À procura de caminhos de Driver do adquiriu resistência à terapia-alvo: geração de Subclone resistentes aos medicamentos e sensibilidade restaurando pelo Gene Knock-down

Resumo

Este é um protocolo de tempo - e cost - effective em vitro investigando os mecanismos de resistência adquirida aos agentes terapêuticos alvo, que é uma necessidade médica altamente insatisfeita na gestão de câncer.

Resumo

Nas últimas duas décadas têm visto a troca de drogas citotóxicas para terapia-alvo em Oncologia Médica. Embora alvo de agentes terapêuticos têm demonstrado eficácia clínica mais impressionante e minimizados os efeitos adversos do que os tratamentos tradicionais, resistência a drogas tornou-se a principal limitação para seus benefícios. Vários modelos pré-clínicos/in vitro/in vivo da resistência adquirida aos agentes alvo na prática clínica foram desenvolvidos principalmente por meio de duas estratégias: i) genéticas para genótipos de resistência adquirida e ii) in vitro de modelagem / vivo em seleção de modelos resistentes. No presente trabalho, propomos um quadro unificador, para investigar os mecanismos subjacentes responsáveis pela resistência adquirida ao alvo agentes terapêuticos, a partir da geração de subclones celulares resistentes à descrição do silenciar os procedimentos utilizados para restaurar a sensibilidade ao inibidor. Este tempo - e cost - effective abordagem simples é amplamente aplicável e pode ser facilmente estendida para investigar mecanismos de resistência a outras drogas terapêuticas alvo no tumor diferente histotypes.

Introdução

Acompanhando as descobertas cruciais em biologia molecular e celular, um número de novas moléculas anticâncer sintetizados foram desenvolvido para alvejar seletivamente vias de sinalização oncogênicas em uma ampla gama de tipos de tumor. Em particular, duas categorias de agentes terapêuticos direcionados com propriedades únicas em Oncologia, os compostos químicos sintéticos ou seja e recombinantes anticorpos monoclonais, são conhecidos por alcançaram sucessos clínicos e tratamento do câncer drasticamente alterado em últimas décadas^1,2,3.

No entanto, apesar de sua impressionante resposta inicial ao tratamento, a maioria dos pacientes com câncer desenvolveram resistência aos medicamentos para todos os agentes terapêuticos direcionados, ambos anticorpos monoclonais e inibidores da quinase. Como consequência, a resistência às drogas, o principal obstáculo para clássico medicamentos anti-câncer⁴, ainda é um grande desafio para emergentes terapias alvo^5,6.

Resistência à terapia-alvo pode ser intrínseca (ou seja, primário) ou adquirido (ou seja, secundário). Resistência intrínseca descreve uma novo de falta de resposta à terapia, Considerando que a resistência secundária ocorre após um período de resposta a drogas tratamento⁷. Este último é causado por surtos de coortes pequenas de células tumorais dentro da massa do tumor primitivo ou aninhado em nichos anatômicos crípticos distais, exibindo até 90% de resistência a um ou mais alvo agentes terapêuticos. Mecanismos moleculares subjacentes a um desenvolvimento de resistência à terapia-alvo principalmente resultam de mutações do gene alvo e redundante ativação de outras vias de sinalização de pro-sobrevivência, cuja compreensão está ainda longe de ser completa⁸.

Neste trabalho, propusemos uma abordagem tempo - e cost - effective para investigar em vitro mecanismos de resistência adquirida aos agentes terapêuticos direcionados, a partir da geração de subclones celulares resistentes para a descrição de silenciamento procedimentos utilizados para restaurar a sensibilidade para o inibidor, uma ferramenta crucial, usado para testar e validar as hipóteses de trabalho. Em particular, a nossa abordagem foi usada para investigar, no câncer gástrico, os mecanismos de resistência ao trastuzumab (por exemplo, Herceptin), um anticorpo monoclonal humanizado, visando o domínio extracelular do HER2 proteína⁹. Trastuzumabe + quimioterapia é amplamente aceito como o tratamento padrão de primeira linha para câncer de mama metastático HER2-positivo. Graças a recentes estudos pré-clínicos mostrando esse anti-HER2 terapias têm atividade significativa em ambas em vitro e em vivo HER2-positivo câncer gástrico modelos^10,11, drogas moleculares visando HER2 têm sido extensivamente examinada em ensaios clínicos, alguns dos quais ainda estão em andamento, em pacientes com câncer de gastroesofágico^12,13,14,15.

Estes estudos têm enfatizado o número crescente de pacientes enfrentando resistência ao Trastuzumabe¹⁶, semelhante ao que é observado por outros inibidores alvo terapêuticos. Em particular, a taxa de resposta de Trastuzumabe foi de 47%, e a sobrevivência global mediana para os pacientes na Trastuzumabe + quimioterapia foi apenas 2,7 meses mais do que para pacientes em quimioterapia só¹⁷. Isto sugere que enquanto resistência primária Trastuzumabe é prevalente, resistência secundária Trastuzumabe é inevitável. Por esta razão, há uma urgente necessidade de esclarecer os mecanismos causando resistência terapia HER2-alvo em câncer gástrico, que é ainda mais problemático, dada a heterogeneidade genética intra-tumoral desta neoplasia¹⁸.

Além disso, mecanismos de resistência ao Trastuzumabe no câncer gástrico provaram-se difíceis de explicar, parcialmente devido à dificuldade na obtenção de representante confiável modelos pré-clínicos desta condição. Oshima et al relataram um método de seleção em vivo de linhas de células de câncer gástrico trastuzumab-resistente, consistindo de uma cultura repetida de uma pequena metástase peritoneal residual após o tratamento com Trastuzumabe¹⁹. No entanto, a necessidade de um gabinete, de conhecimentos de manipulação de animais específicos e da aprovação do Comitê de ética Animal contribuiu para torná-lo um método demorado e custo. A abordagem que descrevemos neste trabalho é simples e amplamente aplicável e pode ser facilmente estendida para investigar os mecanismos de resistência a outras drogas terapêuticas em diferentes tumor histotypes²⁰.

Protocolo

Nota: Este protocolo foi especificamente ajustado para a análise dos mecanismos subjacentes a resistência adquirida ao Trastuzumabe de linhas de células de câncer gástrico HER-positivo. Todos os instrumentos de laboratório necessários são relatados na Tabela de materiais.

1. geração de alvo Subclones resistente à terapia

Nota: Este é o mais crítico e difícil padronizar passo no protocolo, devido ao fato de que linhagens celulares diferentes podem apresentar diferentes sensibilidades ao alvo terapêutico inibidor independentemente de sua concentração de histotype ou drogas de tumor usado.

1. Cultura NCI-N87 célula linha em meio RPMI suplementado com soro fetal de bezerro (10%) e glutamina (2 mM, 1%), como uma monocamada a 37 ° C e isso de sementes em frascos de cultura 25 cm² .
2. Adicione ao meio de cultura em cada balão 10 µ g/mL de trastuzumab como a dose inicial. Expor as células para a dose inicial até eles continuar crescendo.
   Nota: A dose inicial do inibidor terapia-alvo deve ser 10-fold inferior a sua concentração plasmática de pico. Concentração plasmática de pico é o mais alto nível de concentração do fármaco detectado no sangue de pacientes habitualmente após múltiplas doses de terapia padrão. Esse valor pode ser obtido em estudos de farmacocinética.
3. Monitorar o crescimento de células com o método de exclusão trypan azul; Quando o crescimento celular é reiniciado (normalmente após um período de duas a três semanas), expor as células a uma concentração de dose 10 vezes maior de Trastuzumabe.
4. Expor as células a uma dose gradualmente crescente de trastuzumab (a partir de 100 µ g/mL a 400 µ g/mL) até manter células crescendo (após cerca de 2 semanas), apesar da presença de uma concentração elevada de drogas (pelo menos 2,5 - 4-fold maior do que o pico de plasma).
5. Realizar um ensaio de clonogenic para avaliar o nível de resistência à terapia-alvo em todas as alterações da concentração do inibidor terapia alvo em meio de cultura e definir o índice de₅₀ de IC de resistência relativo (RR IC₅₀) como segue.
   1. 500 células em 24 placas de cultura multi bem as sementes.
      Nota: 5 poços devem estar preparados para cada conjunto de condições.
   2. Expor as células para o aumento das concentrações de inibidor (trastuzumabe) de terapia de alvo de 100 µ g/mL até 400 µ g/mL.
   3. Incube as células numa incubadora de CO₂ a 37 ° C por 15 dias.
   4. Após a incubação, corrigir e manchar as amostras como segue.
      1. Remova células médio e enxágue com 10 mL 1X PBS. Remover 1X PBS e adicionar 2-3 mL de solução de fixação (ácido acético: metanol, 1:7, (vol/vol)). Remover a solução de fixação e adicionar 0,5% solução de cristal violeta. Incubar a temperatura ambiente por 2 h
      2. Remover a solução de cristal violeta cuidadosamente por aspiração com uma pipeta e mergulhe as placas em água da torneira para enxaguar os resíduos de solução de cristal violeta. Secar em temperatura ambiente por até 2 dias.
   5. Contagem das colónias de mais de 50 células usando um microscópio invertido (ampliação de 4x).
      Nota: Dois observadores independentes são necessários para isso.
   6. Calcule o RR IC₅₀ como a relação entre o valor de IC₅₀ de células alvo-terapia-resistente subclone e o valor das células original/ingênuo.

2. validação protocolo para o candidato alvo terapia resistência o Gene (R)

Nota: Após a caracterização da expressão do gene, assinaturas associadas a resistência adquirida a terapia alvo e qualquer gene candidato como condutor de resistência será investigado por meio de: a) RT-PCR e b) Western blot-análise.

1. RT-PCR em tempo real
   1. Extrair o RNA total de linhas celulares usando a mistura de ácido guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio (ver Tabela de materiais).
   2. Realizar reações de transcrição reversa (RT) utilizando primers aleatórios hexâmero e defina o termociclador como segue: escorva a 25 ° C por 5 min, RT a 46 ° C por 20 min e inativação de RT a 95 ° C por 1 min.
   3. Uso 400 ng de RNA total para uma reação de 20 µ l. Prepare a mistura de reação para amostra da seguinte forma: 7 µ l RNase livre H₂O, 2 µ l cDNA (10 ng / µ l), 1 µ l 20 x sonda fluorescente-etiquetadas do destino-específicos e 10 µ l 2 x mistura contendo tampão, dNTPs e DNA polimerase (ver Tabela de materiais).
   4. Adicionar 20 µ l da mistura de reação para cada prato bem e executar o programa a seguir: segurando o palco a 50 ° C por 2 min, a 95 ° C por 10 min (1 ciclo); Então 40 ciclos a 95 ° C por 15 s e 60 ° c, durante 1 min.
2. Borrão ocidental
   1. Recupere suspensões celulares, adicionar 2 mL de solução de tripsina/EDTA 0,05% e permitindo que 2-3 min para tripsina trabalhar.
   2. Adicione 2 volumes de médio com 10% fetal bovino soro para neutralizar a tripsina (por exemplo, 2 mL do meio para cada 1ml de tripsina) e centrifugar a 1.200 x g, durante 5 min. Discard sobrenadante e lavar as células com frio 1X PBS.
   3. Centrifugar a 1.200 x g por 5 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células com Lise e incubar um basculante a 4 ° C por 30 min.
      1. A quantidade de Lise depende do número de células (por exemplo, 100 µ l de 1 x 10⁶ células); Certifique-se de preparar a Lise fresco cada vez. Para 1 mL da preparação de tampão de lise (deixe no gelo): usar µ l 975 M-por buffer de lisado mamíferos, 15 inibidores de protease e fosfatase µ l e 10 µ l 100 µM PMSF os inibidores.
   4. Recupere a proteína sobrenadante por centrifugação de lisado celular a 13.000 x g a 4 ° C por 15 min.
   5. Determine as concentrações de proteína por meio de um ensaio da proteína do BCA.
   6. Adicione 4 x LaemmLi Sample Buffer de amostras da proteína (pelo menos 20-30 µ g de proteína) e calor a 100 ° C por 3 min.
   7. Geles de pré-moldado 4-20% de usar e carregar 20-30 µ g de solução de proteína LaemmLi e 5-10 µ l de proteína padrão por amostra.
   8. Encher o anel do Western blot com buffer de 1x TRIS/GLICYNE /SDS e funcione o gel em 110 V para 30-60 min (quando o tempo para verificar que o corante chegou ao final do gel, caso contrário, correr por alguns minutos adicionais)
   9. Electroblot para transferir a proteína em uma membrana PVDF (ver Tabela de materiais), usando um sistema semi-seco.
   10. Bloquear a membrana por imersão em solução da proteína adequada (5% de leite/BSA) no agitador à temperatura ambiente durante 1 h.
   11. Faça uma solução de 1: 400 com anticorpo primário anti-IQGAP1 em uma solução de leite de 5% (ver Tabela de materiais).
   12. Lugar da membrana em solução de anticorpo primário em um shaker em uma sala fria durante a noite.
   13. No dia seguinte, descartar a solução de anticorpo e mergulhe numa solução de 1 x T-TBS (1 x T-TBS: 1x tampão salino Tris adicionado por Tween20 0,1%) um agitador, à temperatura ambiente por 7 min.
   14. Descarte o T-TBS 1 x solução e substituir. Repeti 3 vezes.
   15. Fazer uma solução de rato-anticorpo secundário de 1:10,000 pela adição de anticorpos para o padrão ocidental borre deteção (ver Tabela de materiais) e coloque a membrana num agitador; Deixe em temperatura ambiente por 2 h.
   16. Descartar a solução de anticorpo e mergulhe em solução de 1 x T-TBS num agitador, à temperatura ambiente por 7 min.
   17. Descarte o T-TBS 1 x solução e substituir. Repeti 3 vezes.
   18. Mergulhe a membrana por 5 min em uma solução quimioluminescente e imagem a membrana em uma imagem de quimioluminescência.

3. restaurando a sensibilidade de inibidor de terapia-alvo pelo candidato R-gene Knock-down

1. Preparação da pilha
   1. Prepare a suspensão de célula única por tripsinização. Execute a transfeccao no dia em que as células são banhadas.
      1. ICN-N87 lavar as células com PBS e incubar a 37 ° C, com solução de tripsina/EDTA 0,05% de 5-10 min.. adicionar 2 volume de RPMI médio com 10% fetal bovino soro para neutralizar a tripsina (por exemplo, 2 mL do meio para cada 1ml de tripsina).
      2. Contar as células com um hemocytometer usando trypan azul coloração. Semente de 2.5 x 10⁵ células (60% confluência) para um balão de² cm T25 para cada condição.
         Nota: O número adequado de células para semeadura é determinado pelo tempo de duplicação da linha da célula e a duração do experimento. O objectivo é conseguir o gene alvo knock-down para toda a duração do experimento. Nove T25 frascos de² cm são ideais para condições de transfecção e o ensaio de clonogenic (3 frascos para controles, 3 frascos para transfeccao negativo controles, 3 frascos para transfecção do gene-alvo).
2. Reversa do transfection
   1. Prepare-se gene-alvo e negativo mistura de Transfeccao de controle para cada frasco de² cm T25 como segue.
      1. Dilua a 12,5 µ l de cada gene-direcionamento siRNA oligonucleotides ou oligonucleotídeos de siRNA controlo negativo no mínimo essencial transfeccao (proporção 01:55; ver Tabela de materiais).
      2. Adicione um reagente de Transfeccao de lipossomas catiônicos (proporção de 1:1 com gene-direcionamento siRNA oligonucleotides; ver Tabela de materiais). Incube a temperatura ambiente por 20 min.
         Nota: O volume total da mistura do transfection é 700 µ l.
      3. Adicione 700 µ l da mistura do transfection para cada balão de² cm T25. Incube as células a 37 ° C durante 1-3 dias.
   2. Verifique se o gene knock-down por RT-PCR e análise ocidental do borrão. Verifica o impacto do putativo R-gene batida para baixo sobre a restauração de sensibilidade ao agente alvo terapêutico através de experiências de formação de Colônia (repetir passo 1.5).

Resultados

A Figura 1 descreve a estrutura do procedimento experimental. Linhas de células de câncer gástrico de três expressando um alto nível de HER2 e sensível ao trastuzumab (IC₅₀ < nível plasmático de pico do gráfico de drogas, Figura 2A, à esquerda) foram cultivadas em meio de cultura contendo o agente alvo terapêutico. Uma dose 10-fold inferiores a concentração plasmática de pico de trastuzumab (10 µ g/mL) foi definida ...

Discussão

Enquanto personalizado e direcionado terapias têm suscitou entusiasmo crescente, estas terapias 'inteligentes' so-called enfrentam o obstáculo principal mesmo como drogas de quimioterapia tradicional, ou seja, a aquisição rápida e imprevisível de resistência às drogas. Para melhorar os resultados da terapia-alvo, os problemas de resistência aos medicamentos devem ser resolvidos através de uma melhor compreensão dos mecanismos que os provocam. Aqui, apresentamos uma metodologia amplamente acessível em vitro <...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente Trizol	Invitrogen	15596026	O Reagente TRIzol é um reagente para isolar RNA total de alta qualidade ou isolar simultaneamente RNA, DNA e proteína de uma variedade de amostras biológicas KIT DE SÍNTESE DE
CDNA ISCRIPT	Bio-Rad	1708891	O kit de síntese de cDNA iScript é um kit de síntese de cDNA de primeira fita sensível e fácil de usar para análise de expressão gênica usando qPCR em tempo real.
Ensaio de expressão gênica TaqMan	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems Os ensaios de expressão gênica TaqMan consistem em um par de primers de PCR não rotulados e uma sonda TaqMan com um rótulo de corante FAM ou VIC da Applied Biosystems na extremidade 5' e aglutinante de ranhura menor (MGB) e atenuante não fluorescente (NFQ) na extremidade 3'.
Reagente de Extração de Proteína de Mamífero M-PER	Thermo Scientific	78501	O Reagente de Extração de Proteína de Mamífero M-PER da Thermo Scientific é projetado para fornecer extração de proteína solúvel total altamente eficiente de células de mamíferos cultivadas.
Coquetel de Inibidores de Protease e Fosfatase Halt (100X)	Thermo Scientific	78440	O Coquetel de Inibidores de Protease e Fosfatase Halt da Thermo Scientific (100X) oferece a conveniência de uma única solução com proteção total de amostras de proteína para lisados de células e tecidos.
Kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA	Thermo Scientific	23225	O Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce da Thermo Scientific é um conjunto de reagentes de ensaio de dois componentes, de alta precisão, compatíveis com detergente, para medir (A562nm) a concentração total de proteína em comparação com um padrão de proteína.
4x Tampão de Amostra Laemmli	Bio-Rad	1610747	Use 4x Tampão de Amostra Laemmli para preparação de amostras para SDS PAGE. Para a redução das amostras, adicione um agente redutor, como o 2-mercaptoetanol, ao tampão antes de misturar com a amostra.
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldados	Bio-Rad	456-1094	géis TGX (Tris-Glycine eXtended) de longa duração têm uma nova formulação e podem ser usados tanto para separações de proteínas desnaturantes padrão quanto para eletroforese nativa.
Padrões de Blotting Ocidental da Proteína Precision Plus	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards estão disponíveis nos formatos Dual Color, All Blue, Kaleidoscope e Dual Xtra. Todos os quatro têm os mesmos padrões de migração de gel, com 3 bandas de referência de alta intensidade (25, 50 e 75 kD).
10x Tris/Glicina/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glicina/SDS é um tampão de corrida pré-misturado para separação de amostras de proteínas por SDS-PAGE.
Pacotes de Transferência de PVDF Mini Trans-Blot Turbo	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini Pacotes de Transferência de PVDF para transferência rápida e eficiente de proteínas de mini géis usando o Sistema de Transferência Trans-Blot Turbo. Cada pacote de transferência selado a vácuo, pronto para uso, contém duas pilhas de reservatórios de íons saturados com tampão e uma membrana de PVDF pré-umedecida.
Conjugado de Proteína de Precisão StrepTactin-HRP	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugado para detecção quimioluminescente ou colorimétrica de Padrões de Proteína Não Corada de Proteína Precision Plus ou Padrões de Proteína WesternC de Proteína Precision Plus em western blots.
Solução Immun-Star WesternC A solução	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC, um método de detecção de proteínas, detecta quantidades de proteína no meio do femtograma.
Controle Negativo Universal	Invitrogen	12935300	O siRNA de Controle Negativo não tem semelhança significativa de sequência com sequências genéticas de camundongos, ratos ou humanos. O controle também foi testado em telas baseadas em células e provou não ter efeito significativo na proliferação, viabilidade ou morfologia celular.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium é um meio essencial mínimo (MEM) aprimorado que permite uma redução da suplementação de soro fetal bovino em pelo menos 50% sem alteração na taxa de crescimento ou morfologia.
Silenciador Select pré-projetado e SiRNA validado	Ambion	4390824	interferência de RNA (RNAi) é a melhor maneira de reduzir efetivamente a expressão gênica para estudar a função da proteína em uma ampla gama de tipos de células.
Reagente de transfecção de lipofectamina RNAiMAX	Invitrogen	13778075	O reagente de transfecção de lipofectamina RNAiMAX oferece uma solução avançada e eficiente para a entrega de siRNA. Nenhum outro reagente de transfecção específico de siRNA fornece entrega de siRNA tão fácil e eficiente em uma ampla variedade de linhagens celulares, incluindo tipos de células comuns, células-tronco e células primárias, bem como tipos de células tradicionalmente difíceis de transfectar.
Camundongo anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	concentração de trabalho: 1:400 em solução de leite a 5%
cabra anti-rato IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	concentração de trabalho: 1:10000 em solução de leite a 5%
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	este é um inibidor de serina proteases e acetilcolinesterase
Termociclador para RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	permite homogeneidade de temperatura e uma velocidade de rampa de até 3° C/seg. O protocolo pode ser realizado também com outros termocicladores
Instrumento RT-PCR em tempo real Sistema RT-PCR	Applied Biosystems	7500	Esta é uma plataforma de cinco cores que usa reagentes de reação em cadeia da polimerase (PCR) baseados em fluorescência para fornecer uma quantificação relativa usando o tipo de ensaio CT comparativo. O protocolo pode ser realizado também com outros termocicladores
Espectrofotômetros de microvolume	Thermo Scientific	Nanodrop	Fornece uma medição de nucleide ácido precisa e rápida usando pouco volume de amostra
Sistema de blotting	Sistema Bio-Rad	Trans-Blot Turbo	Realiza uma transferência semy-seca em poucos minutos
Sistema de aquisição de imagem e documentação de gel	Bio-Rad	Chemidoc sistema	É fácil de usar para detecção quimioluminescente