Biomateriais dopados com 2 de Proteína morfogenética óssea (BMP2) utilizaram-se como uma nova estratégia terapêutica para curar fraturas não-união óssea. Para superar os efeitos secundários resultantes de uma incontrolável liberação do fator, propomos uma nova estratégia para o site-imobilizar diretamente o fator, criando assim materiais com capacidade osteogênica melhorada.
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Artigo de método
Imobilização local-dirigido da Proteína morfogenética óssea 2 para superfícies sólidas pela química do clique
Neste artigo
Resumo
Resumo
Diferentes estratégias terapêuticas para o tratamento de não-cura ossos longos defeitos foram intensamente investigadas. Atualmente usado tratamentos presentes várias limitações que conduziram ao uso de biomateriais em combinação com fatores de crescimento osteogênicos, tais como proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs). Métodos comumente usados de absorção ou encapsulamento requerem quantidades supra fisiológicos de BMP2, geralmente resultando em um efeito de lançamento do chamado surto inicial que provoca vários graves efeitos colaterais. Uma estratégia possível para superar esses problemas seria casal covalentemente a proteína para o cadafalso. Além disso, acoplamento deve ser realizado de forma específica a fim de garantir um resultado de produto reprodutível. Por isso, criámos uma variante BMP2, em que um aminoácido artificial (propargil-L-lisina) foi introduzido a parte madura da proteína BMP2 pela expansão de uso de códon (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk foi acoplado ao funcionalizados grânulos através de cobre catalisada azida-alquino cicloadição (CuAAC). A atividade biológica da BMP2-K3Plk acoplado foi comprovada em vitro e a atividade osteogênica dos grânulos BMP2-K3Plk-acrescida foi comprovada em ensaios de célula com base. Os grânulos funcionalizados em contacto com células de C2C12 foram capazes de induzir a expressão de fosfatase alcalina (FAL ou ALP) na proximidade localmente restrita do cordão de. Assim, por esta técnica, funcionalizados andaimes podem ser produzidos que podem desencadear a diferenciação celular, no sentido de uma linhagem osteogênica. Além disso, doses mais baixas de BMP2 são suficientes devido à orientação controlada do local-dirigido BMP2 acoplado. Com este método, BMPs são sempre expostos aos seus receptores na superfície das células na orientação adequada, que não é o caso, se os factores são acoplados através de técnicas de acoplamento non-local-dirigido. O resultado do produto é altamente controlável e, portanto, resulta em materiais com propriedades homogêneas, melhorando sua aplicabilidade para a reparação do tamanho crítico óssea defeitos.
Introdução
O objetivo final da regeneração óssea tecido engenharia e osso é superar as desvantagens e limitações ocorrem durante tratamentos comuns de fraturas não-sindicalizados. Auto - ou allo-transplantes são utilizados predominantemente como estratégias de terapia atual, mesmo que ambos têm várias desvantagens. O enxerto ósseo ideal deve induzir osteogênese, osteoindução, bem como osteocondução, levando-à osteointegração do enxerto no osso. Hoje em dia, apenas autotransplante é considerado como o "padrão ouro" uma vez que fornece todas as características de um enxerto ideal. Infelizmente, ele também apresenta importantes aspectos negativos, tais como tempos de cirurgias long....
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Protocolo
1. produção da variante BMP2 BMP2-K3Plk
- Clonagem de BMP2-K3Plk por mutagenesis local-dirigido usando PCR 12
- Amplificar o humano BMP2 maduro (hmBMP2) de um vetor de p25N-hmBMP2 (ver Tabela de materiais) com um primer para a frente (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') e um primer reverso (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') introduzindo um âmbar stop códon ( TAG) na posição da primeira lisina de BMP2´s parte madura. Realizar a reação de PCR usando 33,5 µ l de H2O, 10 µ l da mistura de reação de PCR, 1,5 µ l de 10 µM dNTP solução, 1,5 µ l de primer para a frente (10 pmol / ....
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Resultados
Neste artigo, descrevemos um método para covalentemente acoplar uma nova variante BMP2, BMP2-K3Plk, grânulos de agarose acrescida de azida comercialmente disponíveis (Figura 1). A bioatividade da variante BMP2-K3Plk produzido foi validada pela indução da expressão do gene da fosfatase alcalina (FAL ou ALP) nas células C2C12. O teste in vitro mostra níveis semelhantes de ALP expressão induzidos pelo tipo selvagem BMP2 (BMP2-WT) e BMP2-K3Plk (
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Discussão
Gerar variantes da proteína marcados pela expansão de códon genético permite a introdução de vários análogos de aminoácidos não naturais principalmente em qualquer posição da sequência primária da proteína. Em caso de BMPs como BMP2, comum tags como uma marca de 6-histidina (dele) só pode ser introduzido N-terminal, desde o fim de protein´s C-terminal é enterrado dentro da estrutura terciária da proteína e, portanto, não é acessível a partir do exterior. Em outras posições, o tamanho da marca introduziu muito provavelmen.......
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Divulgações
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Agradecimentos
Os autores agradecer Dr. M. Rubini (Constança) fornecendo o plasmídeo codificação pyrrolysyl-tRNA e fornecer o correspondente aminoacil-tRNA sintetase de codificação pRSFduet-pyrtRNAsynth.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| 1-Passo NBT/BCIP | Thermo Fisher | 34042 | Adicione solução às células |
| 3-Azido-7-hidroxicumarina | BaseClick | BCFA-047-1 | Produto químico usado para reação de clique |
| Agarose baixo ponto de fusão | Biozym | 840101 | Agarose para ensaio ALP |
| Grânulos de agarose azida | Jena Bioscience | CLK-1038-2 | Grânulos usados para reação |
| BamHI (enzima de digestão rápida) | Thermo Fisher Scientific | FD0054 | Enzima |
| de restrição Receptor BMP IA (BMP-IAEC) | -- | -- | Produzido em nosso laboratório |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye | Thermo Fisher Scientific | 20279 | Produto químico usado para Coomassie Coloração azul brilhante de SDS PAGE |
| Sulfato de cobre (II) anidro (CuSO4) | Alfa Aesar | A13986 | Produto químico usado para reação de clique |
| DNA Polimerase e tampão de reação | Kapabiosystems | KK2102 | KAPA HiFi Kit de PCR |
| Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM) GlutaMAX | Gibco | 61965-026 | Meio de cultura celular |
| etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma Aldrich GmbH | E5134-1kg | Produto químico usado para parar a reação de clique |
| Isopropil ß-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) | Carl Roth GmbH | 2316.5 | Indução de bactérias (concentração final de 1mM) |
| NdeI (enzima de digestão rápida) | Thermo Fisher Scientific | ER0581 | Enzima de restrição |
| Life technologies | por NHS | T6134 | Acoplado ao receptor |
| P- Nitrofenil Fosfato | Sigma Aldrich GmbH | N4645-1G | Fosfatase Alcalina |
| p25N-hmBMP2 | -- | -- | Plasmídeo gentilmente fornecido por Walter Sebald para J. Nickel |
| pET11a-pyrtRNA | -- | -- | Fornecido pela Cátedra de Farmácia e Biofarmácia, Universidade de Wuerzburg |
| propargyl-L-lisina (Plk) | -- | -- | Fornecido pela Cátedra de Farmácia e Biofarmácia, Universidade de Wuerzburg |
| pSRFduet-pyrtRNAsynth | -- | -- | Fornecido pela Cátedra de Farmácia e Biofarmácia, Universidade de Wuerzburg |
| Kit de Extração de Gel Qiagen Qiagen | 28704 | Kit | |
| Purificação de Gel Qiagen Kit de Purificação de PCR | Qiagen | 28104 | Purificação de PCR |
| L-ascorbato de sódio | Sigma Aldrich GmbH | A7631-100G | Produto químico usado para reação de clique |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific | EL0011 | Ligação |
| tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (THPTA) | BaseClick | BCMI-006-100 | Produto químico usado para reação de clique |
| 4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol | Sigma Aldrich GmbH | X100-1L | Triton X 100 |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Equipamento | |||
| Amicon célula concentradora 400 ml | Concentração | Merck KGaA | UFSC40001 |
| Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 Unidade | Centrífuga de Concentração | Merck KGaA | UFC901024 |
| Ä KTA avant FPLC& | Auml; KTA- | - | Máquina FPLC |
| Avanti J-26XP | Beckman Coulter | 393124 | Centrífuga para cultura bacteriana |
| Incubadora de agitação bacteriana | Infors HT | Incubadora de agitação para cultura bacteriana | |
| FluorChem Q system | proteinsimple | -- | Sistema de imagem e análise para SDS-PAGE |
| Fluorescente miscroscópio | Keyence | BZ-9000 (BIOREVO) | |
| Fractogel® EMD SO3- (M) | Merck KGaA | 116882 | coluna de cromatografia por troca iônica |
| Greiner CELLSTAR® Placas de 96 poços | Sigma | M5811-40EA | Placas de 96 poços para cultura de células (ALP Assay) |
| Heraeus Multifuge X1R | ThermoScientific | -- | Centrífuga |
| M-20 Microplate Rotor de balde oscilante | ThermoScientific | 75003624 | Rotor para Microcentrífuga para placa durante a coloração ALP |
| Microcentrífuga - 5417R | Eppendorf | -- | Centrífuga |
| OriginPro 9.1 G | OriginLab | -- | software para análise estática de dados de ensaio ALP |
| Lâminas de Polisina | de | microscópio | ThermoScientific |
| Rotor JA-10 | Beckman Coulter | -- | rotor para centrífuga Avanti J-26XP |
| Rotor JLA 8.1 | Beckman Coulter | -- | rotor para centrífuga Avanti J-26XP |
| Rotor JA 25.50 | Beckman Coulter | -- | rotor para centrífuga Avanti J-26XP |
| Tecan infinite M200 leitor multiplaca | Tecan Deutschland GmbH | -- | leitor multiplaca para termociclador de ensaio ALP |
| - Labcycler Gradient | SensoQuest GmbH | -- | PCR |
| TxRed - filtro de microscópio | Filtro Keyence | para microscópio fluorescente | |
| Discos de celulose regenerada por ultrafiltração 3 kDa | Merck KGaA | PLBC04310 | usado com célula de concentração de amicon 400ml |
| Discos de celulose regenerada de ultrafiltração 10 kDa | Merck KGaA | PLGC04310 | usado com célula de concentração de amicon 400ml |
Referências
- Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. Bone substitutes: An update. Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).
- Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations.....
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Reimpressões e permissões
