas as extremidades do osso fêmur/tíbia com uma tesoura numa vizinhança de cultur....
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Resultados
Obesidade aumenta as concentrações de ácidos graxos livres no soro. Como fagócitos profissionais, macrófagos ativamente ocupam ácidos graxos para manter a homeostase do anfitrião. Durante estes processos, lipídios sobrecarregados podem induzir a morte celular de macrófagos. Para este fim, nós cultivadas BMDMs em vitro com obesos níveis de dietética de ácidos graxos e a morte celular de macrófagos medido usando fluxo cytometric coloração. Comparado com o controle de BSA, ácidos go.......
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Discussão
A adequada preparação da solução de ácido graxo é de importância crítica para estudar a função biológica dos ácidos graxos. A neutralização do ácido graxo aumenta sua solubilidade em solução aquosa. Entretanto, sais de sódio de ácidos graxos, especialmente ácidos graxos saturados, são ainda de baixa solubilidade em água ou em PBS, como observamos. Um método é usar etanol 95 a 100% para ajudar a dissolver o ácido graxo1. Usando esse método, maior toxicidade às células pode ser observada mesmo em co.......
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Divulgações
Os autores declaram não há conflitos de interesses financeiros.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado parcialmente pelos fundos de start-up de Universidade de Louisville e Instituto Nacional de câncer (Bethesda, MD) concede R01CA177679, R01CA180986.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Banho Ultrassônico CPX | Bransonic | Modelo 2800 | |
| Palmitato de sódio (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Estearato de sódio (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Albumina de soro bovino (BSA), livre de ácidos graxos | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Fator estimulador de colônias de macrófagos de camundongo (mM-CSF) | Tecnologia de Sinalização Celular, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugado | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Anticorpo monoclonal anti-ceramida (IgM de camundongo) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Anticorpo IgM de cabra anti-rato, µ cadeia, FITC conjugado | Sigma | AP128F | |
| Tampão de fixação | Biolegend | 420801 | |
| Tampão de permeabilização | Ebioscience | 4307693 | |
| Tampão de lise de glóbulos vermelhos | Sigma | 11814389001 | |
| Anexina V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| células L929 | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Elevador de Células | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Nota: M.W. é para peso molecular. |
Referências
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S.
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Reimpressões e permissões
