Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

Naoyuki Matsumoto; Nobuhiko Yamamoto

doi:10.3791/56553

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Artigo de método

Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

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DOI:

10.3791/56553

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28 de março de 2018

Naoyuki Matsumoto¹^,² , Nobuhiko Yamamoto²

¹Department of Medical Neuroscience, Graduate School of Medical Sciences, Kanazawa University, ²Neuroscience Laboratories, Graduate School of Frontier Biosciences, Osaka University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método para tratamento de imagens simultâneo de thalamocortical axônio ramificação e sinapse formação em cocultures de organotypic do tálamo e córtex cerebral. Axônios de thalamocortical individuais e seus terminais pré-sináptica são visualizados pela técnica de eletroporação única célula com DsRed e Sinaptofisina GFP-etiquetado.

Resumo

Formação de ramificação e sinapse do axônio são processos cruciais para o estabelecimento de circuitos neuronais precisos. Durante o desenvolvimento, axônios sensoriais thalamocortical (TC) formam ramos e sinapses em camadas específicas do córtex cerebral. Apesar da óbvia correlação espacial entre formação de ramificação e sinapse do axônio, a relação causal entre eles é mal compreendida. Para resolver esse problema, recentemente desenvolvemos um método para tratamento de imagens simultâneo de ramificação e sinapse formação de axônios individuais de TC em organotypic cocultures.

Este protocolo descreve um método que consiste em uma combinação de um organotypic coculture e eletroporação. Organotypic cocultures do tálamo e córtex cerebral facilitam a observação dos processos axonal, preservando estruturas características tais como a configuração laminar e manipulação genética. Dois plasmídeos distintos codificação DsRed e Sinaptofisina com tag EGFP (SYP-EGFP) foram co transfectados em um pequeno número de neurônios talâmicos técnica de eletroporação. Este método permitiu-nos Visualizar morfologias axonal individuais dos neurônios de TC e seus sites pré-sináptica simultaneamente. O método permitiu também a observação a longo prazo, que revelou a relação causal entre formação de ramificação e sinapse do axônio.

Introdução

A projeção thalamocortical (TC) do cérebro de mamíferos é um sistema adequado para investigar a orientação do axônio e mecanismos de direcionamento. Durante o desenvolvimento, axônios sensoriais do TC crescem na placa cortical e ramos de formulário e sinapses preferencialmente em camada IV das áreas sensoriais primárias no córtex cerebral¹^,². Mesmo após o estabelecimento de conexões fundamentais, mandris axonal e terminais sinápticos são remodelados dependendo de mudanças ambientais³^,⁴. No entanto, como morfologia do axônio TC é alterada dinamicamente ....