Fabricação de poços de Agarose personalizado para a propagação de células e tecido anel Self-assembly usando moldes 3D-impresso

Resumo

Este protocolo descreve uma plataforma para a fabricação de anéis de tecido Self montado em tamanhos variáveis, usando um molde de plástico personalizado 3D-impresso. PDMS negativos são curados em molde 3D-impresso; Então a agarose é convertido nos negativos PDMS curados. As células são semeadas em poços de agarose resultante onde eles agregam em anéis de tecido.

Resumo

Engenharia de tecidos estão sendo usados clinicamente para substituição e reparação dos tecidos e estão sendo desenvolvidos como ferramentas para triagem de drogas e modelagem de doenças humanas. Tecidos Self montados oferecem vantagens sobre a engenharia de tecidos baseada no andaime, tais como a deposição de matriz reforçada, força e função. No entanto, existem alguns métodos disponíveis para a fabricação de tecidos 3D sem propagação de células sobre ou dentro de um andaime de apoio. Anteriormente, desenvolvemos um sistema para a fabricação de anéis de tecido Self montado por semeadura de células nos poços de agarose não adesivas. Um polydimethylsiloxane (PDMS) negativo primeiro foi lançado em um molde de policarbonato usinadas, e em seguida agarose foi gelificado no PDMS negativo para criar a célula em forma de anel, semeando poços. No entanto, a versatilidade desta abordagem foi limitada pela resolução das ferramentas disponíveis para a usinagem do molde de policarbonato. Aqui, demonstramos que plástico impresso 3D pode ser usado como uma alternativa ao policarbonato usinada para fabricar PDMS negativos. O molde 3D-impresso e revista mold design é simples de utilizar e barato para produzir e requer significativamente menos agarose e PDMS por célula semeadura bem. Nós demonstramos que os poços de agarose resultante podem ser usados para criar tecido Self montados anéis com diâmetros personalizados de uma variedade de diferentes tipos de células. Anéis podem ser usados para análise histológica, mecânica e funcional, ou para fabricar tecidos tubulares maiores e mais complexos.

Introdução

Celular auto-montagem abordagens para fabricar os vasos sanguíneos de engenharia de tecidos são uma alternativa para abordagens baseadas no cadafalso. Tecidos Self montados, livre de andaime podem ter maior densidade celular, deposição de matriz reforçada e força e melhoria da função biológica em comparação com tecidos baseada em andaime^1,2,3,4 . No entanto, formar tecidos 3D sem o uso de suporte de andaime exógena com formas e tamanhos específicos continua a ser um desafio. Alguns métodos se fundir camadas de folhas de célula para formar construções mais grossas, embora este processo pode ser demorado e mão de obra intensiva⁵. Alternativamente, as células podem ser semeadas em moldes não-adesivas e permitidas para agregar em esferoides, anéis e outros tecidos formas^6,7,8.

Anéis de tecido Self montado exigem menos células, tempos mais curtos de cultura, e menos reagentes do maior tubulares engenharia de tecidos, mas podem ainda ser mecanicamente testados, examinados histologicamente ou usados para contratilidade e outros testes funcionais^{7 , 9 , 10 , 11}. porque eles podem ser fabricados rapidamente e facilmente testados, anéis de tecido são ideais para a seleção de um grande número de parâmetros de cultura e têm potencial para uso como doença modelos¹¹ ou ferramentas para¹²de despistagem de drogas. Além disso, anéis podem ser fundidos em estruturas de tecido mais complexas, tais como os vasos sanguíneos ou traqueia^7,13, e anéis podem fundir mais completamente do que outras formas como esferoides^14,15.

Agarose é amplamente utilizado como um material do molde para fabricar Self montados tecidos devido a sua biocompatibilidade, permeabilidade e não-célula propriedades adesivas. Por exemplo, Norotte et al fabricado agarose moldes das hastes extrudadas, que permitiu o controle limitado sobre a forma do molde e equipamentos especializados necessários¹⁵. Tan et al depositado gotículas de alginato como construção de unidades para fabricar moldes de hidrogel personalizado em várias formas (pirâmide, Praça)¹⁶. No entanto, o grande diâmetro de esferoides o alginato (300 µm) resultou em recursos com baixa resolução. Essa resolução baixa pode resultar em superfícies irregulares de molde que podem afetar adversamente a consistência de agregação de célula. Alternativamente, agarose pode ser convertido em negativos de polímero para criar moldes não-adesivas com características lisas e dimensões específicas^6,7,17.

Nós relatamos anteriormente um sistema para a fabricação personalizada de agarose anulares célula-semeadura poços partir de um molde negativo de PDMS em um molde de policarbonato branqueado^7,18. Agarose foi derramado o negativo PDMS e permissão para definir^7,18. Células foram então semeadas em agarose poços, onde eles agregados para formar Self montado, anéis de tecido livre de andaime em menos de 24h^7,18. PDMS negativos são autoclaváveis, podem ser reutilizados várias vezes e são suaves e flexíveis, tornando mais fácil para remover os poços de agarose solidificado. Quando este sistema foi inicialmente relatado em Gwyther et al ⁷, PDMS negativos foram expulsos fresadas moldes de policarbonato (figura 1A). Após a fundição de agarose, poços de semeadura de célula individualmente foram cortar e colocados nos poços de uma placa 12^7,18. O projeto foi modificado mais recentemente que um molde único agarose produz 5 anéis e se encaixa em um poço de uma placa 6, eliminando a necessidade de cortar poços individuais e reduzindo a quantidade de PDMS e agarose necessário para produzir cada anel (figura 1B). Uma célula menor largura da calha de semeadura foi usada para reduzir o número de células semeados necessária para alcançar a formação do anel. Apesar destas mudanças, a resolução e a personalização dos moldes estavam restritos às dimensões de fresa de topo padrão disponível, e micromilling pode ser proibitivamente caro. Além disso, usinagem de controle numérico (CNC) de computador pode ser demorado e complicado devido à necessidade de reservar tempo na pesadamente utilizados equipamentos personalizados, software adicional fabricação auxiliada por computador (CAM) para converter o desenho assistido por computador ( Arquivo CAD) para um caminho de ferramenta programável e fixação de confiança da parte de policarbonato durante a usinagem.

No presente estudo, examinamos o uso de impressão 3D como uma alternativa para usinagem CNC. Impressão 3D é amplamente utilizada para engenharia implantes personalizados, fabricando materiais de andaime e para impressão direta de células e tecidos esferoides^15,19,20. Usamos uma impressora 3D de alta resolução, e especializado 3D impressão material que nos permitiu imprimir um molde rígido com uma suave, superfície lustrosa terminar (veja a Tabela de materiais). Nossa técnica permite a fabricação de moldes de plástico altamente personalizável, de alta resolução que pode ser usado para converter negativos PDMS e poços de agarose. Iterações de projeto estão resumidas na Figura 1. O projeto de molde mais foi modificado na versão molde 3D-impresso para incluir cônicos das paredes exteriores e um orifício central para facilitar a remoção de ambos os negativos PDMS de moldes 3D-impresso e dos poços de agarose de PDMS negativos. Esses recursos cônicos não podem ser alcançados com o padrão de processos de usinagem. A distância da parte inferior dos poços no fundo do molde foi aumentada nesta iteração, resultando em um base abaixo os posts para reduzir o risco de posts quebrando durante a remoção do bem agarose de agarose mais espesso. O procedimento de fabricação do molde e o anel é mostrado esquematicamente na Figura 2.

Protocolo

1. preparar o molde 3D-impresso

1. Prepare um desenho do molde nas dimensões desejadas de CAD.
2. Envie o arquivo CAD para uma impressora 3D de alta resolução. Selecione o material plástico apropriado da impressão, com acabamento brilhante.
3. Após a impressão, Lave cuidadosamente o molde com água e detergente.

2. fundição PDMS negativos

1. Medir a quantidade desejada de PDMS base em um equilíbrio. Para um molde com um 60 mm de diâmetro e 2 mm bem posts, usar 25 g.
2. Adicionar o agente de cura em um 01:10 (w/w) relação à base do PDMS.
3. Mexa vigorosamente até que os dois componentes são cuidadosamente combinados. Mistura insuficiente pode resultar na cura incompleta de PDMS, resultando em uma superfície "brega".
4. Coloque um pedaço de fita de laboratório ao redor da borda de moldes 3D-impresso, para permitir a formação de uma camada de base de PDMS acima dos poços impressos.
5. Despeje a mistura PDMS no molde e coloque o molde em uma câmara de vácuo para gás de até todas as bolhas são liberadas.
6. Cure o PDMS a 50 ° C por 2 – 4 h, ou até que solidificou o suficiente para remover.
7. Remova a fita de laboratório e cuidadosamente Extraia o negativo PDMS.
8. Incube o PDMS a 60 ° C, por uma 1h adicional (após a remoção do molde 3D-impresso) para garantir que o molde está totalmente curado.
9. Lave o PDMS abundantemente com água e detergente para remover qualquer resíduo. Lavagem insuficiente pode resultar em formação de anel pobre para os primeiros usos do PDMS negativo.

3. fabricação de Agarose de poços

1. Prepare a agarose poços 1 dia antes da semeadura de células.
2. Faça uma solução de agarose 2% (p/v) em DMEM e autoclave.
3. Pipeta 4ml agarose derretido em um negativo de PDMS autoclavados. Então agarose Pipetar diretamente para os cargos de PDMS negativos. Remova quaisquer bolhas de ar com uma ponta da pipeta, como bolhas podem causar heterogeneidades nas dimensões bem.
4. Nota: Não encha demasiado moldes; a superfície superior da agarose deve ser plana, para que a agarose poços será nível após remoção de PDMS e colocação em placas de cultura 6-poços. Agarose sobra pode ser re-esterilizado e utilizado novamente, embora não mais de uma vez.
5. Depois que esfria a agarose (aproximadamente 10 min. para 4 mL do agarose; moldes maiores podem ser necessário mais refrigeração vezes), cuidadosamente separar os poços de agarose os negativos PDMS usando fórceps rombudo e transferir para um poço de uma placa de 6.
6. Mergulhe os poços de agarose em meio de cultura completo e equilibrar a noite em um antes de incubadora 37 ° C para usar.

4. semeadura anéis de tecido

1. Células de cultura rato aórtico músculo liso²¹ (RaSMCs) em DMEM contendo 10% soro bovino fetal (FBS), 1% L-glutamina, 1% não aminoácidos essenciais, piruvato de sódio 1% e 1% penicilina-estreptomicina até atingirem a confluência de 70%.
   Nota: Células devem ser cultivadas em 5% CO₂ e 37 ° C em placas de cultura de tecidos de 15 cm.
2. Depois de moldes são incubados (seção 3), preparar o RaSMCs para a propagação.
3. Lave pratos duas vezes com 5 mL por placa de salina tamponada fosfato (PBS).
4. Adicione tripsina 0,25% de 3 mL por 15 cm de Petri. Mova as placas para uma incubadora de 37 ° C por 2 – 3 minutos, ou até células tem tirado a placa.
5. Neutralize a tripsina com igual volume (3 mL por placa) de meio de cultura completo. Ressuspender as células completamente para quebrar aglomerados.
6. Diluir uma alíquota do 1:1 com corante trypan azul da suspensão de células e contar as células com um hemocytometer.
7. Centrifugue o volume total da suspensão de células por 5 min a 200 x g para células de Pelotas.
8. Ressuspender as células em uma concentração de 10 milhões de células por mL; Isso resultará em 500.000 células por 50 µ l.
   Nota: Diferentes tipos de células podem exigir concentrações diferentes da célula.
9. Aspire todos médio do molde do agarose. Tenha cuidado para remover todos os meio de poços individuais, mas para não perfurar o fundo dos poços.
10. Pipetar 50 µ l de suspensão para cada poço.
11. Cuidadosamente, adicione 2 mL de meio fresco do lado de fora do molde de agarose. Tenha cuidado para não deixar o estouro médio nos poços do agarose. Coloque as placas na incubadora durante a noite (aproximadamente 16 h).
12. Após incubação durante a noite, Aspire no meio, por fora dos moldes e adicionar 4,5 mL de meio fresco a cada poço da placa de 6-poços para que os moldes e anéis estão completamente submersos. Médio de mudança diariamente.

Resultados

Este sistema permite para o simples, personalizada fabricação de célula de agarose semeadura poços que permite que a célula auto-montagem de 3D em forma de anel engenharia de tecidos. Impressão 3D permite melhor resolução e maior flexibilidade no projeto de molde de policarbonato, onde dimensões são restritos pelos tamanhos disponíveis de ferramenta de usinagem. Com uma impressora 3D de alta resolução, paredes tão finas quanto 0,254 mm podem ser impresso, e dimensões da calha são limitadas apenas pela resolução da impressora (15,2 µm resolução para estes estudos). Normalmente, fresas de topo CNC menor que 0,3 mm não estão disponíveis comercialmente, por isso não é possível criar depressões de larguras menores. Micro fresagem pode produzir características menores, embora o equipamento necessário pode ser proibitivamente caro ou inacessível para muitos laboratórios de pesquisa biomédica. Curvatura e dimensões da calha também são limitados pela forma da ponta do topo. Além disso, características tais como angulada ou cônicas paredes não são possíveis, e pequenas características podem quebrar durante o processo de usinagem.

Desenhos CAD podem ser facilmente modificados para produzir moldes 3D-impresso e PDMS negativos de dimensões personalizáveis. A Figura 3 descreve as dimensões do nossos atual 2mm post impresso 3D moldes, comparados com iterações de projeto anterior. O processo é barato; a 2 mm, 5-ring 3D-impresso molde custo USD 44,67 a impressão 3D e cada parte podem ser usados para criar vários negativos PDMS. Até à data, nós criamos mais de 30 negativos PDMS de um único molde 3D-impresso. Cada negativo requer 25 g de PDMS em US $ 0,11 / g (2,75 USD por PDMS negativo). Cada negativo PDMS pode ser limpas com detergente, esterilizada e re-utilizado para até vários anos, dependendo da frequência de uso. Em comparação com o projeto original¹⁸, o molde 3D-impresso compact usa consideravelmente menos PDMS e agarose por anel de tecido de 2 mm (Figura 1E).

As células semearam em poços de agarose equilibrada agregados para anéis de tecido forma em menos de dimensões de anel de 24 h. dependem das dimensões dos poços de agarose. Aqui, temos demonstrado que anéis de células de músculo liso rato Self montado podem ser fabricadas em poços com 2, 4 ou mensagens de 12 mm de diâmetro (Figura 4). Enquanto anéis neste estudo foram cultivados apenas por 3 dias, podemos ter anteriormente cultivadas hSMC anéis por até 2 semanas²²e hMSC-cartilagem anéis por até 3 semanas¹³. Como relatado anteriormente, anéis podem funcionar como modelos 3D em vitro de tecidos humanos para avaliação quantitativa do tecido função¹¹ e força mecânica^13,22e também podem servir como unidades modulares do edifício para gere o tecido em forma de tubo construções^7,13. Condições de cultivo de células e atributos funcionais dos anéis de tecido projetados com estes tipos de células estão resumidos na tabela 1.

Figura 1: projetos de molde policarbonato. Inicialmente, 15-bem moldes foram usinadas em policarbonato (A). Versões posteriores caracterizado um design mais compacto (B), com 5 poços projetados para caber em um molde de policarbonato único e dentro de um poço de uma placa de 6. Aqui, nós modificamos este projeto usar plástico 3D-impresso como uma alternativa mais personalizável para policarbonato usinado (C). Poços de agarose fabricados a partir da inicial de design¹⁸ (à esquerda) comparado com o atual projeto compacto (à direita), que requer significativamente menos agarose e não exige a separação manual dos poços é mostrados em (D). Quantidades de PDMS e agarose necessários para cada iteração do projeto são mostradas em (E). Posts de centro são de 2 mm de diâmetro. Molde no(na)é 6 cm x 12 cm, (B) tem um diâmetro de 5cm, e (C) tem um diâmetro de 6 cm. Barra de escala em (D) = 3 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: fabricação de anéis de tecido Self montado. Um molde 3D-impresso é usado para converter um negativo PDMS, que é usado para converter os poços de agarose (A). As células são então semeadas diretamente para os poços de agarose, onde eles agregam em menos de 24h para anéis de tecido do formulário (B). Linhas tracejadas em (B) mostram o contorno bem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: vista transversal de molde impresso 3D CAD desenho. Dimensões para a largura da calha (A), altura de cocho (B), furo de centro (C), diâmetro total (D), lábio exterior (E) e (F) a altura da parede exterior são mostrados. As paredes exteriores (1), a porção superior dos poços (2) e orifício central (3) são afilados (em um ângulo de 5 ° para 1 e 3, 45 ° para o 2), para melhorar a facilidade de remoção negativa de PDMS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: desenhos CAD com correspondentes negativos PDMS e auto montados anéis SMC com 2 (A), 4 (B) e (C) 12mm post diâmetros. No(na),(1) indica um entalhe para fornecer orientação, (2) indica um furo central para melhorar a perfusão, (3) é um número de arquivo, que imprime diretamente sobre os negativos PDMS, e (4) mostra o exterior da parede, que é afilado para facilitar a remoção de negativo de PDMS. Bares em agarose poços de escala = 1 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tipo de célula	Células semeadas por anel	Diâmetro do anel	Duração de cultura	Análise funcional realizada
Rato SMC	0,5, 1 ou 3 x 106	2, 4 ou 12 mm	3 dias	Estudo atual; N/A
derivado de iPSC SMC 11	0,6 x 106	2 mm	17 dias	Teste de contratilidade, ensaio de tracção uniaxial, análise histológica
SMC humana 22	0,4 x 106	2 mm	2, 7 ou 14 dias	Ensaio de tracção uniaxial, análise histológica
MSC humana 14	0,4 x 106	2 mm	21 dias	Ensaio de tracção uniaxial, análise histológica, fusão de anel e compressão do tubo de teste, diferenciação em tecido cartilaginoso

Tabela 1: Número de células necessário para a fabricação do anel de diferentes tipos de células.

Discussão

Aqui nós apresentamos um método versátil para a preparação rápida de anéis de tecido Self montado com dimensões facilmente personalizados utilizando a impressão 3D. Nosso método é semelhante à relatada em Svoronos et al. ⁶ , onde 3D-impresso do favo de mel e moldes de cera em forma de osso de cão foram usados para lançar PDMS negativos. No entanto, os moldes foram modificados para conter várias características do projeto original. Um entalhe (Figura 4A(1)) fornece orientação do molde para permitir que cada anel ser rotulado e monitorados individualmente. O furo central (Figura 4A(2)) ajuda a melhorar a difusão do meio nos poços. Números de arquivo CAD são impressos diretamente sobre o molde; Portanto, PDMS negativos cada um são rotulados com o número de versão e postar de diâmetro (Figura 4A3). As paredes exteriores afiladas (Figura 3(1), 5 °), na parte superior dos bebedouros bem (Figura 3(2), 45 °) e o furo central (Figura 3(3), 5 °) tornam mais fácil para remover os moldes 3D-impresso negativos PDMS , e poços de agarose são mais fáceis de remover a partir dos negativos PDMS (Figura 4A(2), A(4)).

Nós demonstramos a versatilidade deste sistema por fabricar tecidos Self montados em forma de anel, de uma variedade de diâmetros e tipos de células, incluindo humanos primários do músculo liso células (SMCs)^18,22, rato aórtica SMCs^{7 , 23}, células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs)¹³e SMCs derivado pluripotentes induzidas (iPSCs) as células-tronco¹¹ (tabela 1). No trabalho em curso, estamos avaliando a formação de anéis de tipos de células adicionais, tais como células endoteliais e fusão de anéis de cartilagem, de tamanhos variados para potenciais aplicações em substituição traqueal. Além de construções completamente derivado de células, também usamos este sistema para fabricar anéis com gelatina reticulado incorporadas microesferas^13,22. Microesferas podem ser incorporadas dentro anéis de tecido durante a auto-montagem para fornecer resistência mecânica adicional, ou para localizadas entrega de fatores de crescimento^13,22.

Quando a fabricação de anéis de tecido, otimização do número de células pode ser necessária para diferentes tipos de células. Mínima célula números podem variar com base no tamanho e tipo de células. Por exemplo, hSMCs, derivados de iPSCs são semeadas em 600.000 células/anel¹¹, hMSCs e hSMCs primária são semeadas em 400.000 células/anel^13,22e rato que SMCs aórtica são semeadas em 500.000 células/anel¹⁸. Dimensões da calha também podem afetar a formação do anel e o número mínimo de células necessárias para a formação de anel²⁴. Para estudos com células humanas e moldes 3D-impresso, utilizou-se uma largura da calha de 2 mm. Os moldes de policarbonato original tinham uma largura da calha de 3,75 mm, que exigia 750.000 hSMCs para formar uma célula de 2mm anel¹⁸. Com a largura da calha reduzida, fomos capazes de reduzir o número de células necessárias para a formação de anel em 46%, para 400.000 células por anel²⁵. Quantidades de células semeadas por anel estão resumidas na tabela 1.

Ao escolher um material impresso 3D, muitos fatores precisam ser considerados. Porque PDMS normalmente é curada a 60 ° C, o material impresso 3D deve ter uma alta bastante temperatura para evitar danos durante a cura de PDMS de fusão. A temperatura de fusão do material utilizado neste estudo (um material proprietário, consulte Tabela de materiais) não está disponível. No entanto, quando cozido a 60 ° C, durante 1 h, observamos que o material começou a produzir um odor. Assim, decidimos abaixar a temperatura de cura a 50 ° C e aumentar o tempo de cura para cozer o PDMS sem danificar o material 3D-impresso. Podem ser necessários se moldes são modificados para negativos PDMS maiores forma ajustes no tempo de cura. Um período adicional de curando a 60 ° C, após a remoção de PDMS pelos moldes 3D-impresso impede que o PDMS final negativo restante brega, limitando-se a temperatura a que do molde 3D-impresso é exposto. Observe que alguns materiais inibem a polimerização de PDMS, para garantir que o material selecionado é compatível com PDMS. Finalmente, a toxicidade de material do molde também deve ser considerada. Enquanto o molde 3D-impresso não estará em contacto directo com as células, é possível que algum resíduo do molde pode ser transferido para o PDMS negativa durante o processo de curando. Descobrimos que muito minuciosa lavagem com detergente era suficiente para remover qualquer resíduo de negativo o PDMS. No entanto, observamos anteriormente que lavagem inadequada levou à formação de anel pobre em poços de agarose, pela primeira vez alguns usos de negativo o PDMS. O uso de PDMS elenco de outros materiais impressos 3D pode exigir investigação adicional para verificar se o detergente é suficiente para remover resíduos de molde, incluindo qualquer potenciais lixiviados. Testes periódicos também podem ser necessário, como é possível que repetiu aquecimento ciclos (até mesmo a 50 ° C) pode danificar o molde ao longo do tempo e causar aumentos no resíduo após o uso repetido. Até à data, usamos um único molde 3D-impresso para produzir mais de 30 negativos PDMS que têm sido utilizados para gerar com êxito anéis de tecido.

Impressão geral, 3D permite maior versatilidade para a fabricação de moldes de agarose de usinagem de policarbonato. Fornece uma resolução mais alta do que é possível com ferramental e projeto do molde não é limitado pelas dimensões das ferramentas disponíveis. Isto permite maior personalização, e a adição de recursos como afilar-se que não pode ser possível com usinagem. Este sistema pode ser aplicado para fabricar tecidos Self montados em outras formas também, além de anéis^6,17. Usando o método de fabricação do anel, desenvolvemos anéis de tecido de uma variedade de tipos de células e tamanhos para aplicações potenciais em tecido traqueal engenharia¹³engenharia vasos sanguíneos⁷e modelagem de doenças vasculares¹¹.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
SeaKem LE Agarose	Lonza	50040
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
DMEM	Corning Cellgro	15-017-CV
VeroWhite	StrataSys	RGD835
Impressora 3D	StrataSys	Objet 260 Connex
DMEM	Corning Cellgro	15-017-CV
FBS	Thermo Fisher	16000069
L-glutamina	Corning Cellgro	25-015-CI
Aminoácidos não essenciais	Corning Cellgro	25-025-CI
Piruvato de sódio	Corning Cellgro	25-000-CI
Pen-strep	Corning Cellgro	30-002-CI
Tripsina	Corning Cellgro	25-053-CI
Trypan blue	Corning Cellgro	25-900-CI
PBS	Lonza	17-516F
Placa de 6 poços	Corning	353046
WKY 3M-22 células musculares lisas aórticas de rato	Fornecido por T. Wight [ref 21]	N/A