Ilustramos um método direto para derivar murino macrófagos primários de células da medula óssea e um método simples para preparar o ácido graxo-BSA conjuga. Em seguida, demonstraremos que ácidos graxos saturados pode induzir a morte celular de macrófagos, e essa morte celular é positivamente associado com o acúmulo celular de ceramida níveis.
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Artigo de método
Ácidos graxos saturados induzir a morte celular de macrófagos associada a ceramida
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os macrófagos altamente expressam epidérmica proteína ligadora de ácidos graxos e adiposa proteína ligadora de ácidos graxos. Eles ativamente captação saturados e ácidos graxos insaturados, o que pode desempenhar um papel crítico na regulação de suas funções imunológicas. Numerosos estudos têm demonstrado que vários ácidos graxos saturados ou insaturado, podem possuir diferentes impactos sobre o crescimento celular e função. No entanto, variam as abordagens utilizadas para preparação de ácidos graxos, que pode conduzir a resultados não-fisiológica. Albumina de soro, um portador natural de ácidos graxos no sangue periférico dos mamíferos, é recomendada para formando um conjugado complexo com o sal de sódio de ácidos graxos para estudar a função do ácido graxo em células de mamíferos, minimizando assim a toxicidade do sabão de ácidos graxos. Assim, um simples, relativamente rápido aquecimento e sonicating método é desenvolvido e apresentado aqui para formação de conjugado ácida graxos BSA. Descreveremos um protocolo utilizando ácidos graxos saturados, especialmente os ácidos esteárico para induzir a morte celular grave em macrófagos derivado de medula óssea de rato. Mais demonstramos que a morte celular induzida por ácido graxo saturado é positivamente associada com níveis de ceramida celular acumulada. Esse método pode ser estendido para estudos do impacto do ácido graxo em outras células de mamíferos.
Introdução
Ácidos gordos desempenham um papel fundamental no metabolismo energético e na síntese de fosfolipídios da membrana em diferentes tipos de células. Ácidos graxos tem uma baixa solubilidade na água. Preparação adequada dos ácidos graxos é de importância crítica para estudar as funções biológicas de ácidos graxos em células de mamíferos. Quando os ácidos graxos são preparados com etanol, muitos ácidos graxos podem mostrar seu efeito tóxico sabão (detergente) na membrana celular, mesmo em concentrações relativamente baixas1. Como um transportador de ácidos graxos livres no soro natural, major, albumina de soro é considerada uma boa operadora para ácidos graxos entrega em vitro para ácidos graxos função ensaios2,3,4. No entanto, os detalhes da preparação do conjugado de ácido graxo e albumina geralmente não estão disponíveis mesmo que muitos trabalhos de pesquisa usando ácidos graxos têm sido publicados.
Os macrófagos altamente expressam epidérmica proteína ligadora de ácidos graxos e adiposa ácido graxo-ligação proteína5,6,7,8. Eles ativamente captação saturados e ácidos graxos insaturados que podem regular suas funções imunológicas. Para estudar o impacto dos ácidos graxos em macrófagos e outras células, diferentes métodos de preparação de ácidos graxos foram aplicadas1,7,9. Usar o ácido graxo adequadamente preparados/soro albumina conjugados para investigar o impacto dos ácidos graxos na função de macrófagos é de fundamental importância na obtenção de dados biologicamente significativos. Estudos sobre o impacto dos ácidos graxos na função do macrófago podem fornecer conhecimentos básicos e alvos terapêuticos relacionados com o metabolismo de ácidos graxos em macrófago envolvendo doenças.
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Protocolo
o protocolo foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Louisville e institucional Cuidado Animal.
1. macrófagos derivados do Mouse da medula óssea (BMDMs)
- Euthanize um mouse de 6 a 8 semanas de idade, saudável tipo selvagem usando CO 2. Fixá-lo até uma placa de espuma e pulverizá-la com 70% de etanol até que esteja encharcada. Remova os ossos fêmur/tíbia com pinças e tesouras. Colocá-los em um tubo de ensaio com 5 mL 1 x tampão fosfato salino (PBS). Executar todos os procedimentos sob condições estéreis.
- Abrir ambas as extremidades do osso fêmur/tíbia com uma tesoura numa vizinhança de cultura de tecido estéril. Limpar o osso com uma agulha 25g com PBS + 2% de soro fetal bovino (FBS) em um tubo de 15 mL.
- Centrifugar as células de medula óssea em 500 x g, 4 ° C por 5 min.
- Ressuspender as células em tampão de lise de células vermelhas do sangue de 1 mL para lisar os glóbulos vermelhos (RBC) para menos de 1 min. dilua imediatamente com 9 mL 1X PBS. Centrifugue novamente como na etapa 1.3. Decantar os sobrenadantes.
- Ressuspender as células em 10 mL 1X PBS, filtrar a suspensão de células através de uma malha de nylon estéril 40 μm em outro tubo de 15 mL para remover detritos/aglomerados de células. Centrifugue novamente como em 1.3. Decantar os sobrenadantes.
- Ressuspender as células em 15 mL de Roswell Park Memorial Institute médio (RPMI 1640) com 5% FBS e 10 gentamicina μg/mL, placa, que as células em um prato de cultura de tecidos de 100mm no 37 o C incubadora para 60 min. Agite suavemente o prato, retire o flutuante células e contá-los.
- Placa 6 x 10 6 células em um prato de 100 mm com macrófagos 12ml diferenciando mídia (RPMI 1640 com 5% FBS e gentamicina 10 μg/mL, misturado com 30% L929 condicionado media 10) com macrófagos de rato recombinante 10 ng/mL fator colônia-estimulando (M-CSF) por 2 dias.
- Após cultivo para 2 dias em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2, alimentar cada prato com macrófagos fresco 6ml, diferenciando a mídia com M-CSF de 10 ng/mL.
- No dia 5, pegue 8 mL da velha mídia fora sem perturbar as células e adicione macrófago fresco 10ml, diferenciando a mídia com M-CSF de 10 ng/mL.
- No dia 7, colher os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) usando um levantador de célula.
Nota: Os macrófagos anexados também podem ser dissociados com 5 mL, 1 mM EDTA em 1X PBS durante 5 a 10 min após a remoção das células de flutuador e lavar a placa duas vezes com 5 mL 1X PBS. Centrifugar as células como na etapa 1.3. ressuspendê-los no macrófago fresco diferenciando mídia e contá-las com um hemocytometer.- Confirmar os BMDMs ' fenótipo por citometria de fluxo como descrito 5. Preparar o mouse derivado de macrófagos em uma certa concentração para os estudos seguintes.
2. BSA-graxos ácido conjugado preparação
- preparar 2mm BSA em PBS estéril. Por exemplo, pesar g 6,65 BSA, adicionar 30 mL 1X PBS para dissolver, em seguida, adicione mais PBS até 50 mL, dimensionamento de componentes para fazer 2 mM BSA em 1X PBS.
- Prepare sal de sódio individuais 5mm de ácidos graxos em 2mm BSA. Aqueça a 37 ° C ou superior, se necessário e proceda à sonicação a mistura de 2 mM BSA e sal de sódio de ácidos graxos, até à obtenção de uma solução clara.
Nota: Em comparação com ácidos graxos insaturados, ácidos graxos saturados precisa de uma temperatura mais elevada e mais uma vez sonication para dissolver-se. - Filtrar a solução graxos-ácido-BSA através um 0,22 μm filtro, alíquota em 1,5 mL estéril microcentrifuga tubos e armazená-los em 4 ° C, para uso de curto prazo ou a-20 ° C para armazenamento a longo prazo. Nenhuma precipitação deve ser observada após armazenagem a 4 ° C, na geladeira.
3. Saturado de ácidos graxos induzir célula morte do Mouse medula óssea derivada macrófagos
- os BMDMs em uma placa de cultura de tecido de 24-poço da placa com 0.4 x 10 6 /mL no macrófago diferenciando mídia.
- Tratar as células com a 0,4 mM o ácido palmítico e ácido esteárico para 16 a 24 h em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO 2. Use o BSA como controlo negativo.
- Colher as células com um tirante de célula após o tratamento e spin para baixo as células a 500 x g, 4 ° C por 5 min.
- Mancha as células com anexina V-Alexa 488 e D aminoactinomycin-7 (7-AAD) em 100 μL anexina tampão de ligação V durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Diluir a amostra com 200 µ l de tampão de ligação anexina, misture delicadamente e, em seguida, manter as amostras no gelo após o período de incubação.
- Analisar as células coradas logo que possível por citometria de fluxo 5. Anexina V-Alexa 488 é detectado no canal FITC e 7-AAD é detectado no canal PerCP/PerCP-Cy5.5.
4. Coloracao intracelular de ceramida
- após o tratamento de ácido graxo, colhem as células como na etapa 3.3. Em seguida, corrigir as células em paraformaldeído 4% durante 30 min.
- Lavar a amostra com 1 mL 1X PBS, spin para baixo como passo em 3.3 e decante o sobrenadante.
- Manchar as células com anticorpo primário anticeramida (diluição de 1: 200) em 100 buffer de permeabilização de 1x μL de 30 min.
- Lavagem e a centrifugação para baixo as células novamente como na etapa 4.2.
- Manchar as células com anticorpo secundário de anti-rato IgM (diluição 1: 500) em 100 buffer de permeabilização de 1x μL de 30 min.
- Lavagem e a centrifugação para baixo as células novamente como na etapa 4.2. Adicionar 250 μL 1X PBS e analisar as células manchadas por citometria de fluxo 5.
Nota: Consulte a lista de reagente detalhadas na tabela de equipamentos e reagentes.
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Resultados
Obesidade aumenta as concentrações de ácidos graxos livres no soro. Como fagócitos profissionais, macrófagos ativamente ocupam ácidos graxos para manter a homeostase do anfitrião. Durante estes processos, lipídios sobrecarregados podem induzir a morte celular de macrófagos. Para este fim, nós cultivadas BMDMs em vitro com obesos níveis de dietética de ácidos graxos e a morte celular de macrófagos medido usando fluxo cytometric coloração. Comparado com o controle de BSA, ácidos go...
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Discussão
A adequada preparação da solução de ácido graxo é de importância crítica para estudar a função biológica dos ácidos graxos. A neutralização do ácido graxo aumenta sua solubilidade em solução aquosa. Entretanto, sais de sódio de ácidos graxos, especialmente ácidos graxos saturados, são ainda de baixa solubilidade em água ou em PBS, como observamos. Um método é usar etanol 95 a 100% para ajudar a dissolver o ácido graxo1. Usando esse método, maior toxicidade às células pode ser observada mesmo em co...
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Divulgações
Os autores declaram não há conflitos de interesses financeiros.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado parcialmente pelos fundos de start-up de Universidade de Louisville e Instituto Nacional de câncer (Bethesda, MD) concede R01CA177679, R01CA180986.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Banho Ultrassônico CPX | Bransonic | Modelo 2800 | |
| Palmitato de sódio (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Estearato de sódio (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Albumina de soro bovino (BSA), livre de ácidos graxos | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Fator estimulador de colônias de macrófagos de camundongo (mM-CSF) | Tecnologia de Sinalização Celular, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugado | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Anticorpo monoclonal anti-ceramida (IgM de camundongo) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Anticorpo IgM de cabra anti-rato, µ cadeia, FITC conjugado | Sigma | AP128F | |
| Tampão de fixação | Biolegend | 420801 | |
| Tampão de permeabilização | Ebioscience | 4307693 | |
| Tampão de lise de glóbulos vermelhos | Sigma | 11814389001 | |
| Anexina V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| células L929 | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Elevador de Células | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Nota: M.W. é para peso molecular. |
Referências
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
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Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
