Imobilização local-dirigido da Proteína morfogenética óssea 2 para superfícies sólidas pela química do clique

Resumo

Biomateriais dopados com 2 de Proteína morfogenética óssea (BMP2) utilizaram-se como uma nova estratégia terapêutica para curar fraturas não-união óssea. Para superar os efeitos secundários resultantes de uma incontrolável liberação do fator, propomos uma nova estratégia para o site-imobilizar diretamente o fator, criando assim materiais com capacidade osteogênica melhorada.

Resumo

Diferentes estratégias terapêuticas para o tratamento de não-cura ossos longos defeitos foram intensamente investigadas. Atualmente usado tratamentos presentes várias limitações que conduziram ao uso de biomateriais em combinação com fatores de crescimento osteogênicos, tais como proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs). Métodos comumente usados de absorção ou encapsulamento requerem quantidades supra fisiológicos de BMP2, geralmente resultando em um efeito de lançamento do chamado surto inicial que provoca vários graves efeitos colaterais. Uma estratégia possível para superar esses problemas seria casal covalentemente a proteína para o cadafalso. Além disso, acoplamento deve ser realizado de forma específica a fim de garantir um resultado de produto reprodutível. Por isso, criámos uma variante BMP2, em que um aminoácido artificial (propargil-L-lisina) foi introduzido a parte madura da proteína BMP2 pela expansão de uso de códon (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk foi acoplado ao funcionalizados grânulos através de cobre catalisada azida-alquino cicloadição (CuAAC). A atividade biológica da BMP2-K3Plk acoplado foi comprovada em vitro e a atividade osteogênica dos grânulos BMP2-K3Plk-acrescida foi comprovada em ensaios de célula com base. Os grânulos funcionalizados em contacto com células de C2C12 foram capazes de induzir a expressão de fosfatase alcalina (FAL ou ALP) na proximidade localmente restrita do cordão de. Assim, por esta técnica, funcionalizados andaimes podem ser produzidos que podem desencadear a diferenciação celular, no sentido de uma linhagem osteogênica. Além disso, doses mais baixas de BMP2 são suficientes devido à orientação controlada do local-dirigido BMP2 acoplado. Com este método, BMPs são sempre expostos aos seus receptores na superfície das células na orientação adequada, que não é o caso, se os factores são acoplados através de técnicas de acoplamento non-local-dirigido. O resultado do produto é altamente controlável e, portanto, resulta em materiais com propriedades homogêneas, melhorando sua aplicabilidade para a reparação do tamanho crítico óssea defeitos.

Introdução

O objetivo final da regeneração óssea tecido engenharia e osso é superar as desvantagens e limitações ocorrem durante tratamentos comuns de fraturas não-sindicalizados. Auto - ou allo-transplantes são utilizados predominantemente como estratégias de terapia atual, mesmo que ambos têm várias desvantagens. O enxerto ósseo ideal deve induzir osteogênese, osteoindução, bem como osteocondução, levando-à osteointegração do enxerto no osso. Hoje em dia, apenas autotransplante é considerado como o "padrão ouro" uma vez que fornece todas as características de um enxerto ideal. Infelizmente, ele também apresenta importantes aspectos negativos, tais como tempos de cirurgias longas e um segundo local de trauma que normalmente implica mais complicações (por exemplo, dor crônica, formações de hematoma, infecções, defeitos cosméticos, etc.). Enxerto alogênico, por outro lado tem características ideais para todos os aspectos gerais¹. Tecnologias de enxerto de osso alternativos foram melhoradas nos últimos anos, com o objectivo de produzir andaimes osteoindutora, osteocondutora, biocompatível, e biorreabsorvível. Desde que muitos biomateriais não mostram todas estas características osteogênicas, diferentes fatores de crescimento, principalmente BMP2 e BMP7, foram incorporadas a fim de melhorar o potencial osteogênico do andaime particular².

Como um critério essencial, tais sistemas de entrega de fator de crescimento deve fornecer uma liberação de dose controlada ao longo do tempo a fim de facilitar os eventos essenciais como recrutamento celular e acessório, crescimento celular e angiogênese. No entanto, BMPs, bem como outros fatores de crescimento osteogênicos têm sido comumente imobilizada não ligado covalentemente³. Uma armadilha e adsorção técnicas requerem o uso de montantes suprafisiológica da proteína devido a uma liberação de surto inicial, que leva a graves desvantagens em vivo, normalmente afetar os tecidos circunvizinhos através da indução de supercrescimento ósseo, osteólise, inchaço e inflamação⁴. Assim, a retenção de fatores de crescimento no local da entrega por longos períodos de tempo pode ser alcançada por métodos de imobilização covalente. Quimicamente modificados BMP2 (succinylated⁵, acetilado⁶ ou biotinilado⁷), engenharia de heterodímeros⁸ou BMP2 derivada oligopeptídeos⁹ foram concebidos e usados para superar as limitações relacionadas com a absorção. No entanto, a bio-atividade dessas construções não é previsível, desde que o arranjo potencialmente inibe a ligação do ligante imobilizado aos receptores celulares. Como mostrada anteriormente, é essencial que todos os quatro cadeias receptores envolvidas na formação de complexos receptor-ligante ativado interagirem com o imobilizado BMP2 para ativar completamente toda a jusante de cascatas de sinalização¹⁰.

Para superar os problemas de um resultado de produto não-homogênea, com limitações em termos de bioatividade, estabilidade e biodisponibilidade do factor de imobilizado, nós projetamos uma variante BMP capaz de ligar covalentemente andaimes de forma local-dirigido. Esta variante, denominado BMP2-K3Plk, é composto por um aminoácido artificial que foi introduzido pelo códon genético expansão¹¹. Esta variante tem sido associada com êxito a andaimes usando uma estratégia de acoplamento covalente, mantendo sua atividade biológica.

Protocolo

1. produção da variante BMP2 BMP2-K3Plk

1. Clonagem de BMP2-K3Plk por mutagenesis local-dirigido usando PCR ¹²
   1. Amplificar o humano BMP2 maduro (hmBMP2) de um vetor de p25N-hmBMP2 (ver Tabela de materiais) com um primer para a frente (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') e um primer reverso (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') introduzindo um âmbar stop códon ( TAG) na posição da primeira lisina de BMP2´s parte madura. Realizar a reação de PCR usando 33,5 µ l de H₂O, 10 µ l da mistura de reação de PCR, 1,5 µ l de 10 µM dNTP solução, 1,5 µ l de primer para a frente (10 pmol / µ l), 1,5 µ l de primer reverso (10 pmol / µ l), 1 µ l de p25N-hmBMP2 (10 ng / µ l) e 1 µ l de DNA polimerase (ver Tabela de materiais) em um termociclador (desnaturação a 95 ° C por 5 min, 30 ciclos de desnaturação a 95 ° C por 1 min, recozimento a 60 ° C por 1 min, alongamento a 72 ° C por 1 min e uma extensão final a 72 ° C por 10 min).
   2. Purificar o produto do PCR usando um kit disponível comercialmente, seguindo as recomendações do fabricante (ver Tabela de materiais).
   3. Digerir o produto PCR com a enzima de restrição NdeI a 37 ° C por 45 min usando 16 µ l de H₂O, 3 µ l de tampão de digestão, 10 µ l de DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l da enzima de restrição. Calor-inativar a enzima a 65 ° C por 5 min. digerir o produto PCR com a enzima de restrição BamHI a 37 ° C, durante 1 h, usando 16 µ l de H₂O, 3 µ l de tampão de digestão, 10 µ l de DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l da enzima de restrição. Calor-inativar enzimas a 80 ° C por 5 min.
   4. Digerir o vetor de pET11a-pyrtRNA com NdeI a 37 ° C por 2 horas e 45 minutos usando 16 µ l de H₂O, 3 µ l de tampão de digestão, 10 µ l de DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l da enzima de restrição. Calor-inativar a 65 ° C por 5 min. digerir o vetor de pET11a-pyrtRNA com BamHI a 37 ° C, durante 1 h, usando 16 µ l de H₂O, 3 µ l de tampão de digestão, 10 µ l de DNA (20 ng / µ l) e 1 µ l da enzima de restrição. Calor-inativar a 80 ° C por 5 min.
   5. Separar o vetor digerido do vetor não digerido e restos de digestão por agarose gel eletroforese (agarose 0,8%, 60 min a 100 V). Ligate a inserção BMP2-K3TAG digerida com backbone digerido pET11a-pyrtRNA à temperatura ambiente (RT) para 2 h, usando 100 ng de pET11a-pyrtRNA espinha dorsal e 34,5 ng da inserção BMP2-K3TAG (razão molar de 1:3). A mistura de reação contém a espinha dorsal de DNA e inserção, 2 µ l de tampão de ligase, 1 µ l de DNA ligase e H₂O para um volume total de 20 µ l.
   6. Execute uma transformação co de pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk e pyrtRNAsynth-pSRF-dueto em bactérias BL21(DE3):
      1. Adicionar 50 ng do cada do plasmídeo para as bactérias, coloque a mistura no gelo por 30 min, choque térmico a 42 ° C para 50 s, colocar no gelo por 5 min, adicione 500 µ l de caldo de lisogenia (LB) médio na mistura e agitar a 300 rpm para 60 min.
      2. Espalhar a 100 µ l da mistura bacteriana em pré-aquecido canamicina (50 µ g/mL) / placas de ampicilina (100 µ g/mL) e incubar durante uma noite a 37 ° C.
2. Expressão e purificação de BMP2-K3Plk ^{13 , 14}
   1. Propagar uma única colônia durante a noite em 50 mL de meio LB com 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilina a 37 ° C.
   2. Diluir uma noite culturas 01:20 em 800 mL de meio de caldo fantástico (TB), suplementado com 50 µ g/mL de canamicina e 100 µ g/mL de ampicilina e cresce a 37 ° C, até que seja alcançada uma OD₆₀₀ de 0,7. Adicione propargil-L-lisina para uma concentração final de 10 mM. Recolha uma amostra de 100 µ l da cultura antes da indução (IPTG) de β-D-1-thiogalactopyranoside isopropílico.
   3. Induzi a expressão do gene através da adição de IPTG para uma concentração final de 1 mM. Cresce a cultura a 37 ° C durante 16 h em um agitador orbital a 180 rpm. Recolha uma amostra de 100 µ l da cultura.
   4. Centrifugar a cultura toda a 9000 x g durante 30 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado bacteriano em 30 mL de tampão TBSE (10 mM Tris, 150 mM NaCl, ácido de 1 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) com 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoetanol (recém adicionado).
      Atenção: Lidar com 2-Mercaptoetanol sob a coifa. Evite contato com pele e olhos. Evite a inalação do vapor ou névoa. Execute todas as etapas de ressuspensão com buffers contendo 2-Mercaptoetanol sob a coifa.
   5. Pesar um copo vazio centrifugar e transferir ressuspenso para o copo vazio. Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar o béquer com a pelota. Subtrai o peso do copo vazio para calcular o peso do sedimento.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Congele a pelota a-20 º C a curto prazo ou a-80 ° C, a longo prazo. Após retomar o protocolo, descongelar a pelota no RT
   6. Resuspenda o pellet em buffer STE (1 mM EDTA, sacarose 375 mM, pH de 10 mM Tris 8.0; 150 mM NaCl; 1: 1000 (v/v) 2-mercaptoetanol (recém adicionado)). 200 mL de tampão STE de uso para cada 10g de pelota.
   7. Proceda à sonicação a suspensão no gelo (10 min com 40 pulso s, freio de s 20 e 30% de amplitude). Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar a pelota. Repita as etapas sonication e centrifugação 4 vezes.
   8. Resuspenda o pellet em 100 mL de tampão TBS (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar da pelota.
   9. Resuspenda o pellet em buffer nuclease (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl₂) com recém adicionado nuclease 80 U/mL (por exemplo, Benzonase) usando 10 mL/g de pelota. Incube durante a noite a suspensão de RT em uma placa de agita (30 rpm).
   10. Adicionar o buffer de Triton (60 mM EDTA, 1,5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenil-polietileno glicol) para a suspensão. O volume de reserva de Triton para adicionar corresponde a uma parte de volume de 0,5 da suspensão. Incube durante 10 minutos a RT (sem agitação). Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar a pelota.
   11. Resuspenda o pellet em tampão TE (100 mM Tris, 20 mM de EDTA) usando 8 mL/g de pelota. Centrifugar a 6.360 x g por 20 min. descartar o sobrenadante e pesar a pelota.
   12. Resuspenda o pellet adicionando 4 mL/g de pH de NaAc 25mm 5.0 e 5 mL/g de 6 M GuCl com 1 mM ditiotreitol (DTT) (recém adicionado). Incube a suspensão durante a noite a 4 ° C, em uma placa de agita (30 rpm).
   13. Centrifugar a 75.500 x g por 20 min. O sobrenadante agora contém a proteína monomérica desdobrada do BMP2. Recolha o sobrenadante e concentrar-neste extrato para OD/20ml usando uma membrana de corte (MWCO) de peso molecular de 3 kDa em uma concentração de células (veja a Tabela de materiais).
   14. Adicione os monómeros concentrados em única gotas para o buffer de renaturalização (2m LiCl, 50 mM Tris, caps de 25 mM, 5 mM EDTA, dissulfeto de glutationa 1mm (GSSG), 2mm glutationa (GSH)) agitando (30 rpm). Incube a RT por 120 h no escuro.
       Nota: Durante este período de incubação, reenovelamento occours. A solução desta etapa em diante contém o dobrado dimérica BMP2-K3Plk.
   15. Ajuste o pH da solução a 3.0 usando concentrado HCl. Dialyze a solução contra 1mm. HCl concentrado a solução dializada usando uma membrana de corte (MWCO) de peso molecular de 10 kDa em uma célula de concentração.
   16. Equilibrar a solução adicionando reserva um (20mm NaAc, 30% de isopropanol). Adicione um volume de tampão A corresponde a um volume de 30% da solução. Centrifugue a solução a 4700 x g, durante 15 min.
   17. Equilibrar a coluna de troca iônica em um sistema cromatografia líquida (FPLC) proteína rápida¹⁵ com 150 mL de tampão r. Load solução da proteína para a coluna equilibrada. Eluir frações usando um gradiente linear de buffer B (20mm NaAc, 30% de isopropanol, 2 M NaCl) com 100 mL de frações de mL de tampão B. coletar 2.
       Nota: Concentre a proteína antes do embarque para a coluna de acordo com o volume total da coluna. O volume final da proteína deve ser < 5% do volume total da coluna.
   18. Analise 20 µ l de cada fração por SDS poliacrilamida (12%) gel de eletroforese (SDS-PAGE) ¹⁶ e de coloração azul brilhante de Coomassie¹⁷ (ver Tabela de materiais).
       Nota: O azul Coomassie brilhante manchado fracções de espectáculos de gel de SDS-PAGE contendo dímeros (26 kDa) e frações contendo monômeros (13 kDa).
   19. Fracções de dímero-contendo piscina. Dialize da piscina do dímero contendo frações durante a noite a 4 ° C, contra 1 mM HCl (volume de 5 litros). Concentre-se no produto final usando um kDa 10 unidade de filtro centrífugo de concentração (ver Tabela de materiais). Analise o produto final por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (12%) (SDS-PAGE) e coloração azul de Coomassie brilhante.
       Nota: A banda sobre o azul Coomassie brilhante manchado de SDS-PAGE gel deve mostrar apenas uma banda em 26 kDa. Este é o produto final da BMP2-K3Plk.

2. otimização de cobre (I)-catalisada Alkyne-azida condições de cicloadição (CuAAC)

1. Efeito de ascorbato de sódio (NaAsc) e sulfato de cobre (II) (CuSO ₄ ) _{no tipo selvagem BMP2 (BMP2-WT)}
   1. Incubar a 20 µM BMP2-WT com diferentes proporções de NaAsc de CuSO₄. Usar NaAsc de 0.5 mM e 0,5 mM CuSO₄ (concentração de partida) em um volume de 50 µ l. Prossiga com as seguintes proporções de NaAsc de CuSO₄: (1:1), (1.7:1), (10:1), (20: 1), mantendo a CuSO₄ concentração constante de 0,5 mM e ajustando a concentração de NaAsc adequadamente. Realizar a reação em H₂O em um misturador rotativo (20 rpm) durante a noite no RT
   2. Preparar amostras reduzidas pela adição de tampão de carregamento contendo 5% 2-Mercaptoetanol e incubar a amostra a 95 ° C por 6 min. Analyze reduzido e amostras não-reduzida por SDS poliacrilamida gel (12%) eletroforese (SDS-PAGE) e coloração azul de Coomassie brilhante. O Coomasie manchado geles de SDS-PAGE mostrar bandas na faixa de 13 kDa (condições reduzidas) para 26 kDa e maior peso molecular (condições não-reduzida).
2. Efeito de Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amina (THPTA) sobre a reação de CuAAC
   1. Incubar a 20 µM BMP2-K3Plk com diferentes proporções de THPTA de CuSO₄. Use 5 mM NaAsc e 200 µM 3-Azido-7-Hidroxicumarina (manter NaAsc e 3-Azido-7-Hidroxicumarina constante). Use 50 µM THPTA e 0,5 mM de CuSO₄ como concentrações de partida. Usar diferentes rácios de THPTA de CuSO₄: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). realizar reação em H₂O (volume total de 50 µ l) por 24 h no RT em um misturador rotativo (20 rpm).
   2. Em cima de acoplamento, 3-Azido-7-Hidroxicumarina torna-se um corante fluorescente. Preparar amostras em condições reduzidas e não reduzida e analisá-los por SDS-PAGE. Visualizar os géis sob o canal da excitação com o comprimento de onda específico para o 3-Azido-7-Hidroxicumarina (λ_abs = 404 nm; λ_em = 477 nm).

3. ligações covalentes acoplamento técnica da BMP2-K3Plk de azida acrescida de Agarose Beads

1. Incube 20 µM de BMP2-K3Plk ou BMP2-WT (usado como controlo negativo) com 20 µ l de grânulos de agarose azida-ativado em um volume total de 500 µ l no amortecedor da reação (0,1 M HEPES pH 7.0, ureia de 3,9 M, 50 µM CuSO₄, 250 µM THPTA, ascorbato de sódio de 5 mM) por 2 h em RT em um rotati misturador de ng (20 rpm). Pare a reação adicionando 5 mM EDTA (concentração final).
2. Incube a RT por 15 min em um misturador rotativo (20 rpm). Centrifugar as amostras a 20.000 x g por 1 min a RT. recolher os sobrenadantes.
3. Lave o sedimento contendo os grânulos três vezes com 1.000 µ l de tampão de₅₀₀ HBS (50 mM HEPES, 500 mM de NaCl), três vezes com 1.000 µ l de 4m MgCl₂e duas vezes com 1.000 µ l de soro de tampão fosfato (PBS). Em cada etapa de lavagem, centrifugar a 20.000 x g por 1 min em RT e coletar sobrenadantes. Grânulos de armazenamento acoplado em 1.000 µ l de PBS a 4 ° C.
   Cuidado: Não perturbe a pelota do grânulo ao remover o sobrenadante.

4. validando a presença e a atividade biológica do imobilizado BMP2-K3Plk usando vermelho Texas rotulado BMP Receptor eu um ectodomínio (BMPR-IA _CE )

1. Incubar a 50 µ l dos grânulos BMP2-K3Plk acrescida com 1 µM de Texas Red rotulada BMPR-IA_CE com 150 µ l de tampão de₅₀₀ HBS (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) no RT para 1 h em um misturador rotativo (20 rpm).
2. Centrifugue os grânulos a 20.000 x g por 1 min em RT. descartar o sobrenadante. Lave os grânulos com 1000 µ l de tampão de₅₀₀ HBS. Repita a etapa de lavagem adicional 3 vezes. Centrifugar 20.000 x g por 1 min em RT após cada etapa de lavagem.
3. Resuspenda os grânulos em 500 µ l de PBS e Pipetar 50 µ l em um slide de tampa de vidro. Defina o filtro de microscópio entre 561 ou 594 nm. Detectar o Texas Red – BMPR-IA_CE-BMP2-K3Plk acrescida grânulos usando fluorescente microscopia e tirar fotos.

5. medição da fosfatase alcalina (FAL ou ALP) expressão para provar a bioatividade In Vitro da BMP2-K3Plk produzido antes e após a reação de acoplamento.

1. Ensaio de fosfatase alcalina (FAL ou ALP)
   1. Cultura de células de C2C12 de promyoblastic (ATCC CRL-172) no meio modificado águia de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro Fetal de bezerro (FCS), 100 U/mL penicilina G e estreptomicina 100 µ g/mL a 37 ° C numa atmosfera umidificada no 5% CO₂.
   2. Sementes C2C12 de células em uma densidade de 3 × 10⁴ células/poço em uma microplaca de 96 poços. Deixe células anexar durante a noite. Remover médio e incubar as células C2C12 na presença de 0.5-200 nM de BMP2-WT ou BMP2-K3Plk em 100 µ l/poço de DMEM (FCS 2%, penicilina de U/mL 100 G e 100 µ g/mL Estreptomicina) a 37 ° C numa atmosfera umidificada em 5% de CO₂ por 72 h.
   3. Remover médio e lavam-se células com 100 µ l de PBS por bem. Lyse pilhas no RT por 1h com 100 µ l/poço de lise (1% NP-40, glicina 0,1 M, pH 9,6, 1 mM MgCl₂, 1mm ZnCl₂) em um tremendo da placa (220 rpm).
   4. Adicione 100 µ l/poço de buffer de ALP (glicina 0,1 M, pH 9,6, 1 mM MgCl₂, 1mm ZnCl₂) com 1 mg/mL p-nitrofenilfosfato (recém adicionado) para o lisado celular.
   5. Medir a absorção no 405 nm em um leitor multiplate depois de adicionar o buffer ALP e cada 5 min até que o desenvolvimento da cor é completo. Gerar curvas dose-resposta e valores CE50 usando um modelo logístico, y = A₂ + (A₁-A₂) / (1 + (x/x₀)^p).
2. Coloração da fosfatase alcalina (FAL ou ALP)
   1. Cultura de células de C2C12 de promyoblastic (ATCC CRL-172) em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com 10% de soro Fetal de bezerro (FCS), 100 U/mL penicilina G e estreptomicina 100 µ g/mL a 37 ° C numa atmosfera umidificada no 5% CO₂.
   2. Sementes C2C12 de células em uma densidade de 3 × 10⁴ células/poço em uma microplaca de 96 poços. Deixe células anexar durante a noite. Médio de remover e adicionar 20 µ l/poço de grânulos BMP2-K3Plk acoplado. BMP2-K3Plk acoplado grânulos estão em 1000 µ l de uma suspensão de PBS.
   3. Prepare uma solução de agarose de baixo ponto de fusão de 0,4% em DMEM. Derreter no microondas (600 W por 3 min) e deixe arrefecer no banho-maria a 37 ° C até o uso.
   4. Adicione 20 µ l de agarose de baixo ponto de fusão de 0,4% em cada poço (coberta de grânulos e células). Centrifugação a 2000 x g por 5 min a 20 ° C. Adicione 80 µ l DMEM (FCS 2%, 100 U/mL penicilina G e 100 estreptomicina µ g/mL) e incubar a 37 ° C numa atmosfera umidificada em 5% de CO₂ por 72 h.
   5. Remova médio, tomando cuidado para não destacar o agarose solidificado de 0,4%. Adicionar 100 µ l/poço de 1 passo NBT/solução de substrato BCIP (cloreto de tetrazólio Nitro-azul, sal 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate p-toluidina).
   6. Analise a fosfatase alcalina coloração usando microscopia de luz, imediatamente após a coloração roxa torna-se aparente. Usar microscopia de campo claro e tirar fotos.

Resultados

Neste artigo, descrevemos um método para covalentemente acoplar uma nova variante BMP2, BMP2-K3Plk, grânulos de agarose acrescida de azida comercialmente disponíveis (Figura 1). A bioatividade da variante BMP2-K3Plk produzido foi validada pela indução da expressão do gene da fosfatase alcalina (FAL ou ALP) nas células C2C12. O teste in vitro mostra níveis semelhantes de ALP expressão induzidos pelo tipo selvagem BMP2 (BMP2-WT) e BMP2-K3Plk (

Discussão

Gerar variantes da proteína marcados pela expansão de códon genético permite a introdução de vários análogos de aminoácidos não naturais principalmente em qualquer posição da sequência primária da proteína. Em caso de BMPs como BMP2, comum tags como uma marca de 6-histidina (dele) só pode ser introduzido N-terminal, desde o fim de protein´s C-terminal é enterrado dentro da estrutura terciária da proteína e, portanto, não é acessível a partir do exterior. Em outras posições, o tamanho da marca introduziu muito provavelmen...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Material
1-Passo NBT/BCIP	Thermo Fisher	34042	Adicione solução às células
3-Azido-7-hidroxicumarina	BaseClick	BCFA-047-1	Produto químico usado para reação de clique
Agarose baixo ponto de fusão	Biozym	840101	Agarose para ensaio ALP
Grânulos de agarose azida	Jena Bioscience	CLK-1038-2	Grânulos usados para reação
BamHI (enzima de digestão rápida)	Thermo Fisher Scientific	FD0054	Enzima
de restrição Receptor BMP IA (BMP-IAEC)	--	--	Produzido em nosso laboratório
Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye	Thermo Fisher Scientific	20279	Produto químico usado para Coomassie Coloração azul brilhante de SDS PAGE
Sulfato de cobre (II) anidro (CuSO4)	Alfa Aesar	A13986	Produto químico usado para reação de clique
DNA Polimerase e tampão de reação	Kapabiosystems	KK2102	KAPA HiFi Kit de PCR
Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM) GlutaMAX	Gibco	61965-026	Meio de cultura celular
etilenodiaminotetracético (EDTA)	Sigma Aldrich GmbH	E5134-1kg	Produto químico usado para parar a reação de clique
Isopropil ß-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)	Carl Roth GmbH	2316.5	Indução de bactérias (concentração final de 1mM)
NdeI (enzima de digestão rápida)	Thermo Fisher Scientific	ER0581	Enzima de restrição
Life technologies	por NHS	T6134	Acoplado ao receptor
P- Nitrofenil Fosfato	Sigma Aldrich GmbH	N4645-1G	Fosfatase Alcalina
p25N-hmBMP2	--	--	Plasmídeo gentilmente fornecido por Walter Sebald para J. Nickel
pET11a-pyrtRNA	--	--	Fornecido pela Cátedra de Farmácia e Biofarmácia, Universidade de Wuerzburg
propargyl-L-lisina (Plk)	--	--	Fornecido pela Cátedra de Farmácia e Biofarmácia, Universidade de Wuerzburg
pSRFduet-pyrtRNAsynth	--	--	Fornecido pela Cátedra de Farmácia e Biofarmácia, Universidade de Wuerzburg
Kit de Extração de Gel Qiagen Qiagen		28704	Kit
Purificação de Gel Qiagen Kit de Purificação de PCR	Qiagen	28104	Purificação de PCR
L-ascorbato de sódio	Sigma Aldrich GmbH	A7631-100G	Produto químico usado para reação de clique
T4 DNA Ligase	ThermoScientific	EL0011	Ligação
tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (THPTA)	BaseClick	BCMI-006-100	Produto químico usado para reação de clique
4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol	Sigma Aldrich GmbH	X100-1L	Triton X 100
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Equipamento
Amicon célula concentradora 400 ml	Concentração	Merck KGaA	UFSC40001
Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 Unidade	Centrífuga de Concentração	Merck KGaA	UFC901024
Ä KTA avant FPLC&	Auml; KTA-	-	Máquina FPLC
Avanti J-26XP	Beckman Coulter	393124	Centrífuga para cultura bacteriana
Incubadora de agitação bacteriana	Infors HT		Incubadora de agitação para cultura bacteriana
FluorChem Q system	proteinsimple	--	Sistema de imagem e análise para SDS-PAGE
Fluorescente miscroscópio	Keyence	BZ-9000 (BIOREVO)
Fractogel® EMD SO3- (M)	Merck KGaA	116882	coluna de cromatografia por troca iônica
Greiner CELLSTAR®   Placas de 96 poços	Sigma	M5811-40EA	Placas de 96 poços para cultura de células (ALP Assay)
Heraeus Multifuge X1R	ThermoScientific	--	Centrífuga
M-20 Microplate Rotor de balde oscilante	ThermoScientific	75003624	Rotor para Microcentrífuga para placa durante a coloração ALP
Microcentrífuga - 5417R	Eppendorf	--	Centrífuga
OriginPro 9.1 G	OriginLab	--	software para análise estática de dados de ensaio ALP
Lâminas de Polisina	de	microscópio	ThermoScientific
Rotor JA-10	Beckman Coulter	--	rotor para centrífuga Avanti J-26XP
Rotor JLA 8.1	Beckman Coulter	--	rotor para centrífuga Avanti J-26XP
Rotor JA 25.50	Beckman Coulter	--	rotor para centrífuga Avanti J-26XP
Tecan infinite M200 leitor multiplaca	Tecan Deutschland GmbH	--	leitor multiplaca para termociclador de ensaio ALP
- Labcycler Gradient	SensoQuest GmbH	--	PCR
TxRed - filtro de microscópio	Filtro Keyence		para microscópio fluorescente
Discos de celulose regenerada por ultrafiltração 3 kDa	Merck KGaA	PLBC04310	usado com célula de concentração de amicon 400ml
Discos de celulose regenerada de ultrafiltração 10 kDa	Merck KGaA	PLGC04310	usado com célula de concentração de amicon 400ml