Visualização do axônio Thalamocortical ramificação e sinapse formação em Organotypic Cocultures

Resumo

Este protocolo descreve um método para tratamento de imagens simultâneo de thalamocortical axônio ramificação e sinapse formação em cocultures de organotypic do tálamo e córtex cerebral. Axônios de thalamocortical individuais e seus terminais pré-sináptica são visualizados pela técnica de eletroporação única célula com DsRed e Sinaptofisina GFP-etiquetado.

Resumo

Formação de ramificação e sinapse do axônio são processos cruciais para o estabelecimento de circuitos neuronais precisos. Durante o desenvolvimento, axônios sensoriais thalamocortical (TC) formam ramos e sinapses em camadas específicas do córtex cerebral. Apesar da óbvia correlação espacial entre formação de ramificação e sinapse do axônio, a relação causal entre eles é mal compreendida. Para resolver esse problema, recentemente desenvolvemos um método para tratamento de imagens simultâneo de ramificação e sinapse formação de axônios individuais de TC em organotypic cocultures.

Este protocolo descreve um método que consiste em uma combinação de um organotypic coculture e eletroporação. Organotypic cocultures do tálamo e córtex cerebral facilitam a observação dos processos axonal, preservando estruturas características tais como a configuração laminar e manipulação genética. Dois plasmídeos distintos codificação DsRed e Sinaptofisina com tag EGFP (SYP-EGFP) foram co transfectados em um pequeno número de neurônios talâmicos técnica de eletroporação. Este método permitiu-nos Visualizar morfologias axonal individuais dos neurônios de TC e seus sites pré-sináptica simultaneamente. O método permitiu também a observação a longo prazo, que revelou a relação causal entre formação de ramificação e sinapse do axônio.

Introdução

A projeção thalamocortical (TC) do cérebro de mamíferos é um sistema adequado para investigar a orientação do axônio e mecanismos de direcionamento. Durante o desenvolvimento, axônios sensoriais do TC crescem na placa cortical e ramos de formulário e sinapses preferencialmente em camada IV das áreas sensoriais primárias no córtex cerebral^1,2. Mesmo após o estabelecimento de conexões fundamentais, mandris axonal e terminais sinápticos são remodelados dependendo de mudanças ambientais^3,4. No entanto, como morfologia do axônio TC é alterada dinamicamente é mal compreendida. Uma das principais razões é a falta de uma técnica adequada para observar mudanças estruturais a nível uma única célula. Embora os desenvolvimentos recentes na microscopia, tais como a microscopia de dois fotões, permitiram a observação directa da vida neurônios corticais na vivo, existem limitações ainda técnicas para capturar o global TC trajetórias^{5, 6}. portanto, em vitro métodos para geração de imagens ao vivo de axônios de TC que fornece ferramentas poderosas para análises estruturais de formação de ramificação e sinapse do axônio.

Nosso grupo pela primeira vez estabeleceu um método de cultura estático fatia com membrana permeável⁷. Usando este método, uma fatia de cortical do rato foi cocultured com um bloco talâmica sensorial, e conexões de TC de lâmina específica foram recapituladas neste organotypic cocultures^7,8. Etiquetando esparsas com uma proteína fluorescente ainda mais nos permitiu observar crescimento do axônio TC e ramo formação^9,10,11. Recentemente, temos desenvolvido um novo método para tratamento de imagens simultâneo de ramificação e formação de sinapse de axônios individuais de TC no organotypic cocultures¹². Para visualizar sites pré-sináptica e axônios TC simultaneamente, DsRed e EGFP-tag Sinaptofisina (SYP-EGFP) foram co transfectadas em um pequeno número de neurônios talâmicos por eletroporação de coculture o organotypic. O método atual facilita a análise morfológica de axônios de TC e permite a observação a longo prazo, que pode ser usada para mostrar a relação causal entre a formação de ramificação e sinapse do axônio.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes estabelecidas pelos comités de bem-estar animal da Universidade de Osaka e da sociedade de neurociência do Japão.

1. Organotypic cocultures do tálamo e córtex cerebral

Nota: Para o procedimento detalhado, consulte o original publicações^7,8,13. Todos os procedimentos devem ser executados sob condições estéreis. Ratos Sprague-Dawley (SD) são utilizados para culturas neuronal.

1. Preparação dos reagentes
   Nota: Volumes dos seguintes reagentes são para o cérebro de um rato.
   1. Prepare-se 10 x modificado N2 suplemento ¹³: insulina (50 μg/mL), progesterona (200 nM), hidrocortisona (200 nM), Selenito de sódio (300 nM), transferrina (1 mg/mL), putrescina (1 mM), glicose (60 mg/mL)
   2. Prepare soro contendo meio de cultura (10 mL): 85% DMEM/F12, suplemento de N2 10 x modificado 10%, 5% de soro fetal bovino (FBS)
   3. Preparar meio de cultura livre de soro (20 mL): 90% DMEM/F12, 10% x 10 modificado N2 suplemento
   4. Prepare a solução de colágeno de cauda de rato (0,5 mL). Em breve, tomar fibras concursos de um rabo de rato em condições estéreis e incubar durante uma noite em solução de ácido acético. Após a centrifugação, recolher o sobrenadante (alguns mg/mL) e armazenar em um refrigerador¹³.
2. Preparação de pratos de cultura
   1. Coloque uma inserção da membrana em uma placa de Petri de 35mm.
   2. Adicionar 40-50 μL de solução de colágeno de cauda de rato para a membrana e espalhe a solução de colágeno em torno do centro.
   3. Ar seco a membrana completamente em uma bancada limpa.
   4. Colocar 1,5-2 mL do meio de cultura contendo soro para o prato, para que a membrana é encharcada com o meio.
   5. Coloque o prato de cultura numa incubadora (37 ° C, ar umidificado 95% e 5% CO₂) antes do chapeamento.
3. Preparação de fatias corticais
   1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70% durante 10 min ou mais.
   2. Dissecar o cérebro todo rapidamente de um dia pós-natal (P) 2 rato sob anestesia gelada (imergido em lascas de gelo por alguns minutos).
   3. Lugar do cérebro em uma placa de Petri contendo 100 mL de frio Hanks de 100mm equilibrada solução salina.
   4. Remover o problema de pia do cérebro com pinça fina e cortar fatias corticais (300-400 μm de espessura) do córtex visual e somatossensorial com tesoura microcirúrgica (para detalhes, veja a Figura 1).
      Nota: Estima-se aproximadamente a espessura das fatias corticais pela escala de grades sob um microscópio binocular.
      Nota: Alternativamente, fatias corticais podem ser feitas com um vibratome sob condições estéreis.
   5. Transferi algumas fatias corticais para a inserção de membrana com uma pipeta descartável de plástico.
   6. Ajustar as posições das fatias perto do centro da inserção da cultura, com uma pipeta Pasteur fogo-polido (para obter detalhes, consulte^8,13) e remover o excesso de meio da inserção.
      Nota: Ajuste o nível do meio ligeiramente abaixo da superfície das fatias para que as fatias podem receber uma oferta suficiente do gás e do médio. Isto é crucial para a viabilidade celular.
   7. Manter as fatias em meio de cultura contendo soro a 37 ° C, em um ambiente de umidificado 95% ar e 5% de CO₂e cultura sozinha por um dia antes de um bloco talâmica é levado e colocado ao lado.
4. Preparação dos blocos talâmicos
   1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70% durante 10 min ou mais.
   2. Anestesia um rato grávido (embrionário dia 15) por injeção intraperitoneal de pentobarbital (50 mg/kg) contendo anestésico.
   3. Dissecar cada embrião partir os cornos uterinos e colocar os embriões em uma placa de Petri contendo 100 mL de solução salina balanceada de Hanks frio de 100mm.
   4. Sob um microscópio binocular, remover o cérebro de cada embrião e cortar blocos talâmicos que contêm principalmente o núcleo geniculado lateral e complexo (aproximadamente 0,5 mm x 3) ventrobasal⁷ usando tesoura microcirúrgica (ver Figura 1).
5. Cultura e manter organotypic cocultures
   1. Usando uma pipeta Pasteur, coloque o bloco talâmica junto a superfície ventricular da fatia cortical que foi colocada no filtro de membrana.
   2. Manter os cocultures em meio de cultura contendo soro a 37 ° C, em um ambiente de ar umidificado 95% e 5% de CO₂.
   3. Troca metade do médio com meio de cultura livre de soro depois de dois dias em cultura. Depois disso, troca o meio de cada 2-3 dias.
      Nota: O nível de médio porte deve ser verificado após o câmbio médio, como é importante para a sobrevivência da pilha.

2. eletroporação

Todos os procedimentos devem ser executados sob condições estéreis.

Nota: Execute electroporation um dia após o preparo dos blocos talâmicos para evitar o desprendimento dos blocos.

1. Plasmídeos
   1. Fazer uma mistura de plasmídeos da seguinte forma: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3,5 μg/μL.
      Nota: Purificar os ambos Plasmideos usando um kit de Maxiprep livre de endotoxinas e dissolver numa solução salina balanceada de Hanks.
2. Instalação de equipamento de eletroporação
   Os instrumentos elétricos como um estimulador e um isolador devem ser conectados conforme mostrado na Figura 2.
   1. Conecte o estimulador do isolador bifásico.
   2. Conecte um eletrodo (um fio de prata 0,2 mm de diâmetro) para o terminal negativo do isolador.
   3. Conecte um eletrodo (um fio de prata 1 mm de diâmetro) em série com um resistor Ω a 100 e o terminal positivo do isolador.
   4. Ligar o amplificador ao osciloscópio para monitorar se correntes elétricas são passadas através do resistor, medindo a tensão com o amplificador.
3. Preparação de pipetas de vidro
   Nota: Dois tipos de pipetas de vidro são utilizados para ejeção da solução do plasmídeo e a aplicação de pulsos elétricos.
   1. Fazer as pipetas de capilares de vidro com um extrator de eletrodo.
   2. Quebre a ponta para a pipeta de ejeção (o diâmetro da ponta deve ser de 20-50 μm).
   3. Moer e polir a ponta da pipeta eletrodo com lixa seguida de fogo-polimento (o diâmetro interno deve ser de 50-200 μm).
      Nota: Ponta do eletrodo deve ser plana e Lisa, como que toca diretamente o tecido.
4. Procedimento de eletroporação
   1. Conecte as ejeção e eletrodo pipetas para os manipuladores.
   2. Introduza um fio de prata (0,2 mm de diâmetro) dentro da pipeta de eletrodo.
   3. Anexe a pipeta de ejeção de uma seringa de 1 mL com um tubo de plástico.
   4. Ocupam > 5 μL de solução de plasmídeo dentro da pipeta de ejeção por sucção da seringa.
   5. Colocar o coculture no palco electroporation e inserir o eletrodo de diâmetro de 1 mm no meio de cultura.
   6. Coloque a pipeta de ejeção do explante talâmica.
   7. Empurre a seringa manualmente após a ponta toca a superfície do bloco talâmica.
      Nota: Sobre 0,5 μL do plasmídeo solução geralmente é usada por um bloco talâmica.
   8. Coloca a pipeta do eletrodo no bloco talâmica imediatamente depois da retração da pipeta ejeção.
   9. Entrega os pulsos elétricos (50-400 μA, trens de 3 a 5 de 200 pulsos quadrados de 1 ms duração a 200 Hz). Monitore a amplitude e o número de trens no osciloscópio.
      Nota: A amplitude das correntes elétricas depende do diâmetro interno de um eletrodo pipeta¹³.
   10. Retire a pipeta do eletrodo e devolver o prato para a incubadora.
5. Observação microscópica
   1. Coloque o prato de cultura num palco microscópica de um microscópio confocal vertical equipado com dois conjuntos de filtro para EGFP (excitação, 488 nm; emissão, 515 nm) e DsRed (excitação, 514 nm; emissão, 565 nm).
   2. Com imagens de 10-25 seções óticas em tamanhos de 1-7 µm-passo com uma lente objetiva distância de long-trabalho X 20. Selecione individualmente distinguíveis rotulados axônios que expressam tanto DsRed e SYP-EGFP.
      Nota: A área observada é aproximadamente 0,7 x 0,7 mm (correspondente a 1024 x 1024 pixels, ou seja, 0,68 μm/pixel).
   3. Capture imagens cada 24 h para a geração de imagens diária. Concluída dentro de 10 min à temperatura ambiente e retornar as culturas para a incubadora. Para a imagem latente de lapso de tempo curto intervalo, manter a cultura em uma câmara de cultura, que mantém que o ambiente de humedecido 95% ar e 5% CO₂ a 37 ° C.

Resultados

O experimento aqui descrito destina-se a revelar a relação entre formação de ramificação e sinapse de axônio de TC. Para visualizar simultaneamente trajetórias axonal e locais de sites pré-sináptica, única ou poucas células talâmicos em organotypic cocultures foram transfectadas com dois plasmídeos codificação SYP-EGFP e DsRed usando eletroporação. Durante a segunda semana de cultura, axônios individualmente distinguíveis do TC foram claramente rotulados por DsRed (Fi...

Discussão

O protocolo atual também é uma ferramenta poderosa para estudar aspectos do desenvolvimento do crescimento de axônios, além do TC projeção¹¹. Por exemplo, uma combinação de cultura fatia cortical e a técnica de eletroporação permite visualizar a morfologia axonal individual de neurônios corticais e observação de longo prazo^9,18.

Usando o protocolo atual, os papéis de genes interessantes na formação de ramificaçã...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM/F12	GIBCO	11320-033
Solução salina balanceada de Hanks (HBSS)	Nissui	5905
Soro fetal bovino (FBS)	Thermo Scientific	SH30396-03	Hyclone
Insulina	Sigma	I6634
Progesterona	Sigma	P8783
Hidrocortisona	Sigma& nbsp;	H0888
Selenito de sódio	Wako Pure Chemical Industries	192-10843
Transferrina	Sigma	T1147
Putrescine	Sigma	P5780
Glucose	Wako Pure Chemical Industries	16806-25
Placas de Petri de 35 mm	Falcon	351008
Inserção Millicell-CM Placas de	Millipore	PICMORG50
100 mm	Placa de Petri BIO-BIK	I-90-20	Estéril
HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen
	de plástico estéreis descartáveis	202-IS	pipetas de transferência estéreis
capilares de vidro: OD 1,2 mm	Narishige	G-1.2	diâmetro interno, 1.2 mm
Fio de prata: 0.2 e 1 mm	Nilaco	AG-401265 (diâmetro, 0,2 mm), AG-401485 (diâmetro, 1,0 mm)
Seringa de 1 mL	Terumo	SS-01T
Estimulador	Isolador bifásico A.M.P.I	Master 8
	Amplificador BAK ELECTRONICS	BSI-2
nbsp;	Modelo 1800		da A-M Systems
	Hitachi	VC-6723
Manipulador	Narishige	SM-15
Micromanipulador	Narishige	MO-10
Estereomicroscópio	Suporte universal Olympus	SZ40
	Sistema	Olympus SZ-STU2
	Olympus	LG-PS2, LG-DI, HLL301
Extrator de eletrodos	Narishige	PC-10
	Nikon	Digital eclipse C1 laser
x20 objetiva	Nikon	ELWD 20x/0.45
Câmara de cultura	Tokai Hit	UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rato	Japão SLC e Nihon-Dobutsu
Tesoura de microcirurgia	Natsume	MB-54-1