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Artigo de método

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

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DOI:

10.3791/56631

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26 de janeiro de 2018

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1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Resumo

Desenvolvimento do cérebro é um processo complexo, que é controlado de forma temporo-espacial por gradientes de diferentes programas transcriptional e morphogens. Além disso, modificações epigenéticas cromatina, como metilação de histonas, têm um papel importante para o estabelecimento e manutenção de destinos de célula específica dentro deste processo. A grande maioria de metilação de histonas ocorre na cauda do histone flexível, que é acessível para modificadores de histona, borrachas e histona leitor de proteínas. Em contraste, a metilação de H3K79 situa-se no domínio globular de histona 3 e está implicada nas diferentes funções do desenvolvimento. H3K79 metilação é evolutivamente conservada e pode ser encontrada em uma ampla gama de espécies de Homo sapiens de Saccharomyces cerevisiae. A modificação ocorre em populações de células diferentes dentro de organismos, incluindo os progenitores neurais. A localização da metilação de H3K79 no domínio globular de histona 3 torna difícil de avaliar. Aqui, apresentamos métodos para isolar células e e progenitoras cortical de cultura (CPCs) de tecido embrionário cerebral cortical (E11.5-E14.5) ou progenitores cerebelar neurônio granular (CGNPs) do tecido pós-natal (P5-P7) e de forma eficiente immunoprecipitate H3K79me2 por PCR quantitativo (qPCR) e sequenciamento do genoma-largo.

Introdução

As funções cognitivas, motor e sensoriais do cérebro são altamente complexo e suscetível a mudanças físicas e ambientais. O cérebro é composto por três partes gerais o hind-, mid-e prosencéfalo, que estão profundamente ligados. Dentro do posencéfalo, o telencéfalo pode ser dividido em um telencéfalo dorsal (DT) e um telencéfalo ventral (VT). O DT de ratos consiste de seis camadas corticais que são formadas entre E11.5 e E18.5 em uma maneira de "dentro para fora"1. O VT inclui as Eminências ganglionar em desenvolvimento, que mais tarde formam o gânglio basal2,3. Vários tipos de células podem ser classificados no sistema nervoso central dos mamíferos como neurônios, astrócitos ou oligodendrócitos4, que se desenvolvem em uma maneira temporo-espacial5. Primeiro, as células progenitoras neurais (NPCs) dão origem a diferentes tipos de neurônios, interneurônios no VT e os neurônios de projeção no DT e mais tarde sobre células gliais (por exemplo, astrócitos6). Durante o desenvolvimento cortical, a camada mais superficial (camada mim), que contém células de Cajal-Retzius, é formado em primeiro lugar. Então, entre E12.5 e E14.5, NPCs geram camadas mais profundas neuronais (VI, V) enquanto entre 14,5 e 16.5, progenitores dão origem a camada superior (IV-II) neurônios7,8. Identidade neuronal é especificada por programas de transcriptional temporo-espacial induzida por morphogen diferentes e, adicionalmente, por programas epigenéticas2.

O cerebelo, que está implicado na coordenação motora, situa-se no rombencéfalo e se desenvolve entre E10 e aproximadamente P20 em ratos9. Ele contém o córtex cerebelar e os núcleos Cerebelares10. O córtex cerebelar adulto consiste de três camadas, a camada mais externa de molecular, a camada de células de Purkinje e a camada mais interna granular contendo neurônios granulares10. As células grânulo cerebelar são os menores neurônios e representam cerca de 80% de todos os neurônios do cérebro de vertebrados11. Eles desenvolvem a partir de precursores, localizados na zona germinal externa e migram através da camada de células de Purkinje para seu destino12. Como no telencéfalo, o desenvolvimento do cerebelo é regulamentado por vários morphogens importantes, que têm funções específica e espaço-dependente do tempo e iniciar definido programas transcriptional10.

O desenvolvimento das camadas corticais e Cerebelares é controlado pela expressão transcricional de morphogens específicas e, assim, pelo estado da cromatina do DNA. Em uma visão simplificada, cromatina Estados podem ser divididos em eucromatina como transcricionalmente ativo e heterocromatina como regiões transcriptionally silenciosas. Nucleossoma como unidade básica da cromatina contém duas cópias de cada histona núcleo H2A, H2B, H3 e H4, rodeado por 147 pares de bases do ADN13. Histonas são altamente post-translationally modificadas por metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitination, sumoylation, ADP-do ribosylation do, desaminação e prolina isomerização14,15. Metilação de histonas lisina é considerada a modificação do histone mais estável que controla a transcrição, replicação, recombinação16, danos no DNA resposta17e imprinting genômico18. Lisinas podem ser mono-, di- ou tri-misturado19 e aparecem não só sobre as caudas de histona acessível, mas também dentro do domínio globular de histonas20. Methylations específicos em H3K4 e H3K36 são principalmente associados com eucromatina, methylations específicas em H3K9, H3K27 ou H4K20 são encontradas principalmente em regiões heterocromático, apesar de todos os resíduos estão localizados dentro da cauda do histone14, 19,21. Metilação de H3K79 está localizada dentro do domínio globular de histona e tem sido associada com atividade transcricional, mas também com as regiões genômicas transcricionalmente inerte22. A modificação é evolutivamente conservada desde que foi observado no fermento, timo de vitela, frango e humano23. H3K79 mono, di e trimethylation (H3K79me1, me2, me3) são catalisadas por histona metiltransferases DOT1L24,25 e o Nuclear conjunto domínio-contendo proteínas 2 (Nsd2)26. DOT1L está implicada na proliferação e reparação do DNA celular reprograming27. Perda de Dot1l em ratos leva a uma morte pré-natal em torno de28,de E10.5 o estágio desenvolvente29. Durante o desenvolvimento do coração e na diferenciação de myocardiocyte, DOT1L é essencial para a expressão de gene Regulamento30. No sistema nervoso central, função DOT1L pode ser implicada no tubo neural desenvolvimento31, está envolvido em suprimir Tbr1-expressão durante o desenvolvimento de prosencéfalo32e podem funcionar na regulação do stress-ER genes de resposta33. O contexto-dependente ativando ou reprimir ação de H3K79me, especialmente com situações na vivo como o desenvolvimento do sistema nervoso central, é até à data apenas parcialmente compreendido32. Desde que a metilação de H3K79 situa-se no domínio globular de histona 3, é estericamente menos acessível em comparação com as modificações sobre a caudas de histona flexível23. Para entender a função do methylation H3K79, são necessários métodos de análise confiável e reprodutível para determinar sua localização e ambiente genômico. Neste trabalho de métodos, apresentamos os métodos de isolamento de diferentes progenitores neurais (CPCs para o córtex) e CGNPs para o cerebelo, tratamento eficaz de inibidor de DOT1L e um método de ChIP para analisar H3K79 metilação através do sequenciamento em horário diferente ou qPCR pontos durante o desenvolvimento cortical e cerebelar. Para uma visão geral do protocolo e suas possibilidades, veja a Figura 1.

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Protocolo

Comitês de bem-estar animal da Universidade de Freiburg e autoridades locais aprovaram todas as experiências com animais (G12/13, 11/G16) mencionadas no seguinte protocolo.

1. preparações

  1. Preparativos para o isolamento de CPCs
    1. Configure cronometrado de acasalamento para obter embriões em diferentes estágios de desenvolvimento do córtex (entre E11.5 e E14.5). Use os ratos da cepa NMRI (Naval Medical Research Institute), que são pelo menos 8 semanas de idade. Após o acasalamento, considere um plug vaginal positivo em E0.5.
    2. Para que o material suficiente, use uma ninhada de ratos NMRI para um ChIP de H3K79me2 de córtices de E12.5 ou E14.5. Para mais tarde estágios embrionários, use uma maca para mais análises do ChIP (tamanho da ninhada NMRI médio: 10 embriões).
    3. Precool Hank´s equilibrada sal solução (HBSS) e fosfato salino (PBS) a 4 ° C (armazenamento de longo prazo na RT).
    4. Equilibrar a 4 ° C armazenados Trypsin-EDTA (0.05% w/v) a 37 ° C.
    5. Meio de preparar cortical-celular (CCM): Completar o meio de neurônios (ver Tabela de materiais) com concentrações finais de suplemento de B-27 de 2% (v/v), 5 µ g/mL Apo-transferrina, 1 µ g/mL glutationa, 0.5 mM L-glutamina, superóxido dismutase de 0,8 µ g/mL e 1% (v/v) Mistura de antibiótica penicilina-estreptomicina-neomicina. Armazená-lo em 4 ° C. Para o experimento, equilibrar a médio e a 37 ° C.
    6. Descongelar o soro fetal bezerro (FCS), alíquota-(50 mL cada) e equilibrar uma alíquota a 37 ° C (armazenamento de longo prazo a-20 º C).
    7. Prepare as existências de DNAse 1 (10 mg/mL) em H2O para cultura de células. Loja alíquotas a-20 ° C.
    8. Se necessário, dissolva os inibidores de DOT1L específicos EPZ-5676 ou SGC0946 em DMSO a uma concentração de ações de 100 mM. Aplicar uma concentração final de 1-5 µM células no dia 0 e reaplicar o inibidor em dois dias.
    9. Para o cultivo do CPC, casaco celular cultura placas (bem 6 ou 12 bem) com poli-L-ornitina hydrobromide (1 mg/mL em pH ácido bórico de 150mm 8.4) pelo menos 1 h no RT e, posteriormente, com laminina (1 mg/mL) em meio CCM a 37 ° C durante a noite.
  2. Preparativos para o isolamento de CGNP
    1. Organize um adequado de acasalamento dos ratos para gerar animais P5-P7 para isolamento do cerebelo (3-5 animais por ChIP e condição).
    2. Prepare HBSS/glicose, acrescentando 6 mg/mL glicose para buffer HBSS.
    3. Prepare o meio de cultura celular CGNP (CGM) pela adição de 1% (v/v) N2 suplemento, 1% (v/v) penicilina-estreptomicina-neomicina, 25 mM KCl e 10% FCS para DMEM-F12. Para o cultivo de CGNP preparar meio CGM sem FCS, mas incluindo ouriço sonic de 0,6 µ g/mL (SHH) (CGM-SHH) e equilibrar isso a 37 ° C, quando necessário.
    4. Revestir as placas de cultura de célula 6-poços com 100 µ g/mL poli-D-lisina para 1-2 h a RT para a remoção de células da glia. Depois lave duas vezes com o ddH estéril2O e deixa-se secar os pratos. Armazenar as placas para o máxima, uma semana a 4 ° C.
    5. Para o cultivo das placas de cultura de célula 6-poços de casaco de CGNPs com poli-L-ornitina (0,1 mg/mL), a 4 ° C durante a noite. Depois lave duas vezes com H2O para cultura de células e seque as placas.
      Nota: As placas podem ser armazenadas por semana máxima a 4 ° C.
    6. Preparar a tripsina 0.025% (p/v) em HBSS/glicose e equilibrar isso a 37 ° C, quando necessário.
  3. Preparativos para o ChIP de H3K79me2
    1. Prepare o PFA (1% em PBS, pH 8) recentemente antes de reticulação da cromatina. Para preparar o PFA aqueça 50 mL de solução Isotónica no microondas para máximo 65 ° C. Durante agitação constante, adicione 0,5 mg PFA para a PBS. Em seguida, adicionar 50 µ l 10 M de NaOH e espere até que o PFA é dissolvido. Depois, adicionar 42,5 µ l HCl (37% v/v) para obter um pH de 8. Verificar o pH novamente e depois deixe a 1% solução PFA chegar RT
    2. Preparar ações de RNase (1 mg/mL) e Proteinase K (20 µ g / µ l) separadamente em ddH estéril2O. armazenar as alíquotas a-20 ° C.
    3. Preparar a seguinte buffers e reagentes: PBS contendo 0,02% Tween, Lise, glicina, tampão de diluição, ChIP de buffer de 1, tampão de ChIP 2, tampão ChIP 3 e tampão TE e armazená-los em 4 ° C. Prepare o tampão de eluição na hora cada vez.
      1. Preparar o PBS contendo 0,02% Tween. Loja para mais uma semana a 4 ° C.
      2. Prepare o tampão de Lise usando 50 mM Tris pH 8.0, 10 mM de EDTA, sulfato dodecyl de sódio de 1% (p/v) (SDS) e 1 x inibidor da Protease.
      3. Prepare a glicina de 2,5 M.
      4. Prepare o tampão de diluição usando 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, SDS de 0.25% (p/v) e 1 x inibidor da Protease.
      5. Prepare o ChIP buffer 1 usando 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100 e 0,2% (p/v) SDS.
      6. Prepare o tampão de ChIP 2 usando 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM de NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100 e 0,2% (p/v) SDS.
      7. Prepare o tampão de ChIP 3 usando 20 mM Tris pH 8.0, 250mm LiCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) NP-40 e 1% (p/v) SDS.
      8. Prepare o tampão TE usando 20 mM Tris pH 8.0 e 2 mM de EDTA.
      9. Prepare o tampão de eluição fresco contendo 1% (p/v) SDS, 100mm NaHCO3.

2. neurais progenitoras isolamento do tecido cerebral

  1. Isolamento e cultivo opcional do CPCs
    1. Eutanásia dos animais grávidos por deslocamento cervical e transferir os embriões para HBSS gelada.
    2. Remover o crânio com uma tesoura e isolar o cérebro e, em seguida, remover as meninges, se for o caso, com pequenas pinças e córtices isolados (inteiros, DT, ou VT) de ambos os hemisférios, removendo todas as outras partes do cérebro no microscópio binocular usando pequenas pinças e, se necessária, pequena tesoura. Armazene os córtices isolados em 5 mL de tampão HBSS a 4 ° C, em um tubo de 15 mL.
    3. Centrifugar o material isolado do cérebro durante 5 min à 1.000 x g e 4 ° C.
    4. Lave os córtices com 5ml HBSS gelada e homogeneizá-los com uma ponta de pipeta de 1ml pipetando para cima e para baixo. Se necessário, corte a ponta da ponta da pipeta.
    5. Centrifugar a amostra homogeneizada por 5 min em 1.000 x g e 4 ° C. Remova o HBSS.
    6. Adicionar 3 mL de tripsina e incubar a amostra por 5 min a 37 ° C.
    7. Adicionar 1 mL FCS, CCM de 5 mL e 30 µ l de DNase 1 para a amostra e homogeneizar a amostra com uma pipeta de vidro de 5 mL, pipetando cuidadosamente acima e para baixo.
    8. Centrifugar as células isoladas por 5 min a 1000 x g e 4 ° C. Descartar o sobrenadante, adicionar 5 mL CCM e homogeneizar a amostra novamente.
    9. Diluir uma alíquota da amostra e contá-lo com uma contagem-câmara de Neubauer. Espera-se uma quantidade média de 4,5 x 106 células por embrião. Para o cultivo do CPCs isolado prosseguir com passo 2.1.10. Para ChIP, proceda imediatamente com o passo 3.
    10. Para o cultivo, placa do CPCs em poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) e laminina (1 mg/mL) revestido pratos em uma densidade entre 8 x 104 e 2,5 x 105 células/cm2 no meio de CCM e incube-os a 37 ° C, umidade relativa de 100% e 5% de CO2.
    11. Desde que o CPCs começam a se diferenciar em neurônios em cultura celular (após cerca de 4 dias), considere a data de dissecação, como o dia em vitro 0 (dia 0). Para termos mais tempo de cultivo, mude metade do meio de cada quarto dia com meio fresco do CCM.
    12. Aplicar 1-5 µM SGC0946 ou EPZ5676 dissolvidos em DMSO no dia 0 (4-5h após o isolamento da célula) e atualizá-la todos os dias de segundo. Uso de DMSO como um tratamento de controle. Teste a eficiência do tratamento inibidor via métodos padrão immunoblot, se necessário.
  2. Isolamento e cultivo opcional de CGNPs
    1. Eutanásia em animais P5-7 por decapitação com uma tesoura. Remova a pele do couro cabeludo, abrir o crânio e o cérebro usando pinças e tesouras pequenas. Isolar o cerebelo e transferi-lo para HBSS/glicose gelada. Remover todas as meninges e os vasos sanguíneos e transferir o cerebella para tubos de 15 mL, cheios de frio HBSS/glicose.
    2. Lavar o cerebella três vezes com 10 mL gelada HBSS/glicose (recolhê-los por centrifugação a 650 x g por 5 min a 4 ° C) e homogeneizar cerebella posteriormente pipetando delicadamente acima e para baixo com uma pipeta de 1 mL (máximo 2 - 3 vezes) para obter 0,5-1 mm3 fragmentos.
    3. Adicionar 5 mL de 0.025% tripsina em HBSS/glicose e incubar o tecido sob agitação constante em um banho de água de 37 ° C durante 15 min. parar a digestão pela adição de 5 mL de CGM e coletar o tecido por centrifugação a 650 x g por 5 min a 4 ° C.
    4. Remover o sobrenadante e triture o tecido com uma ponta da pipeta de 1 mL em 1 mL CGM e transferi-lo para um novo tubo de 15 mL.
      Nota: É importante evitar bolhas de ar.
      1. Adicionar 5 mL CGM e incubar a mistura por 2 min no gelo para liquidar os restos de tecido. Transferi o sobrenadante para um novo tubo de 15 mL. Adicionar 2 mL CGM no tecido residual e repita o procedimento de trituração.
    5. Reunir as fracções sobrenadantes (sem restos de tecido, cerca de 10 mL no total) e centrifugar a 650 x g por 5 min a 4 ° C para coletar as células cerebelares. Resuspenda o pellet em 10 mL CGM.
    6. Desde astrócitos aderirem poli-D-lisina que CGNPs mais rápido e mais forte, as células em 100 µ g/mL poli-lisina-D 6-bem-placas revestidas da placa (até 4 mL por alvéolo) e incube por 20 min a 37 ° C para remover os astrócitos.
    7. Agitar a placa e recolher o sobrenadante. Centrifugar a 650 x g por 5 min a 4 ° C, em um tubo de 15 mL. Resuspenda o pellet em 10 mL CGM e contar as células com uma contagem câmara de Neubauer.
      Nota: CGNPs são redondas, pequenas e mostram um halo quando fotografada usando microscopia de contraste de fase.
    8. Se necessário, semente as células em 37 ° C pré aquecido CGM em placas de poli-L-ornitina-revestido (3 x 106 células por 6-poços) e incubam-os a 37 ° C, 5% de CO2 e 100% de umidade relativa.
      Nota: Se não for realizada a semeadura, continue para o passo 3.1.
      1. Após 6-12 h, troca a médio CGM-SHH. Tratar a isolados CGNPs 6 h (ou quando se muda a CGM-SHH) após isolamento com inibidor de DOT1L e DMSO controlar e renová-lo todos os dias segundo (compare com 2.1.12). Teste a eficiência do tratamento inibidor via métodos padrão immunoblot, se necessário. Para ChIP, prossiga com a etapa 3.3.
        Nota: Deixando CGM nas placas (e com aquele FBS) irá resultar na diferenciação dos CGNPs em neurônios granulares Cerebelares (CGNs).

3. fixação de células e distorção da cromatina

Nota: Execute etapas 3.1 e 3.2, se as células não são cultivadas, se eles são avance para o passo 3.3.

  1. Coletar as células por centrifugação durante 4 min em 1.000 g de x e adicionar 1,3 mL de PBS. Transferi a amostra para um tubo de 1,5 mL. Centrífuga para 4 min a 1.000 x g a 4° C. Lave a amostra duas vezes com 1,3 mL de PBS.
  2. Etapa crítica: Adicione 350 µ l 1% PFA para a amostra e incube-lo por 5 min a 22 ° C. Para parar a reação, adicione 18.4 glicina µ l e 1 mL PBS. Centrifugar a amostra durante 5 min à 1.000 x g a 4 ° C.
    1. Lave a amostra duas vezes com PBS gelado. Coletar as células fixas por centrifugação durante 5 min em 1.000 g de x e 4 ° C. Mantenha as amostras no gelo, de agora em diante.
      Nota: O tempo de fixação deve ser precisamente 5 min para obter resultados óptimos. Números de telemóvel diferentes podem exigir adaptações de tempo.
  3. Etapa crítica: A culta CGNPs (ou CPCs), adicione 1 mL de até 1% PFA diretamente para os poços de placa de cultura de célula. Após uma incubação de 5 min a 22 ° C, adicionar uma quantidade adequada de glicina e PBS e colher as células com um raspador de célula.
    1. Transferir as células para tubos de 1,5 mL e centrifugar a amostra durante 5 min à 1.000 x g e 4 ° C. Lave a amostra duas vezes com PBS gelado. Coletar as células fixas por centrifugação para 5 minat 1.000 x g a 4 ° C. Mantenha as amostras no gelo, de agora em diante.
  4. Etapa crítica: Adicione 700 µ l de tampão de lise (+ inibidor da protease) e incubar a amostra por 15 min a 4 ° C. Vórtice da amostra cada 5 min. da tesoura a cromatina das células lisadas 3 x 10 min no sonicador (30 pulso s, 30 s de pausa) na potência máxima.
    1. Certifique-se de que o volume não ultrapasse 350 µ l pelo tubo. Vórtice as amostras a cada 10 min. verificar o lisado para restantes núcleos com um microscópio de contraste de fase.
      Nota: É importante para obter melhores resultados de corte (compare com a figura 1B) para análise posterior. No caso de usar outros métodos para a tosquia a cromatina, otimize a tosquia de fragmentos de cromatina tamanho entre 200-500 bp.
  5. Pelota de restos de celular para 10 min, 13.000 x g, 4 ° C. Use o sobrenadante para a etapa pre-lavagem 5.2. Congele a amostra a-20 º C para uso posterior, se necessário.

4. preparação dos grânulos e Preclearing

  1. Lave 45 µ l proteína A grânulos magnético/ChIP e grânulos magnético de 20 µ l/amostra com 1 mL PBS gelado contendo 0,02% Tween três vezes usando uma base magnética. Em seguida, adicione 1 mL de PBS gelado para as contas.
  2. 1 mL PBS gelado e grânulos de 45 µ l/ChIP, adicione 3 µ g de anticorpo/ChIP (H3K79me2 ou IgG de coelho). Incube as amostras por 2 h a 4 ° C em rotacao para ligar os anticorpos para os grânulos. Dependendo do anticorpo, use ~ 3 µ g anticorpo/ChIP.
  3. Lave os anticorpo-limite-grânulos três vezes com 1 mL PBS gelado contendo 0,02% Tween. Adicione o volume do grânulo adequado (o volume inicial de grânulos magnéticos usado) de PBS gelado para os lavado anticorpo-acoplado-grânulos.
  4. Adicione 600 µ l de tampão de diluição e 20 µ l de grânulos magnéticos lavados à amostra para preclearing (volume total de 1.320 µ l) e incubar durante 2 h a 4 ° C em rotacao. Remova as contas usando uma base magnética. Com 5% (33 µ l) dos lysates como amostras de entrada e congelá-los a-20 ° C.

5. imunoprecipitação da cromatina

  1. Divida o extrato lisado em dois tubos (aproximadamente 643.5 µ l), adicione o mesmo volume de tampão de diluição e os anticorpo-limite-grânulos (45 µ l/amostra; H3K79me2 ou IgG de coelho). Incube as amostras a 4 ° C durante a noite em rotacao.
  2. Lave os grânulos com buffer de ChIP gelada 1, tampão de ChIP 2 e tampão de ChIP 3 por 10 min cada a 4 ° C em rotacao. Depois, lavar três vezes com tampão de TE por 5 min a 4 ° C em rotacao.
  3. Eluir os grânulos com tampão de eluição por 1h a 1.400 rpm em um shaker em temperatura ambiente.
  4. Adicionar 10 µ g RNase (1 mg/mL) pela amostra do ChIP e 5 µ g para as amostras de entrada e incubar as amostras por 30 min a 37 ° C (1.400 rpm).
  5. Adicione 100 µ g de Proteinase K (20 µ g / µ l) por ChIP amostra e 50 µ g por entrada e incubar durante uma noite a 65 ° C, a 1.400 rpm.

6. purificação de amostras de ChIP

  1. Purificar o ChIP e amostras de entrada com uma purificação de DNA kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com o manual. Use colunas de purificação mais quando mais de 5 µ g de DNA é esperado. Eluir a amostra com 2 x 15 µ l do DNA eluição buffer fornecido no kit.
  2. Realizar quantificação das amostras (usar 1 µ l) usando um fluoróforo revelador e um fluorospectrometer (ver Tabela de materiais).

7. análise de amostras de ChIP através de qPCR

  1. Para o projeto da primeira demão para análise de qPCR, recupere sequências genômicas de interesse do navegador de visualizador de genômica Integrativa (IGV)34. Projetar as primeiras demão em torno do local de início transcriptional (TSS) de um gene, desde que H3K79me2 é susceptível de ser localizado lá. Como um controle, considere não-codificantes genômica regiões ou regiões cerca de 10 Kb de upstream do TSS ou 10 Kb a jusante do transcriptional fim do site (TES).
    1. Gerar as primeiras demão com https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ usando um tamanho de produto entre 70 e 200 bp e uma temperatura ideal pré-ajuste de 60 ° C. Para fins de teste, use primers para as regiões genômicas, Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 e Npm1 listados na tabela 1.
  2. Testar o recém-projetado cartilhas com o seguinte programa de qPCR, mistura de mestre e um gradiente de temperatura de recozimento entre 58 ° C e a 63 ° C e selecione a temperatura do recozimento com a maior quantidade de produto e qualidade.
    1. Aplica a electroforese do gel de ADN para controlar o tamanho do produto esperado. Para análise de qPCR, use um sistema de detecção de PCR em tempo real (ver Tabela de materiais).
    2. Preparar a mistura de mestre usando 10 µ l DNA polimerase mestre mistura, 0,5 µ l cartilha para a frente (10 µM), 0,5 µ l da primeira demão reversa (10 µM), água de livre de nuclease µ l 4 e 5 µ l DNA (1 ng / µ l).
    3. Usar um programa de qPCR 2-passo, como segue: 5 min a 95 ° C, 50 x (30 s a 95 ° C, 30 s em 58 ° C - 63 ° C) e o gradiente de desnaturação constantemente a 4 ° C.
  3. Criar uma série de diluições de amostras de DNA genômicas, cortadas, purificadas (2 ng / µ l, 1 ng / µ l, 0,5 ng / µ l, 0,25 ng / µ l e 0,125 ng / µ l) e usar 5 µ l para o teste de eficiência usando qPCR. Determinar a inclinação da curva padrão e calcular a eficiência da primeira demão pela seguinte fórmula:
    Eficiência (%) = (10^(-1/slope)-1) * 100.
    1. Use as primeiras demão com eficiência entre 90% e 105% em um caso ideal, ou pelo menos com eficiência entre 85% e 115%.
  4. Para analisar o ChIP e a entrada de amostras, aplicar 0,1-1 ng de DNA ChIP misturado com respectivos para diante e reverso da primeira demão, água livre de nuclease e DNA polimerase mestre misturam em um volume final de 20 µ l de cada reação qPCR.
  5. Determinar os valores de ciclo (Ct) limiar de ChIP e amostras de entrada e normalizar a amostra Ct a Ct valores de entrada para calcular enriquecimento (% entrada) com a seguinte fórmula. Usar Ct valores obtidos de IgG de controle para determinar o nível de fundo.
    % de entrada = 100-2^(norma Norm − entrada. ChIP)
    Norm. entrada = Ct (entrada) − log2(fator de diluição)
    Norm. Microplaqueta = Ct (ChIP) − log2(fator de diluição)
    Nota: norm. = normalizado

8. análise de amostras de ChIP através de sequenciamento

  1. Transferi as amostras de ChIP (entrada e immunoprecipitated amostra de DNA) para uma instalação de sequenciamento.
  2. Para preparar um uso de antemão, biblioteca uma preparação adequada biblioteca kit (veja a Tabela de materiais) e converter 2 ng de DNA entrada e tudo de immunoprecipitated DNA em bibliotecas indexados para próxima geração multiplex sequenciamento na indicado a plataforma (veja a Tabela de materiais).
  3. Etapa crítica: Seguindo as instruções do kit, ligate adaptadores de sequenciamento (com uma concentração de trabalho de 15 µM) para acabar com os fragmentos de DNA reparados e dA cauda. Para adaptadores de sequenciamento e PCR primers usam oligos apropriados (consulte a Tabela de materiais). Para esta quantidade de DNA de entrada, use 6-9 ciclos PCR para enriquecer o adaptador ligado de fragmentos de DNA.
    Nota: Normalmente, não é necessário realizar uma seleção de tamanho do adaptador ligado DNA. É melhor usar como poucos ciclos PCR quanto possível, desde muitos PCR resultado de ciclos de amplificação em PCR duplicatas e uma alta polarização de GC.
  4. Para uma verificação final da biblioteca, tomar 0,5 µ l da reação total para análise de visualizar a distribuição de tamanho em um dispositivo apropriado (consulte a Tabela de materiais). Para a quantificação, use uma tintura revelador em combinação com um fluorospectrometer ou outros métodos (ver Tabela de materiais).
  5. Desde que H3K79me2 parece ser uma modificação de histona, que está amplamente espalhada por maiores regiões genômicas, sequenciar amostras emparelhado-final com um comprimento de leitura de 50 bp e com uma profundidade de sequenciamento de 75 leituras de Mio.
  6. Analise os dados do ChIP-seq com o servidor de Freiburg Galaxy/Uni (galaxy.uni-freiburg.de).
  7. Executar o controle de qualidade, com ChIPseq obtido com FastQC e, se for caso disso, mapeá-los diretamente com Bowtie2 versão 2.2.035 com ou sem corte. Como referência o assembly de genoma usar mm9 ou a mais recente versão mm10; e como a anotação da referência de Ensembl FTP lançamento 79.
  8. Opcional: Remover ler duplicatas usando Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) antes de chamar de pico.
  9. Chame o picos com MACS2 versão 2.1.036 usando a opção 'ampla' para H3K79me2.
  10. Para obter uma proporção de2 log entre o ChIP e exemplo de entrada, o registro2 do número de leituras de leituras a ratio de ambas as amostras use BamCoverage e BamCompare.
  11. Para todos os outra ChIP-seq específica análise aprofundada, aplicar deepTools2 versão 2.3.5 ou 2.4.137, ou seja, para gerar arquivos de faixa de cobertura (bamCoverage para o ChIP só, bamCompare para comparação do ChIP para a entrada), para estimar o ChIP desempenho usar plotFingerprint e para gerar uma visão geral use computeMatrix, plotHeatmap. Selecione a K-significa durante o processo de computeMatrix de cluster para cluster regiões genômicas de acordo com a distribuição de H3K79me2.
  12. Uso publicado ChIP-seq dados como H3K79me2 de E14.5 DT depositadas no NCBI para fins de julgamento (número de adesão: SRP057733).

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Resultados

Regime geral de progenitoras neurais isolamento, cultivo, métodos de análise H3K79me2 ChIP e ChIP: A Figura 1 mostra um fluxograma para executar o ChIP H3K79me2 de células progenitoras cortical em pontos de tempo diferentes durante o desenvolvimento embrionário do cérebro ou de progenitores cerebelar neurônio granular em estágios pós-natal. Como primeiro passo, o cérebro tem de ser isolado e o telencéfalo (entre E11.5 e E14.5) ou o cerebelo (...

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Discussão

Há duas maneiras principais para realizar a imunoprecipitação da cromatina para detectar a ocupação genômica de modificações do histone, fatores de transcrição, leitores de código de histona, escritores ou borrachas. Um é o método de ChIP nativo usando nuclease digerida, cromatina nativa para a imunoprecipitação, e o outro é o método apresentado usando cromatina PFA-fixas, distorcida, em que os nucleosomes e outras proteínas DNA-inscritos são ligados covalentemente ao DNA 39. ChIP nativo com sua t...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente

Agradecimentos

Agradecemos Henriette Bertemes ajudando a estabelecer o protocolo de cultivo CGN dentro do laboratório. Este papel método foi suportada pela DFG-financiado CRC992 médica epigenética financiamento para TV. Os autores reconhecem o apoio da equipe Galaxy Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning e Prof Rolf Backofen, bioinformática, Universidade de Freiburg, Alemanha, financiado pela colaboração pesquisa centro 992 médica epigenética (grant DFG SFB 2012 992/1) e o Ministério Federal alemão de educação e pesquisa (BMBF concessão 031 A538A RBC (de. NBI)).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anti-GAPDHAbcamab8245Categoria: Anticorpo
Abreviatura/Comentário: Diluição de immunoblot 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Categoria: Anticorpo
Abreviatura/Comentário: Diluição de immunoblot 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Categoria: Anticorpo
Abreviação/Comentário: Anticorpo ChIP
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Categoria: Anticorpo
Abreviatura/Comentário: Diluição de imunotransferência 1:1000
Diagenodeanti-IgG de coelhoC15410206Categoria: Anticorpo
Abreviação/Comentário: Anticorpo ChIP Ctrl
Anti-Tubulina alfaAbcamab108629Categoria: Anticorpo
Abreviação/Comentário: Diluição de immunoblot 1:3000
Apo-Transferrina (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para
CCM B27 Suplemento (50x)Life Technologies17504044Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para CCM
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CACategoria: ChIP
Abreviação/Comentário: Para análise de cromatina cisalhada
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Category: ChIP
Abreviação/Comentário: Ultrasonicator
Ácido bórico pH 8,4Sigma AldrichB6768Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para cultura de CPC
Sistema de detecção de PCR CFX Connect RTBio-Rad1855201Categoria: ChIP Analysis
Abreviação/Comentário: Sistema de detecção para qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Categoria: Cultura de células
Abreviatura/Comentário: Para CGM
Dynabeads Proteína AInvitrogen10001DCategoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: Grânulos magnéticos, para ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Categoria: Inibição de DOT1L
Abreviatura/Comentário: Para inibição de DOT1L em cultura
de células Ácido etilenodiamina tetracéticoSERVA39760.01Categoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: EDTA
Fetal Soro Bovino 10% (v/v)Gibco10082147Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para isolamento de CPC e
CGM GlucoseSigma-AldrichG5767Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para isolamento de CGNP
Glutationa (1,25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para CCM
GlycineCarl Roth3187Categoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: Para fixação celular
GoTaq mastermixPromegaA6002Category: ChIP Analysis
Abreviação/Comentário: DNA polimerase master mix para qPCR
Hank' s Solução de sal balanceadaLife Technologies14025-100Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: HBSS
L-glutamina (200 mM)Life Technologies25030081Categoria: Cultura de células
Abreviatura/Comentário: Para CCM
LamininaSigma-AldrichL2020Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para cultura de CPC
Cloreto de lítioSigma-AldrichL4408Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: Suplemento LiCl
N2Life Technologies 17502048Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Categoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: Fluoroespectrômetro para quantificação
de DNA NEB Next Kit de preparação para biblioteca de DNA Ultra para IlluminaNEBE7645SCategoria: ChIP Analysis
Abreviação/Comentário: Kit para preparação de biblioteca
NEBNext Multiplex Oligos para IlluminaNEBE7335Category: ChIP Analysis
Abreviação/Comentário: Oligos para preparação de biblioteca
Meio neurobasalGibco21103049Categoria: Cultura de células
Abreviatura/Comentário: Para CCM
NP-40Calbiochem492016Categoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: Para tampão ChIP
ParaformaldeídoCarl Roth335Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: PFA, para fixação celular
Penicilina-Estreptomicina-Neomicina 1% (v/v)Life Technologies15640055Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: PSN, para solução salina tamponada com fosfato CCM e CGM
Life Technologies10010023Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: PBS, para isolamento de CPC
PicoGreen KitThermo FisherP11496Categoria: ChIP Analysis
Abreviação/Comentário: Visualizando corante para quantificação
de DNA Poli-D-lisinaSigma-AldrichP6407Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para isolamento de CGNP
Bromidrato de poli-L-ornitinaSigma AldrichP3655Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para cultura de CPC
Cloreto de potássioThermo FisherAM9640GCategoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: KCl, para o
inibidor de proteaseRoche4693159001Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: Para
ChIP Proteinase KSigma-Aldrich3115879001Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: Para ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: Kit para purificação de DNA
RNAseSigma-AldrichR6513Categoria: ChIP
Abreviação / Comentário: < / strong> Para ChIP
SGC0946SelleckchemS7079< strong > Categoria: < / strong> Inibição de DOT1L
Abreviatura / Comentário: < / strong> Para inibição de DOT1L em cultura de células
Bicarbonato de sódioCarl Roth8551.1 Categoria: < / strong> ChIP
Abreviatura / Comentário: < / strong> para tampão de eluição
Cloreto de sódioCarl Roth9265< strong > Categoria: < / strong> ChIP
Abreviatura / Comentário: < / strong> NaCl, para tampão ChIP
Desoxicolato de sódioSigma-Aldrich30970< strong > Categoria: < / strong> ChIP
< strong > Abreviatura / Comentário: < / strong> Para ChIP
Sódio dodecilsulfatoCarl Roth183Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: SDS, para ChIP
Sonic hedgehock (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Categoria: Cultura de células
Abreviatura/Comentário: Para isolamento CGNP
Superóxido dismutase (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Categoria: Cultura de células
Abreviatura/Comentário: Para CCM
Tris(hidroximetil)aminometanoCarl Roth9090Categoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: TRIS, para tampão ChIP
Triton X-100Carl RothX100Categoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: Para tampão ChIP
Tripsina-EDTA 0,05% (p/v)Sigma Aldrich59417CCategoria: Cultura de células
Abreviatura/Comentário: Para isolamento CPC
Tween20Carl Roth28320Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: Para preparação de esferas
Outros dispositivos de laboratório: Câmara de contagem de Neubauer, Incubadora, Rotador, Agitador, Conjunto de dissecação, Banho-maria
CCM: Meio
CGM: Meio
Alternativo CGM de célula cortical de cultura de células CGNP

Referências

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