Artigo de método

Detecção rápida de desenvolvimento neurológico fenótipos nas células precursoras neurais humanas (NPCs)

DOI:

10.3791/56628

⸱

2 de março de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 2Center for Advanced Biotechnology and Medicine, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 3The Child Health Institute of NJ, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Services, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4The Child Health Institute of NJ, Department of Neuroscience and Cell Biology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 5Department of Genetics, Rutgers University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desenvolvimento neurológico processos tais como consequência natural do axônio, migração e proliferação são frequentemente perturbadas em doenças neuropsiquiátricas. Assim, apresentamos protocolos para rapidamente e reproducibly avaliar estes processos de desenvolvimento neurológico em NPCs de iPSC-derivado humanos. Estes protocolos permitem também a avaliação dos efeitos da terapêutica e fatores de crescimento relevantes no desenvolvimento do NPC.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Desenvolvimento do cérebro humano procede através de uma série de precisamente processos orquestradas, com fases anteriores distinguidos pela proliferação, migração e consequência do axônio; e estágios posteriores, caracterizados pela formação de consequência e sinapse axônio/dendrito. Em transtornos do desenvolvimento neurológico, muitas vezes um ou mais destes processos são rompidas, levando a anormalidades na formação do cérebro e função. Com o advento da tecnologia de células-tronco (hiPSC) humanas pluripotentes induzidas, os pesquisadores têm agora uma fonte abundante de células humanas que podem ser diferenciados em praticamente qualquer tipo de célula, incluindo os neurônios. Estas células podem ser usadas para estudar o desenvolvimento normal do cérebro e patogênese da doença. Um número de protocolos utilizando hiPSCs para modelar doença Neuropsiquiátrica uso terminalmente diferenciadas neurônios ou uso de sistemas de cultura 3D denominado organoids. Enquanto estes métodos provaram ser inestimáveis em estudar a patogênese de doenças humanas, existem alguns inconvenientes. Diferenciação de hiPSCs em neurônios e geração de organoids são longos e onerosos processos que podem afetar o número de experimentos e variáveis que podem ser avaliadas. Além disso, enquanto organoids e neurônios pós mitóticos permitem o estudo dos processos relacionados a doença, incluindo consequência dendrito e sinaptogênese, eles impedem o estudo de processos anteriores, como a proliferação e migração. Em transtornos do desenvolvimento neurológico, como o autismo, abundantes provas genéticas e post-mortem indicam defeitos em processos de desenvolvimento precoce. As células precursoras neurais (NPCs), uma população altamente proliferativa da célula, podem ser um modelo adequado em que perguntas sobre processos ontogenéticos e iniciação de doença. Agora estendemos metodologias aprendidas estudando desenvolvimento em camundongo e rato de culturas corticais para NPCs humanas. O uso de NPCs nos permite investigar doença relacionada com fenótipos e definir como diferentes variáveis (por exemplo, fatores de crescimento, drogas) impacto do desenvolvimento processos incluindo proliferação, migração e diferenciação em poucos dias. Em última análise, este conjunto de ferramentas pode ser usado de forma reprodutível e elevado-throughput para identificar mecanismos de doenças específicas e fenótipos em transtornos do desenvolvimento neurológico.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A utilização de organismos mais simples e modelos de rato tem elucidados os mecanismos do desenvolvimento cerebral básica, bem como a patogênese da doença. Apesar destes avanços, a etiologia de muitos distúrbios neuropsiquiátricos continua elusiva, porque nem todos os achados em organismos mais simples são diretamente relevantes para os aspectos complexos das doenças humanas. Além disso, a maior complexidade do cérebro humano muitas vezes torna difícil para o modelo de desenvolvimento humano e distúrbios nos animais. Com a evolução e o progresso da tecnologia de células-tronco (hiPSCs) humanas pluripotentes induzidas, as células somáticas podem ser reprogramadas em células-tronco e em seguida diferenciadas em células neuronais para estudar doenças humanas. Avanços em tecnologias hiPSCs e "omic" (genômica, transcriptomics, proteômica, metabolomics) prometem revolucionar a compreensão do desenvolvimento do cérebro humano. Estas tecnologias agora tornam possível uma abordagem de "medicina de precisão" para a caracterização das doenças neuropsiquiátricas em uma base caso-a-caso.

O grampo atual no campo de modelagem de doença hiPSC é para diferenciar as células em subtipos neuronais específicos em uma monocamada ou usar um sistema de cultura 3D chamado um organoides para recapitular aspectos do cérebro desenvolvimento1,2, 3. Estes sistemas foram incrivelmente valiosos em estudando e descobrindo aspectos únicos do desenvolvimento humano e doença4,5,6,7. No entanto, tanto culturas neuronal e organoids muitas vezes exigem em qualquer lugar de semanas a meses na cultura antes de estarem prontos para estudar. A natureza demorada esses protocolos e o montante dos recursos necessários para manter que estes sistemas de cultura muitas vezes limitam o número de experiências que podem ser executadas e o número de variáveis (como fatores de crescimento ou drogas) que podem ser testados. Além disso, muitos estudos utilizando organoids e neurônios pós mitóticos concentraram-se em processos como formação de consequência ou sinapse dendrito, que ocorrem mais tarde, em desenvolvimento. Enquanto estes processos têm sido implicados na patologia dos transtornos globais do desenvolvimento como autismo e esquizofrenia, no início do desenvolvimento eventos que ocorrem antes de diferenciação neuronal definitiva também são importantes para a patogênese da doença8 ,9,10,11,12,13. De fato, estudos genômicos recentes mostram que o período de meados de-fetal, que é composto de proliferação, migração e consequência natural do processo, é particularmente importante na patogênese de autismo11,14. Assim, é importante estudar o tronco neural e populações de células progenitoras para entender melhor estes processos anteriores. Sistemas de organoides que são recapitular considerado para melhor desenvolvimento do cérebro humano devido à sua natureza 3D e estrutura organizada, contêm um pool de progenitor que tem sido utilizado para estudar alguns desses eventos anteriores. No entanto, a população do progenitor em organoids muitas vezes é escassa e mais como células gliais radiais que neural tronco ou progenitoras células5,15. Assim, seria benéfico ter um método de alto throughput para estudar os estágios iniciais de neurodesenvolvimento em uma população de células ativamente proliferativa.

No laboratório, nós criamos um protocolo que utiliza células precursoras neurais hiPSC-derivado (NPCs), uma população mista de haste neural e de células progenitoras que é altamente proliferativas, para estudar processos de desenvolvimento neurológico, como a proliferação, migração celular, e extensão do processo inicial (axônio). Estes ensaios foram desenvolvidos a partir de técnicas utilizadas em nosso laboratório durante décadas para estudar com sucesso neurodesenvolvimento em rato e rato culturas cortical16,17,18,19,20, 21,22,23. Importante, também foi mostrado que fenótipos e sinais regulamentares definidos nos sistemas de cultura de rato e rato são altamente preditivos dos mecanismos que estão ativos na vivo, indicando o valor destas técnicas16, 17,18,19,24. Após a diferenciação inicial de hiPSCs para NPCs, estes métodos permitem estudar processos de desenvolvimento vitais, em questão de dias. Esses métodos têm muitas vantagens: (1) exigem equipamentos pouco sofisticados e são fáceis de implementar, (2) numerosas repetições experimentais podem ser realizadas em um curto período de tempo, permitindo a rápida confirmação da reprodutibilidade dos resultados e (3) variáveis de cultura como matrizes de revestimento, os efeitos de fatores de crescimento e atividade de fármacos podem ser testadas de forma rápida e econômica. Além disso, aproveitamos o papel bem estabelecido extracelulares de fatores de crescimento como reguladores da críticos dos diversos processos de desenvolvimento. NPCs foram expostos para selecionar sinais do desenvolvimento que diretamente estimulam eventos como consequência de axônio, proliferação e migração celular e tem encontrado que eles aprimoram a capacidade de identificar defeitos que não são aparentes em condições de controle19 , 25 , 26 , 27 , 28. da mesma forma, a facilidade de avaliar drogas fornece uma poderosa Avenida para adotar técnicas de medicina de precisão para testar a eficácia de diversas intervenções terapêuticas. Assim, este protocolo facilita um alto throughput, reprodutível e uma metodologia simples para estudar o desenvolvimento precoce do cérebro, patogênese da doença e os potenciais efeitos benéficos de drogas e fatores de crescimento no desenvolvimento neurológico fenótipos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. segurança procedimentos e manutenção do gabinete de segurança biológica

  1. Procedimentos de segurança de nível de biossegurança 2 (BSL-2)
    1. Siga as orientações da instituição sobre como trabalhar com materiais BSL-2. Descarte de materiais de BSL-2 de acordo com as práticas da instituição. Indica os quartos e equipamentos que são usados para materiais BSL-2. Use todos os equipamento protetor pessoal (PPE), incluindo luvas e jaleco.
  2. Manutenção do gabinete de segurança biológica
    1. Use um gabinete de segurança biológica certificado para uso de materiais de nível BSL-2.
    2. Ligue a luz UV na biossegurança do armário pelo menos 15 min e em seguida pulverizar as superfícies com solução 10%. Permitir que a solução de lixívia a descansar por 15 min, limpar o gabinete e ativar o fluxo de ar antes de usar.
  3. Tritiada radioativa [3H]-timidina (trítio) os procedimentos de segurança
    Nota: O trítio é uma fonte radioativa de categoria 5, 'o mais improvável que seja perigoso' Categoria. Siga as diretrizes da instituição para trabalhar com radioactividade. Algumas instituições podem exigir certificados ou autorizações para lidar com trítio.
    1. Recebem treinamento da instituição sobre como manipular e alienar trítio corretamente. Descarte de resíduos radioactivos em recipientes adequados, de acordo com as políticas da instituição. Use o EPI quando se trabalha com trítio.

2. neural indução de iPSCs

Nota: Para tornar NPCs, foi seguida uma versão ligeiramente modificada de um protocolo que acompanha um kit de indução neural disponíveis comercialmente. O kit é composto por mídia Neurobasal (NB) e um suplemento de indução Neural (NIS), que é usado para fazer um 1 x médio de indução Neural (NIM) de 50x. NIS também é usado para fazer 100% médio de expansão (ver secção 3.1). Um link para o protocolo encontra-se a seção de materiais e equipamentos e referências43.

  1. Passagem iPSCs quando eles se tornam confluente de 70-80%.
  2. Placa 300.000 iPSCs em 1 bem de um qualificado hESC extracelulares matriz-imitam gel (gel de ECM-mímico) revestido 6 placa contendo 2 mL do meio de iPSC alimentador-livre com 5 μM de inibidor ROCK. Ver seção 3.2 para obter instruções sobre poços de revestimento com gel de ECM-mímico.
  3. Um dia depois, remova o iPSC médio + ROCK iPSCs inibidor e lave uma vez com 1X PBS. Adicione 2 mL de NIM para o iPSCs.
    Nota: 50ml de NIM é feita pela adição de 1 mL de 50 x NIS e 250 µ l (50 unidades/mL, 5 µ l/mL) de penicilina/estreptomicina (P/S) a 49 mL de NB Media.
  4. Mudança de mídia da indução neural aspirando a cada 2 dias gasto médio e substituindo com 2 mL de NIM até as células que se tornam confluentes (em torno de 4-5 dias). Mudar a mídia diariamente, uma vez que as células são confluentes.
  5. As células de passagem após 7 dias no NIM e placa em um gel de ECM-mímico revestido 6 placa contendo 2 mL de 100% de expansão de mídia e inibidor ROCK 5 μM. As células são consideradas passagem 0 (P0) NPCs neste ponto. Consulte a secção 3.1 abaixo para obter instruções fazer a mídia de expansão de 100%.
  6. Células de passagem usando os métodos descritos na seção 3.4. Espere até que as células chegaram a P2 e são confluentes antes dissociando para manchar para marcadores NPC e chapeamento para experimentos (Figura 1).

3. meios de cultura, revestimento e manutenção de NPCs

  1. Preparação de mídia para a manutenção de NPCs (Media de 100% de expansão):
    1. Faça 50 mL de 100% expansão mídia combinando 24,5 mL de DMEM/F12 com 24,5 mL de NB.
    2. Adicione 1 mL de 50 x NIS para o DMEM/F12 + solução NB. Adicione 250 μL de solução de P/S para a mídia.
      Nota: A mídia pode ser refrigerado (4 ° C) e usado por até 2 semanas. Menores volumes de meios de comunicação podem ser feitas ajustando os volumes de DMEM / F12 + NB + NIS usando os mesmos índices quanto o volume de 50 mL.
  2. Preparação de ECM-mímico Gel revestido placas de cultura para a manutenção do NPC
    1. Alíquota gel de ECM-imitam o volume necessário para fazer 6 mL da solução de trabalho. Calcule o volume de alíquota por olhar para a folha de certificado de análise desde ECM-mímico gel fator de diluição varia de lote para lote e o lote a lote.
    2. Descongelar uma alíquota de gel de ECM-mímico no gelo e dissolver-se 6 mL de DMEM/F12 criogênicos.
    3. Adicione 1 mL de solução de ECM-mímico gel/DMEM/F12 para cada poço de uma placa bem 6. Incubar a placa de 6 com ECM-mímico-solução de gel por 30 min a 37 ° C.
    4. Aspirar a solução de ECM-mímico gel após 30 min de incubação e substituir com a mídia de expansão de 100% ou refrigerar placas (4 ° C, até 1 semana) sem aspirar a solução de gel-ECM-mímico.
  3. Manutenção de NPCs
    1. NPCs de placa em uma densidade de 1,5 milhões de células em um ECM-mímico gel-revestido bem contendo 2 mL de mídia de expansão de 100%.
    2. NPCs, incube a 37 ° C, em um ambiente úmido com 5% de CO2.
    3. Adicione 5 μM de inibidor ROCK para a mídia por NPCs em P3 ou inferior, ou por NPCs descongeladas, para evitar a morte celular excessiva. Mudar a mídia após 24 h para remover o inibidor ROCK.
    4. Células de passagem em 4-9 dias, dependendo de quando eles se tornam confluentes. As células são consideradas confluentes quando eles se tornam um monolayer densamente cobrindo toda a parte inferior da superfície do prato.
    5. Placa de NPCs em uma densidade de 1 a 1,5 milhões de células por um poço de uma placa de 6 (ver seção 3.4). Remova a mídia gasta cada 48 h e substitua com 2 mL de mídia de expansão de 100%.
  4. Levante, dissociar, pelota e NPCs para manutenção e/ou chapeamento para condições experimentais
    1. Aspire células médias, lave uma vez com 1X PBS. Aspire PBS e adicione 500 μL de solução de destacamento 1 x celular em 1 bem de confluente NPCs. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
    2. Adicionar 500 μL de temperatura (RT) PBS e lave-o bem com uma pipeta P-1000 para assegurar a remoção das células. Colete as células + solução de PBS em um tubo cônico de 15 mL. Lavar a placa novamente com 1 mL de PBS e adicione o líquido no tubo.
    3. Gire as células para baixo a 300 x g por 5 min granular.
    4. Remova o centrifugado sobrenadante e ressuspender as células em 1-5 mL de mídia DMEM/F12 previamente aquecida. Dilua as células de uma densidade de 1 a 4 milhões de células/mL de mídia. Quantificar células usando um hemocytometer.
    5. Placa o número necessário de células, específicas para manutenção NPC (seção 3.3) ou o ensaio individual sendo realizado (ver seções subsequentes para mais detalhes).
    6. Ajuste o volume de suspensão celular com meios de comunicação para que entre 15 a 100 μL de células são usadas para cada poço/prato. Este volume de pequenas garante que não há distribuição de celular mesmo e que fatores de crescimento, drogas ou substratos no meio não são diluídos.
    7. Incubar as células a 37 ° C. Mudar a mídia todas as 48 h para a manutenção do NPC ou Ver os detalhes específicos para ensaios individuais.
  5. Preparação de mídia para condições experimentais (Media de 30% de expansão)
    1. Diluir a mídia de expansão de 100% de 70% (denominado 30% expansão) pela adição de 1:1 DMEM/F12 + solução NB para tornar a mídia para condições experimentais.
    2. Faça 20 mL de mídia de expansão de 30% adicionando 6 mL de mídia de expansão de 100% e diluir com 7 mL de NB e 7 mL de DMEM/F12 mídia. Adicione 5 µ l/mL da solução de P/S.
      Nota: Se a mídia 100% já contém P/S, em seguida, adicione 5 µ l/mL para o combinado-DMEM / F12 + NB = (14 mL) x (5 µ l/mL) = 70 μL de P/S em vez de 100 µ l.
    3. Adicione carcaças do revestimento e fatores de crescimento em concentrações desejadas para a mídia de expansão de 30%.

4. avaliar a síntese do ADN, fase S entrada e número de células de NPCs

  1. Preparação para a síntese de DNA, fase S entrada e ensaio de número de células
    1. Faça um 1 mg/mL de solução de poli-D-lisina (PDL) em dH2O e filtro esterilizar. Dilua 01:10 em dH2O para fazer um 0,1 mg/mL solução PDL e adicionar 300 μL de cada poço de uma placa bem 24 ou 1 mL para um prato de 35 mm. Incubar durante 20 min em RT.
    2. Lavar os poços do PDL 3 vezes por 5 min com dH2aspirado O. dH2O e adicionar 300 μL/poço ou 1 mL/prato de laminina (5 μg/mL) diluído em 1X PBS. Cobrir as placas com parafilm e manter em uma estéril, biossegurança do armário a noite no RT (12 a 24 h).
    3. Preparar a mídia de expansão de 30% (ver secção 3.5) após 12 a 24 h. Add veículos, fatores de crescimento ou drogas de interesse na concentração desejada em volumes que são menos de 10% da solução para evitar a diluição NIS em 30% do total médio de expansão.
    4. Cada um Lave bem da placa 24-bem duas vezes com PBS 1x (5 min cada). Aspire 1X PBS e adicionar 450 μL de mídia (sem ou com fatores de crescimento/drogas). Incube a placa a 37 ° C durante pelo menos 15 minutos antes de chapear pilhas.
    5. Para cada experimento, configure 2-3 poços ou pratos por condição.
    6. NPCs de placa (ver secção 3.4):
    7. Ensaio de síntese de DNA NPC: 100.000 células/poço em um prato bem 24
    8. Fase S entrada: prato de mm 500.000 células/35
    9. Ensaio de número de celular: 50.000 células/poço em uma placa de 24
  2. Ensaio de síntese de DNA de células neurais Precursor
    1. Placa de 100.000 células/poço em uma placa de 24 e avaliar em triplicado/condição.
    2. Adicionar tritiada radioativa, [3H]-timidina ao meio de cultura (1,5 μCi/mL) em cada poço após 46 h na cultura. Incube as células a 37 ° C por 2 h.
      Nota: Quando utilizar materiais radioativos, recebem treinamento da sua instituição, segue os protocolos de segurança de radioactividade e descarte de materiais radioativos nos receptáculos apropriadamente designados de resíduos.
    3. Remover e corretamente descarte radioativa mídia após 2 h. Adicionar 300 μL de pré aquecido 0,25% do trypsin-EDTA (0,5 mM) a cada poço e incube por 20 min a 37 ° C.
    4. Ligue a colhedora de célula (ver materiais e equipamento seção) e a bomba e verifique se a pressão da bomba está abaixo de 200 PSI. Coloque o papel de filtro através do espaço na colhedora de célula e arrancar no canto direito para marcar a orientação do papel.
    5. Colocar tubos de coletando da ceifeira de célula em uma bandeja vazia "em branco" e pressione prélavagem para umedecer o papel de filtro. Coloque os tubos de coletando em poços de amostra e execute (start).
    6. Quando a colhedora de célula terminou a coleta de amostras, levante a braçadeira e avanço de papel de filtro para repetir para todos os conjuntos de amostra. Sempre pré-lavagem em um prato vazio, "em branco".
    7. Secar com papel de filtro sob uma fonte de luz e configurar correspondentes frascos em uma bandeja. Um soco chads de papel dentro dos frascos e adicione 2 mL de coquetel de cintilação líquida a cada frasco. Frascos tampa e rótulo.
    8. Incube frascos de cintilação líquida cocktail pelo menos 1h antes de ler as contagens por minuto (CPMs) em uma máquina de cintilação.
  3. Ensaio de fase NPC S entrada
    1. Consulte a seção 3.4 para obter as etapas para levantar, dissociar, pelota e re-suspender as células.
    2. Placa de 500.000 células por prato para os 35mm pratos preparados na seção 4.1, somente 1 prato/condição para esta etapa.
    3. Agite os pratos e para trás em todas as direções para garantir uma distribuição uniforme de células. Incube as células a 37 ° C para 46 h.
    4. Prepare três placas de 35 mm, revestidas com PDL/laminina por condição após 24 h. Por exemplo, se existe um prato de 35 milímetros de mídia de expansão de 30% e um prato de 35 milímetros de mídia de expansão de 30% + FGF (10 ng/mL) em seguida casaco 6 PDL/laminina placas para uso no dia seguinte.
    5. Adicione 2 µ l/mL de 5mm EdU para culturas após 46 h. Incubar por 2 h.
    6. Dissociar e as células (ver secção 3.4) de Pelotas. Ressuspender o sedimento celular em 3 mL de mídia de expansão de 30% ou 3 mL de mídia de expansão de 30% + fatores de crescimento desejadas/drogas.
    7. Placa 1 mL por prato pré-revestida PDL/laminina pratos. Agite os pratos e para trás em todas as direções para garantir uma distribuição uniforme de células. Incube a 37 ° C por 2 h permitir que as células aderir ao prato. Consulte a Figura 2 para um cronograma simplificado.
  4. Análise de fase S entrada
    1. Corrigir os pratos com gelada 4% paraformaldeído (PFA em 1X PBS) por 20 min. Em seguida, lave a louça por 5 min com PBS 1x por 3 vezes.
    2. Adicionar 1 mL de 1X PBS com 0,05% de azida de sódio para evitar o crescimento de bactérias e fungo. As células podem ser armazenadas a 4 ° C por até 6 meses se pratos (selados com parafilm) são mantidos no PBS + sódio solução de azida, embora não todos imunológicos antígenos são bem preservados após longos atrasos na análise.
    3. Ensaio de células usando uma reação de EdU comercial kit (Veja o protocolo do fabricante). Mancha de células usando o DAPI ou outro marcador nuclear e imagem usando microscopia de fluorescência.
    4. Avalie a proporção de células positivas EdU sobre cortinas de total de células vivas (número total de células) em 10 campos sistematicamente aleatórios (10x). Não incluem as células mortas em análise.
    5. Utilizam ambas imagens de contraste de fase e imagens fluorescentes para determinar coloração positiva de EdU e para determinar quais células estão mortas ou vivos (Figura 3).
    6. Contagem de todas as células que têm ambos liso e nem membrana celular nas configurações de contraste de fase e um grande núcleo desfragmentado pelo fluorescente DAPI nuclear mancham, estas células são vida (Figura 3A-B).
    7. Excluir todas as células que são a fase brilhante, ter uma partido desigual da membrana celular e têm um núcleo pequeno, condensado, como visualizado por fluorescentes DAPI de imagens, como estas células são mortas (Figura 3A-B). Avalie células vivas para a expressão do EdU, identificando as células com EdU fluorescente brilhante mancha cobrindo o núcleo inteiro ou coloração fluorescente salpicados no núcleo (Figura 3).
  5. Ensaio número de células NPC
    1. Depois de 2 dias em cultura, rotular e preparar tubos de microcentrifuga de 1,5 mL e 0,5 mL microcentrifuge tubos. Em cada tubo de 0,5 mL, adicione 5 μL de Trypan azul.
    2. A cada poço de uma placa bem 24, remover médio e adicionar 200 μL de 1 x solução de desprendimento de célula e lugar na incubadora para 10 a 15 min.
    3. Após o limite de tempo, uma vez que as células têm levantado, adicione a quantidade desejada de 1X PBS a cada poço.
      Nota: Normalmente, no dia 2, adicione 300 μL de 1X PBS para as células contendo bem mais 200 μL da solução de desprendimento, para um volume total de 500 μL. Com o tempo de incubação adicional de cultura, como as células se tornam mais confluentes, aumente o volume de diluição conforme necessário. Por exemplo, no dia 4, adicionar 500 μL de 1 x PBS e no dia 6, adicionar 800 μL de 1X PBS. Volumes totais serão 700 μL e 1 mL, respectivamente.
    4. Usando uma pipeta P-1000, pipete acima e para baixo em cada bem 4 a 5 vezes para remover as células. Examine a placa sob um microscópio para garantir que todas as células têm destacado. Transferência de células para tubos de 1,5 mL.
    5. Inverta os tubos de 1,5 mL com células diluídos 2 a 3 vezes. Então pegue um 50 μL alíquota de células do meio do tubo e adicionar aos tubos de 0,5 mL com Trypan azul (ver 4.5.1).
    6. Solução de célula de pipeta e descer 2 a 3 vezes. Adicionar células para o hemocytometer e analisar imediatamente. À espera de mais do que 10 min pode aumentar a morte celular ou a presença de células que assumiram Trypan azul.
    7. Cuidadosamente, adicione 10 µ l de celular + azul Trypan mistura para cada lado da hemocytometer para realizar contagens de replicar. Contar as células usando o microscópio de contraste de fase. Não contam as células mortas ou as células de azuis escuras que assumiram Trypan azul.
    8. Para obter o número, use de célula total à média celular contados de 4 cantos do hemocytometer e aplicar a seguinte equação:
      Quer dizer o número do celular x volume de mídia (mL) x 10,000 = número da célula Total/poço
    9. Aspire e repita o procedimento em poços restantes. Altere os meios de comunicação sobre as células que não estão sendo contadas, cada ensaio de repetição de 48 h. em dias 4 e 6.

5. NPC axônio ensaio

  1. Preparação de pratos e mídia para o ensaio do axônio
    1. Faça um 1 mg/mL de solução de poli-d-lisina (PDL) em dH2O e filtro esterilizar. Dilua 01:10 em dH2O para fazer uma solução PDL de 0,1 mg/mL e adicionar 1 mL para cada prato de 35 mm. Incubar durante 20 min em RT.
    2. Entretanto, preparar a mídia de expansão de 30% (ver secção 3.5) e adicionar 5 μg/mL (5 µ l/mL) de solução de fibronectina (estoque de 1 mg/mL) para a mídia.
    3. Uma vez que a mídia está preparada, adicione veículos, fatores de crescimento ou drogas de interesse em concentrações desejadas.
      Nota: Recomenda-se adicionar o veículo, fatores de crescimento ou drogas, em volumes < 10% da solução total para evitar diluir a fibronectina e outros componentes no meio de expansão de 30%.
    4. Depois de 20 min, lave pratos PDL 3 vezes por 5 min com dH2O para remover o excesso PDL. Certifique-se de pratos estão secos antes de adicionar mídia.
    5. Coloque 1 mL de mídia (com ou sem fatores de crescimento/drogas) + solução de fibronectina em cada prato revestido de PDL.
    6. Incube os pratos a 37 ° C durante pelo menos 30 min antes de chapear pilhas para garantir a adequada fixação da fibronectina para o PDL.
    7. Para cada experimento, configure 2-3 pratos por condição (por exemplo, veículo contendo 3 pratos, 3 pratos contendo fármaco).
  2. Chapeamento de NPCs para o ensaio do axônio
    1. Consulte a seção 3.4 para obter as etapas para levantar, dissociar, de pelotas e ressuspender as células.
    2. Placa de 50.000 células por prato para os pratos preparados na secção 5.1. Agite os pratos e para trás em todas as direções para garantir uma distribuição uniforme de células.
    3. Incube as células a 37 ° C por 48 h.
  3. Análise de neuritos
    1. Após incubação de células por 48 h, Aspire o meio e corrigir pratos com gelo frio 4% PFA por 20 min.
    2. Depois de 20 min, lave pratos, 3 vezes por 5 min com PBS 1x. Após a lavagem final, adicionar 1 mL de 1X PBS com 0,05% de azida de sódio.
    3. Analise pratos cegamente em um microscópio de contraste de fase em 32 X. Contar células totais e células com neuritos em 3 linhas de 1 cm, escolhidos aleatoriamente posições mas pode ser reproduzidas. Conte com um mínimo de 150 células por prato para garantir a amostragem adequada.
      Nota: Um axônio é definido como uma extensão (processo) do corpo do celular é > 2 diâmetros do corpo celular de comprimento. Para as células com vários processos, o processo mais longo é considerado para o critério. Células com processos que são < 2 corpo celular diâmetros de comprimento não são incluídos (Figura 4).
    4. Somar o número total de células e o número total de células com neuritos em cada prato. Calcule a % de células com neuritos. A percentagem de células com neuritos em replicar pratos de média. Confiança na reprodutibilidade experimental é estabelecida quando todas as linhas dentro de cada prato são semelhantes, e as médias entre os pratos são altamente similares, com o erro padrão da média (SEM) < 10%.
    5. Alternativamente, analisar neuritos através da realização de imunocitoquímica para marcadores tais como beta-III-tubulina (TUJ1) ou MAP2. Depois da coloração para o marcador de interesse, com 10 imagens sistematicamente aleatórias em um microscópio fluorescente em 10x. Imagem de pelo menos 200 células. Neste caso, adquira as imagens não muito próximo à borda do prato. Analise a percentagem de células com TUJ1 ou MAP2 + neuritos (veja a Figura 10 , por exemplo).

6. NPC Neurosphere ensaio de migração

  1. Formação neurosphere
    1. Adicione 1 mL de mídia de expansão de 100% em um prato de 35 mm com substrato sem revestimento. Incube os pratos pelo menos 15 min a 37 ° C antes do chapeamento NPCs. preparar pratos de 2-3 para garantir que não haja será suficiente neurospheres para o ensaio de migração celular.
      Nota: A ausência de um substrato de revestimento assegura que NPCs permanecem suspensas nos meios de comunicação, que é essenciais para a formação de neurosphere. Pratos de revestimento impedirá a formação de neurosphere.
    2. Ver seção 3.4 sobre as etapas para levantar, dissociar e células de Pelotas. Resuspenda o pellet celular em 2-5 mL de pré-aquecido 100% meios de expansão. Placa 1 milhão NPCs em cada prato de 35mm preparado na secção 6.1.1.
    3. NPCs, incube a 37 ° C por 48 a 96 h permitir NPCs para agregação e forma neurospheres. Avalie a esfera tamanho usando uma régua ao vivo em um microscópio de contraste de fase. Esperar que a maioria das esferas para atingir um diâmetro aproximado de 100 µm (± 20 μm) (Figura 5). Esferas menores completamente irão dispersar e se quebram durante o ensaio de migração.
  2. Preparação de placas para ensaio de migração de Neurosphere
    1. Dissolva o ECM-mímico gel de alíquotas (ver seção 3.2) em 6 mL de mídia de expansão de 30%. Uma vez ECM-mímico gel/30% expansão mídia solução é preparada, adicionar veículos, fatores de crescimento ou drogas de interesses nas concentrações desejadas.
      Nota: Veículo, droga e concentrações de fator de crescimento precisam ser aumentado para conta para a adição de 200 µ l de neurospheres na seção 6.3.
    2. Placa 1 mL da ECM-mímica gel solução de mídia de expansão de 30% (± veículos, fatores de crescimento ou drogas) em um poço de uma placa de 6. Faça 2-3 poços por condição experimental. Alternativamente, podem ser usados 35mm pratos. Incubar as placas durante pelo menos 30 min a 37 ° C.
      Nota: Não aspire o ECM-mímico gel/30% solução de mídia de expansão para este ensaio. Chapeamento de esferas em um gel de ECM-mímico aspirado levará a migração rápida e excesso.
  3. Neurospheres de chapeamento
    1. Recolher neurospheres formada em secção 6.1 e colocá-los em um tubo cônico. Lave a 35mm pratos com 1 mL de 1X PBS para garantir todos os neurospheres são coletados. Spin para baixo o neurospheres coletados em 100 x g durante 5 min.
    2. Ressuspender o neurospheres em 1-3 mL de pré-aquecido 30% meios de expansão. Se 1 prato de neurospheres é coletado, 1 mL de mídia é usado para Ressuspender as esferas. Se 2 pratos são coletados, 2 mL de mídia são adicionados para Ressuspender as esferas, etc. Pipetar suavemente e use apenas um P-1000 para esferas não sejam quebradas.
    3. Placa de 200 μL da ressuspensão neurospheres para o ECM-mímico gel/30% solução de expansão feita na seção 6.2. Placas de pedra em todas as direções para distribuir uniformemente o neurospheres. Incubar as placas por 48 h a 37° C.
    4. Remover solução de mídia de expansão gel/30% ECM-mímico e reparar células em 4% PFA, lavar e manter as células em 1X PBS + 0,05% de azida de sódio.
  4. Análise de Neurospheres
    1. Adquira imagens de neurospheres inteiro usando as configurações de contraste de fase em 10 X. Certifique-se de esferas não estão tocando um ao outro. Medida média migração usando o software ImageJ.
    2. Trace o contorno externo do neurosphere usando a ferramenta de linha à mão livre. A linha à mão livre pode ser acessada clicando no ícone "reta". Manualmente o rastreamento usando um mouse.
    3. Use a função de medida para calcular a área do rastreamento. Certifique-se de que a "área" é selecionada como uma leitura na janela "Definir medições" encontrada sob a guia de analisar. Veja a Figura 6 para rastreamento de contorno externo em azul.
    4. Rastrear a massa celular interna da área de esfera e medida. Veja a Figura 6 para rastreamento do contorno interior em vermelho. Quantificar migração média subtraindo-se a massa celular interna da área total de neurosphere.
    5. Neurospheres medida que apresentam uma massa celular interna densamente com células migrando para fora como um tapete contíguo (Figura 6).
    6. Não incluem as células fora da passadeira ou desligado do neurosphere para a medição. Veja a Figura 6 para obter exemplos de células (circulados em branco) que são excluídos da medição tapete exterior. Analise um mínimo de 20 neurospheres para cada condição.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um dos objetivos desses estudos é definir a atividade proliferativa dos NPCs, ou seja, um aumento no número de células. Isto é conseguido através da avaliação de síntese de DNA da população total da célula, uma abordagem de alto rendimento que mede a incorporação de timidina tritiada de traçador radioativo em extratos de células e reflete todas as células empenhadas fase S, se eles são sintetizando, por 5 minutos ou as duas horas inteiras. Além disso, estes ensaios permitem a determinação...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os protocolos apresentados aqui ilustram métodos rápidos e simples para estudar processos fundamentais de desenvolvimento neurológico e testar drogas usando células precursoras neurais derivadas hiPSC e fatores de crescimento. hiPSC tecnologia revolucionou o estudo da patogênese de doenças do desenvolvimento neurológico, fornecendo-em um acesso sem precedentes para viver humanas células neuronais de indivíduos afetados. De fato, há inúmeros estudos de hiPSC de transtornos de desenvolvimento neurológico, incluindo a síndr...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho do governador de Nova Jersey para pesquisas médicas e tratamento de autismo (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie marca fundação familiar, Mindworks Charitable Trust de chumbo e a Fundação da comunidade judaica de maior MetroWest NJ.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio de indução neural PSC:
Link do protocolo: https://goo.gl/euub7a 		ThermoFischer ScientificA1647801Este é um kit que consiste em meio neurobasal (NB) e um suplemento de indução neural (NIS) 50x. O NIS é usado para fazer 1X Meio de Indução Neural e 100% Meio
de Expansão Avançado DMEM/F12 ThermoFischerScientific12634-010Componente de 100% Meio de Expansão
NeurobasalThermoFischer Scientific21103049Componente de ambos NIM e 100% Meio de Expansão 
Corningqualificado parahESCgel imitador de matriz extracelular qualificado para hESC (gel imitador de ECM) 
Y-27632 (2HCl), 1 mgStem Cell Technologies72302Inibidor de ROCK
6 placas de poçoPlacas deCOR-3506usadas para manutenção de NPC e para Ensaio de Migração de Neurosfera 
Placas de 24 poçosThermoFischer Scientific2021-05Placas de poliestireno: Usadas para ensaio de síntese de DNA NPC
Placas de 35 mmThermoFischer Scientific2021-01: Usadas para entrada na fase S NPC e ensaio de neurite
Laminina de rato naturalInvitrogen23017-015Substrato para placas de revestimento: Usado para síntese de DNA NPC, entrada na fase S e ensaios
de número de célulasSubstrato de FibronectinaSigmaF1141para placas de revestimento: Usado para Ensaio de Neurite 
Poly-D-LysineSigmaP0899Substrato para placas de revestimento
Penicilina/EstreptomicinaThermoFischer Scientific15140122Antibiótico, componente de NIM, 100% de Expansão e 30% de Expansão de Mídia 
StemPro AccutaseGibcoA11105-011X Solução de Desprendimento de Células 
2,5% Tripsina (10X)Gibco15090-046Solução enzimática 10X
0,5 M EDTAThermoFischer ScientificAM9261usado em solução de tripsina para elevação de células para ensaio de síntese de DNA
tritiado [3< / sup>H]-timidinaPerkinElmerNET027E001Trítio radioativo, timidina
Fisherbrand Frascos de cintilação HDPE de 7 mLFisherbrand03-337-1Frascos para contagem de cintilação líquida
EcoLite(+)MP Biomedicals0188247501 Coquetel de cintilação líquida
LS 6500 contador de cintilação líquida multiusoBeckman Coulter8043-30-1194Contador de cintilação líquida
Skatron Semi-automactic Cell Harvester Tipo 11019Dispositivos Moleculares & Skatron Instruments, Inc.Coletor de células semiautomático
Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Kit de imagemThermoFisher ScientificC10337EdU e kit de coloração para ensaio de entrada em fase S
Solução azul de tripano, 0,4%ThermoFisher Scientific15250061Avaliando a viabilidade de células
Papel de filtro GF/C de grauGE Healthcare Life Sciences, Whatman1822-849Papel de filtro de fibra de vidro
Fator de crescimentobásico humano FGF-2Peprotech100-18B
Adenilato hipofisário polipeptídeo ativador de adenilato ciclase (PACAP-38)BACHEMH-8430neuropeptídeo
Matrigel 354277 poliestireno Corning Placas de poliestireno

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  2. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  3. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  4. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  5. Bershteyn, M., et al. Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia. Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).
  6. Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. Probing human brain evolution and development in organoids. Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).
  7. Vaccarino, F. M., et al. Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).
  8. Walsh, T., et al. Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia. Science. 320 (5875), 539-543 (2008).
  9. Guilmatre, A., et al. Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation. Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).
  10. Pinto, D., et al. Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders. Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).
  11. Parikshak, N. N., et al. Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism. Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).
  12. Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders. Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).
  13. Voineagu, I., et al. Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology. Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).
  14. Willsey, A. J., et al. Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism. Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).
  15. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  16. Yan, Y., et al. Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms. J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).
  17. Mairet-Coello, G., et al. p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex. Development. 139 (3), 475-487 (2012).
  18. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors. Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).
  19. Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex. J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).
  20. Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis. Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).
  21. Li, B., DiCicco-Bloom, E. Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors. Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).
  22. Lu, N., DiCicco-Bloom, E. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).
  23. Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis. J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).
  24. Falluel-Morel, A., et al. N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus. J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).
  25. Rossman, I. T., et al. Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development. Mol Autism. 5 (1), 9(2014).
  26. Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor. J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).
  27. Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism. J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).
  28. Kaplan, D. R., Miller, F. D. Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol. 10 (3), 381-391 (2000).
  29. Shen, S., Gehlert, D. R., Collier, D. A. PACAP and PAC1 receptor in brain development and behavior. Neuropeptides. 47 (6), 421-430 (2013).
  30. Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).
  31. Falluel-Morel, A., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).
  32. Ataman, B., et al. Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain. Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).
  33. Doers, M. E., et al. iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth. Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).
  34. Pasca, S. P., et al. Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome. Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).
  35. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).
  36. Marchetto, M. C., et al. Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals. Mol Psychiatry. , (2016).
  37. Voineagu, I. Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond. Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).
  38. Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry. World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).
  39. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  40. Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease. Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).
  41. Huttunen, T. T., et al. An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Stem Cell Studies. 1 (1), 10(2011).
  42. Lappalainen, R. S., et al. Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture. Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).
  43. ThermoFisher. GIBCO Induction of Neural Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells Using PSC Neural Induction Medium. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0008031.pdf (2017).
  44. ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf (2017).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Neural Precursor CellsProliferation AssayMigration AssayNeurosphere FormationEdU LabelingPhase Contrast ImagingImmunocytochemical StainingCell DetachmentTrypan Blue CountingECM Mimic Gel

Artigos relacionados