Proteína de integrase espumosa vírus recombinante protótipo é frequentemente contaminada com uma nuclease bacteriana durante a purificação. Este método identifica a contaminação da nuclease e remove-lo a preparação final da enzima.
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Artigo de método
Deteção e remoção de contaminação de Nuclease durante a purificação do protótipo recombinante vírus espumoso Integrase
Neste artigo
Resumo
Resumo
A proteína integrase (IN) do vírus espumoso da retrovírus protótipo (PFV) é uma enzima de modelo para o estudo do mecanismo de integração retroviral. Comparado a pol de outros retrovírus, PFV IN é mais solúvel e mais receptivos a manipulação experimental. Além disso, é sensível a inibidores de IN clinicamente relevantes vírus de imunodeficiência humana (HIV-1), sugerindo que o mecanismo catalítico da PFV IN é semelhante do HIV-1 IN. IN catalisa juntarem covalente viral DNA complementar (cDNA) para o alvo DNA em um processo chamado transferência de vertente. Esta reação de transferência de vertente apresenta cortes de ADN do alvo. Análise dos produtos de reacção de integração pode ser confundida pela presença de nucleases que nick da mesma forma o DNA. Uma nuclease bacteriana foi mostrado para purificar co com PFV recombinante expressa em Escherichia coli (e. coli). Aqui nós descrevemos um método para isolar PFV IN das nucleases contaminantes por cromatografia de afinidade de heparina. Frações são facilmente rastreadas por contaminação de nuclease com um plasmídeo supercoiled e eletroforese em gel de agarose. PFV IN e o contaminante nuclease exibem afinidades alternativas para heparina sepharose permitindo uma preparação livre de nuclease da recombinação PFV IN adequado para análise de bioquímica ou única molécula em massa de integração.
Introdução
Estudos bioquímicos e única molécula de interações da proteína com DNA requerem proteínas recombinantes excepcionalmente puras. Contaminar as nucleases de bactérias pode obscurecer os resultados desses ensaios. Um contaminante nuclease foi encontrado em preparações à base de proteínas recombinantes oxigênio ao tesouro protocatechuate-3,4-dioxigenase (PCD) e protótipo vírus espumoso (PFV) integrase (IN) isolados de Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.
Ensaios de integração retroviral dependem a conversão de DNA supercoiled produtos....
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Protocolo
1. induzir PFV em expressão em e. coli
-
Adicionar 1 μL do plasmídeo de expressão IN PFV (10 ng/μL) de 20 μL de Escherichia coli BL21(DE3) pLysS (20 alíquota μL de células disponíveis comercialmente tem > 2 x 106 UFC/μg plasmídeo) em um tubo de 1,5 mL. Misture suavemente pelo dedo tocar ou passar rapidamente o tubo. Incubar em gelo 5 min.
- Aqueça o choque por exatamente 30 s em um 42 ˚ c banho de água e em seguida, retornar imediatamente para gelo por 2 min.
- Adicione 80 µ l de caldo super ideal de temperatura com meios de repressão (SOC) catabolite. Incube durante 1 h a 37 ˚ c....
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Resultados
Recombinante PFV em muitas vezes está contaminado com uma nuclease bacteriana1. Ensaios bioquímicos integração dependem a quantificação da conversão do plasmídeo supercoiled DNA para círculos relaxados e produtos lineares. A presença de uma contaminante nuclease poderia levar a quantificação espúria destes ensaios. Expressão da PFV IN com um tag de hexahistidine é induzida em e. coli (Figura 1) e primeiro purificado por cromatografia de afinidade de níquel (<.......
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Discussão
Proteínas recombinantes que interagem com o DNA, tais como proteínas, catadores de oxigênio para aplicações de microscopia única molécula ou integrases retroviral, de reparação do DNA devem ser livres de contaminação bacteriana nucleases2,3. Estes contaminantes podem confundir a interpretação dos resultados durante os ensaios bioquímicos ou única molécula de granel.
Achamos que uma nuclease bacteriana frequentemente co purifica com PFV.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH AI099854 e AI126742 a chave.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BL21/DE3 Rosetta E. coli | EMD Millipore | 70956-4 | |
| LB caldo | EMD biosciences | 1.10285.0500 | |
| Ampicilina | Amresco | 0339 | |
| Cloranfenicol | Amresco | 0230 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| IPTG | Denville Scientific | CI8280 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| PMSF | Amresco | 0754 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I0250 | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510 | |
| Brometo de Etídio | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Heparina Sepharose 6 | Flow GE Healthcare Life Sciences | 17-0998-01 | |
| HRV14 3C protease | Produtos Químicos EMD | 71493-3 |
Referências
- Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease....
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Reimpressões e permissões
