Este protocolo descreve o uso culto Aorta-gônada-Mesonephros para análises de expressão, unidades formadoras de colônia, na cultura e baço e reconstituição de longo prazo para determinar o efeito de fatores regulatórios e vias de sinalização no tronco hematopoiético desenvolvimento da célula. Isto foi demonstrado como um sistema eficaz para estudar a função e biologia de células-tronco hematopoiéticas.
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Artigo de método
Aplicação do sistema de cultura Aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento
Neste artigo
Resumo
Resumo
A limitação do uso de embriões do rato para estudos de hematopoiese é o inconveniente adicional nas operações, que é em grande parte devido ao desenvolvimento intra-uterino do embrião. Embora os dados genéticos de camundongos nocaute (KO) são convincentes, não é realista para gerar camundongos KO para todos os genes, conforme necessário. Além disso, realizando na vivo resgate experiências para consolidar os dados obtidos de camundongos KO não é conveniente. Para superar essas limitações, a cultura de explante de Aorta-gônada-Mesonephros (AGM) foi desenvolvida como um sistema adequado para estudar o desenvolvimento de células-tronco hematopoiéticas (HSC). Especialmente para as experiências de resgate, ele pode ser usado para recuperar a hematopoiese prejudicada em camundongos KO. Adicionando os produtos químicos apropriados entram no meio, a sinalização deficiente pode ser reactivada ou vias acima-regulada podem ser inibidas. Com o uso desse método, muitos experimentos pode ser realizada para identificar os reguladores críticos de desenvolvimento do HSC, incluindo HSC relacionados a expressão gênica em níveis de mRNA e proteína, capacidade de formação de colônia e capacidade de reconstituição. Esta série de experimentos seria útil na definição dos mecanismos subjacentes essenciais para o desenvolvimento de HSC em mamíferos.
Introdução
Células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) são células-tronco tecido-específica adultas que possuem potencial multilineage incluindo eritroide, mieloide e células linfoides, bem como a capacidade de se renovar. Estudos recentes têm mostrado que os primeiros linfócitos surgiram de uma população endotelial especializada, conhecida como endotélio hemogenic (ele), através o endotelial de transição hematopoiética (EHT) na parede ventral da aorta dorsal1,2 ,3,4. Uma vez formado na aorta-gônada-mesonephros (AGM) região de embrionária (E) 10.5 par....
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Protocolo
todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de revisão ética no Instituto de Zoologia, da Academia Chinesa de Ciências, Beijing, China.
1. preparação de material
- esterilize a 0,65 µm filtros com ultravioleta raios produzidos sob o ultravioleta raio lâmpada no banco limpo para 4h e entregar os filtros após a marca de 2 h.
Nota: Ao trabalhar com luz UV, use proteção adequada. - Esterilizar as malhas de aço inoxidável com o esterilizador autoclave a 121 ° C por 30 minutos.
Nota: Uma certa altura, de malha de aço inoxidável é necessário para suportar os filtros na interface ar....
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Resultados
Uma publicação recente relatado serotonina derivado de células endotelial promove a sobrevivência de linfócitos inibindo o caminho pro-apoptotic no AGM13. Para confirmar o efeito de promoção de serotonina no desenvolvimento de HSC, fluoxetina foi incluída. Como um inibidor de recaptação de serotonina (ISRS), fluoxetina foi demonstrada para inibir a reabsorção de serotonina em tecidos periféricos16,17,<.......
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Discussão
É sabido que linfócitos maduros na medula óssea podem repovoar o sistema sanguíneo de destinatários irradiados. Ao contrário destes linfócitos funcionais, os linfócitos emergentes em assembleia geral de embriões do rato são imaturos. Resultados de transplante direto mostraram esse tipo eu (VE-cad+ CD45– CD41+) e tipo II (VE-+ CD45 cad+) pré-linfócitos possuem nenhuma capacidade de reconstituição20. Aproveitando o sistema de cultura de explant .......
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Divulgações
Os autores têm sem conflitos de interesses financeiros.
Agradecimentos
Agradecemos Suwei Gao para ajudar na preparação de figura. Este trabalho foi apoiado por concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (81530004, 31425016) e o Ministério da ciência e tecnologia da China (2016YFA0100500). J.L. realizou os experimentos e elaborou o manuscrito; F.L. editado o manuscrito. Ambos os autores ler e aprovaram o manuscrito final.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| durapore 0,65 µ filtros | Millipore | R5BA63787 | AGM explante cultura |
| M5300 meio de cultura de longo prazo | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explante cultura |
| Trizol | Tiangen | 5829 | extração de RNA |
| M-MLV transcriptase reversa | Promega | 90694 | transcrição reversa |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | tempo real |
| inibidor de protease | Roche | 55622 | Extração de |
| proteínas colagenase | Sigma | C2674 | digestão de tecidos AGM |
| MethoCult GF M3434 médio | Stem Cell Technologies | 3434 | Ensaio CFU-C |
| ultrabaixa Placas de 24 poços | Costar | 3473 | Ensaio CFU-C |
| Camundongos C57BL/6 CD45.2 | Pequim HFK Bioscience Co. Ltd | Ensaio CFU-S | |
| C57BL/6 CD45.1 camundongos | Pequim HFK Bioscience Co. Ltd | Transplante de longo prazo | |
| fosfato tamponado solução salina | Life Technologines | Coleção 8115284 | AGM |
| Solução de penicilina-estreptomicina | HyClone | SV30010 | AGM explante cultura |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Transplante de longo prazo |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Lâmpada UV de transplante de longo prazo |
| Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | potência: 30W | |
| malha de aço inoxidável | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | Diâmetro da abertura: 2,5 mm |
| hidrocortisona | Sigma | H0396 | seletivamente diluída em meio M5300 |
Referências
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle.
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Reimpressões e permissões
