Este manuscrito fornece um protocolo de análise de quebras de DNA dobro-costa pela microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.
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Artigo de método
Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks
Neste artigo
Resumo
Resumo
Quebras de DNA dobro-Costa (DSB) são graves lesões do ADN. Análise da formação e reparação do DSB é relevante em um amplo espectro de domínios de investigação, incluindo a integridade do genoma, genotoxicidade, biologia da radiação, envelhecimento, câncer e desenvolvimento de drogas. Em resposta ao ORL, o histona H2AX é fosforilado em serina 139 em uma região de vários pares de megabase formando discretos focos nucleares detectáveis pela microscopia de imunofluorescência. Além disso, 53BP1 (p53 binding protein 1) é outra importante proteína DSB-responsivo promover a reparação de DSB, juntando-se não-homólogos final-evitando a recombinação homóloga. De acordo com as funções específicas de γH2AX e 53BP1, a análise combinada de γH2AX e 53BP1 por microscopia de imunofluorescência pode ser uma abordagem razoável para uma análise detalhada de ORL. Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo, complementado com notas metódicas para executar a técnica. Especificamente, a influência do ciclo celular em padrões de focos γH2AX é demonstrada em fibroblastos normais da linha celular NHDF. Além disso, o valor dos focos de γH2AX como um biomarcador é retratado em linfócitos de raio-x irradiado de um indivíduo saudável. Finalmente, a instabilidade genética é investigada em células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda por microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.
Introdução
O DNA é danificado continuamente por endógenos (por exemplo, estresse de replicação, espécies reativas de oxigênio, instabilidade intrínseca do DNA) e exógenos (por exemplo, os radicais químicos, irradiação) fontes (Figura 1)1,2 ,3,4. Entre os danos do DNA, DNA dupla quebras (DSB) são particularmente graves lesões e podem induzir a morte celular ou carcinogênese. Cerca de 50 DSB pode surgir por célula e ciclo celular5. Em células de mamíferos, recombinação homóloga (HR)....
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Protocolo
todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê ética II de a Mannheim faculdade médica da Universidade de Heidelberg. Escrito foi obtido o consentimento de todos os indivíduos.
1. preparação de materiais
- solução anticoagulante: preparar uma solução anticoagulante de 200 heparina UI / mL de cloreto de sódio 0,9%. Encha cada um dos tubos de coleta (desenhar volume 9 mL) com 2 mL da solução anticoagulante antes da retirada das amostras de sangue ou de medula óssea.
- Solução de lise de eritrócitos: preparar a 10 x solução de lise de eritrócitos com 82,91 g de cloreto de amônio,....
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Resultados
Análise dos focos de γH2AX nas células é mais preciso na fase G0/G1 e a G2 fase quando γH2AX focos aparecem como distintos pontos fluorescentes (Figura 5A). Em contraste, análise dos focos de γH2AX nas células durante a fase S é complicado por manchas dispersas γH2AX pan-nuclear causadas pelo processo de replicação (Figura 5B).
Fixação das células foi realizada com 4% P.......
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Discussão
Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 é um método útil para analisar a formação e reparação de ORL em um amplo espectro de domínios de investigação. Parâmetros críticos que influenciam o resultado dos experimentos são a fase do ciclo celular, os agentes utilizados para a fixação e permeabilização das células, a escolha dos anticorpos e o hardware e software, o microscópio de fluorescência.
A influência do ciclo celular em padrões de focos γH2AX foi demonstrada pelo crescimento exp.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
O projeto foi apoiado pela Fundação de leucemia do alemão José Carreras (14 DJCLS R/2017).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio RPMI | Sigma-Aldrich | R0883 | Meio para cultura de células |
| Heparina sódio | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparina 5.000 U.I. / mL |
| Solução de cloreto de sódio 0,9% | B. Braun | PZN 1957154 | Componente da solução estoque anticoagulante |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Meio para isolamento de células mononucleares |
| Solução de tripsina 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzima para dissociação de fibroblastos em cultura de células |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolamento de células progenitoras mieloides CD34+ |
| Lâminas de microscópio de diagnóstico | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Centrífuga de mesa |
| Dispositivo | |||
| Tampa | Heraeus | 76003422 | Tampa para trabalhar sem microtubos |
| Recipiente Cyto | Heraeus | 75003416 | Recipiente Cyto com 2 furos cônicos |
| Clipe | Heraeus | 75003414 | Carrier para segurar um recipiente cyto e uma corrediça |
| Inserção de suporte | Heraeus | 75003417 | Inserção de suporte para segurando um clipe |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergente para permeabilização de membranas celulares |
| Solução de hidróxido de potássio 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessário para preparar a solução de paraformaldeído |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | Agente de fixação |
| Fosfato tamponado com solução salina | Sigma-Aldrich | D8537 | Solução salina balanceada |
| Quimibloqueador | Merck Millipore | 2170 | Agente bloqueador |
| Camundongo monoclonal anti-gama; Anticorpo H2AX (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Anticorpo primário para detecção de &gama; H2AX |
| Anticorpo policlonal de coelho anti-53BP1 (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Anticorpo primário para detecção de 53BP1 |
| Anticorpo anti-camundongo de cabra conjugado com Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | Anticorpo secundário |
| Anticorpo anti-coelho de burro conjugado com Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31572 | Anticorpo secundário |
| Meio de montagem Vectashield | Vector Laboratories | H-1200 | Contém DAPI para coloração de DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Microscópio de fluorescência |
| Cool Cube 1 Câmera CCD | Metasystems | H-0310-010-MS | Sistema de câmera para gravação digital |
| Software Isis | Metasystems | Não aplicável | Software de microscópio |
Referências
- Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Zeman, M. K., Cimprich, K. A.
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Reimpressões e permissões
