À procura de caminhos de Driver do adquiriu resistência à terapia-alvo: geração de Subclone resistentes aos medicamentos e sensibilidade restaurando pelo Gene Knock-down

Resumo

Este é um protocolo de tempo - e cost - effective em vitro investigando os mecanismos de resistência adquirida aos agentes terapêuticos alvo, que é uma necessidade médica altamente insatisfeita na gestão de câncer.

Resumo

Nas últimas duas décadas têm visto a troca de drogas citotóxicas para terapia-alvo em Oncologia Médica. Embora alvo de agentes terapêuticos têm demonstrado eficácia clínica mais impressionante e minimizados os efeitos adversos do que os tratamentos tradicionais, resistência a drogas tornou-se a principal limitação para seus benefícios. Vários modelos pré-clínicos/in vitro/in vivo da resistência adquirida aos agentes alvo na prática clínica foram desenvolvidos principalmente por meio de duas estratégias: i) genéticas para genótipos de resistência adquirida e ii) in vitro de modelagem / vivo em seleção de modelos resistentes. No presente trabalho, propomos um quadro unificador, para investigar os mecanismos subjacentes responsáveis pela resistência adquirida ao alvo agentes terapêuticos, a partir da geração de subclones celulares resistentes à descrição do silenciar os procedimentos utilizados para restaurar a sensibilidade ao inibidor. Este tempo - e cost - effective abordagem simples é amplamente aplicável e pode ser facilmente estendida para investigar mecanismos de resistência a outras drogas terapêuticas alvo no tumor diferente histotypes.

Introdução

Acompanhando as descobertas cruciais em biologia molecular e celular, um número de novas moléculas anticâncer sintetizados foram desenvolvido para alvejar seletivamente vias de sinalização oncogênicas em uma ampla gama de tipos de tumor. Em particular, duas categorias de agentes terapêuticos direcionados com propriedades únicas em Oncologia, os compostos químicos sintéticos ou seja e recombinantes anticorpos monoclonais, são conhecidos por alcançaram sucessos clínicos e tratamento do câncer drasticamente alterado em últimas décadas^1,2,3.

No entanto....

Protocolo

Nota: Este protocolo foi especificamente ajustado para a análise dos mecanismos subjacentes a resistência adquirida ao Trastuzumabe de linhas de células de câncer gástrico HER-positivo. Todos os instrumentos de laboratório necessários são relatados na Tabela de materiais.

1. geração de alvo Subclones resistente à terapia

Nota: Este é o mais crítico e difícil padronizar passo no protocolo, devido ao fato de que linhagens celulares diferentes podem apresentar diferentes sensibilidades ao alvo terapêutico inibidor independentemente de sua concentração de histotype ou drogas de tumor usado.

Resultados

A Figura 1 descreve a estrutura do procedimento experimental. Linhas de células de câncer gástrico de três expressando um alto nível de HER2 e sensível ao trastuzumab (IC₅₀ < nível plasmático de pico do gráfico de drogas, Figura 2A, à esquerda) foram cultivadas em meio de cultura contendo o agente alvo terapêutico. Uma dose 10-fold inferiores a concentração plasmática de pico de trastuzumab (10 µ g/mL) foi definida .......

Discussão

Enquanto personalizado e direcionado terapias têm suscitou entusiasmo crescente, estas terapias 'inteligentes' so-called enfrentam o obstáculo principal mesmo como drogas de quimioterapia tradicional, ou seja, a aquisição rápida e imprevisível de resistência às drogas. Para melhorar os resultados da terapia-alvo, os problemas de resistência aos medicamentos devem ser resolvidos através de uma melhor compreensão dos mecanismos que os provocam. Aqui, apresentamos uma metodologia amplamente acessível em vitro <.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente Trizol	Invitrogen	15596026	O Reagente TRIzol é um reagente para isolar RNA total de alta qualidade ou isolar simultaneamente RNA, DNA e proteína de uma variedade de amostras biológicas KIT DE SÍNTESE DE
CDNA ISCRIPT	Bio-Rad	1708891	O kit de síntese de cDNA iScript é um kit de síntese de cDNA de primeira fita sensível e fácil de usar para análise de expressão gênica usando qPCR em tempo real.
Ensaio de expressão gênica TaqMan	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems Os ensaios de expressão gênica TaqMan consistem em um par de primers de PCR não rotulados e uma sonda TaqMan com um rótulo de corante FAM ou VIC da Applied Biosystems na extremidade 5' e aglutinante de ranhura menor (MGB) e atenuante não fluorescente (NFQ) na extremidade 3'.
Reagente de Extração de Proteína de Mamífero M-PER	Thermo Scientific	78501	O Reagente de Extração de Proteína de Mamífero M-PER da Thermo Scientific é projetado para fornecer extração de proteína solúvel total altamente eficiente de células de mamíferos cultivadas.
Coquetel de Inibidores de Protease e Fosfatase Halt (100X)	Thermo Scientific	78440	O Coquetel de Inibidores de Protease e Fosfatase Halt da Thermo Scientific (100X) oferece a conveniência de uma única solução com proteção total de amostras de proteína para lisados de células e tecidos.
Kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA	Thermo Scientific	23225	O Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce da Thermo Scientific é um conjunto de reagentes de ensaio de dois componentes, de alta precisão, compatíveis com detergente, para medir (A562nm) a concentração total de proteína em comparação com um padrão de proteína.
4x Tampão de Amostra Laemmli	Bio-Rad	1610747	Use 4x Tampão de Amostra Laemmli para preparação de amostras para SDS PAGE. Para a redução das amostras, adicione um agente redutor, como o 2-mercaptoetanol, ao tampão antes de misturar com a amostra.
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldados	Bio-Rad	456-1094	géis TGX (Tris-Glycine eXtended) de longa duração têm uma nova formulação e podem ser usados tanto para separações de proteínas desnaturantes padrão quanto para eletroforese nativa.
Padrões de Blotting Ocidental da Proteína Precision Plus	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards estão disponíveis nos formatos Dual Color, All Blue, Kaleidoscope e Dual Xtra. Todos os quatro têm os mesmos padrões de migração de gel, com 3 bandas de referência de alta intensidade (25, 50 e 75 kD).
10x Tris/Glicina/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glicina/SDS é um tampão de corrida pré-misturado para separação de amostras de proteínas por SDS-PAGE.
Pacotes de Transferência de PVDF Mini Trans-Blot Turbo	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini Pacotes de Transferência de PVDF para transferência rápida e eficiente de proteínas de mini géis usando o Sistema de Transferência Trans-Blot Turbo. Cada pacote de transferência selado a vácuo, pronto para uso, contém duas pilhas de reservatórios de íons saturados com tampão e uma membrana de PVDF pré-umedecida.
Conjugado de Proteína de Precisão StrepTactin-HRP	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugado para detecção quimioluminescente ou colorimétrica de Padrões de Proteína Não Corada de Proteína Precision Plus ou Padrões de Proteína WesternC de Proteína Precision Plus em western blots.
Solução Immun-Star WesternC A solução	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC, um método de detecção de proteínas, detecta quantidades de proteína no meio do femtograma.
Controle Negativo Universal	Invitrogen	12935300	O siRNA de Controle Negativo não tem semelhança significativa de sequência com sequências genéticas de camundongos, ratos ou humanos. O controle também foi testado em telas baseadas em células e provou não ter efeito significativo na proliferação, viabilidade ou morfologia celular.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium é um meio essencial mínimo (MEM) aprimorado que permite uma redução da suplementação de soro fetal bovino em pelo menos 50% sem alteração na taxa de crescimento ou morfologia.
Silenciador Select pré-projetado e SiRNA validado	Ambion	4390824	interferência de RNA (RNAi) é a melhor maneira de reduzir efetivamente a expressão gênica para estudar a função da proteína em uma ampla gama de tipos de células.
Reagente de transfecção de lipofectamina RNAiMAX	Invitrogen	13778075	O reagente de transfecção de lipofectamina RNAiMAX oferece uma solução avançada e eficiente para a entrega de siRNA. Nenhum outro reagente de transfecção específico de siRNA fornece entrega de siRNA tão fácil e eficiente em uma ampla variedade de linhagens celulares, incluindo tipos de células comuns, células-tronco e células primárias, bem como tipos de células tradicionalmente difíceis de transfectar.
Camundongo anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	concentração de trabalho: 1:400 em solução de leite a 5%
cabra anti-rato IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	concentração de trabalho: 1:10000 em solução de leite a 5%
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	este é um inibidor de serina proteases e acetilcolinesterase
Termociclador para RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	permite homogeneidade de temperatura e uma velocidade de rampa de até 3° C/seg. O protocolo pode ser realizado também com outros termocicladores
Instrumento RT-PCR em tempo real Sistema RT-PCR	Applied Biosystems	7500	Esta é uma plataforma de cinco cores que usa reagentes de reação em cadeia da polimerase (PCR) baseados em fluorescência para fornecer uma quantificação relativa usando o tipo de ensaio CT comparativo. O protocolo pode ser realizado também com outros termocicladores
Espectrofotômetros de microvolume	Thermo Scientific	Nanodrop	Fornece uma medição de nucleide ácido precisa e rápida usando pouco volume de amostra
Sistema de blotting	Sistema Bio-Rad	Trans-Blot Turbo	Realiza uma transferência semy-seca em poucos minutos
Sistema de aquisição de imagem e documentação de gel	Bio-Rad	Chemidoc sistema	É fácil de usar para detecção quimioluminescente

Os Imagem