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Artigo de método

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

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DOI:

10.3791/56631

26 de janeiro de 2018

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Resumo

Desenvolvimento do cérebro é um processo complexo, que é controlado de forma temporo-espacial por gradientes de diferentes programas transcriptional e morphogens. Além disso, modificações epigenéticas cromatina, como metilação de histonas, têm um papel importante para o estabelecimento e manutenção de destinos de célula específica dentro deste processo. A grande maioria de metilação de histonas ocorre na cauda do histone flexível, que é acessível para modificadores de histona, borrachas e histona leitor de proteínas. Em contraste, a metilação de H3K79 situa-se no domínio globular de histona 3 e está implicada nas diferentes funções do desenvolvimento. H3K79 metilação é evolutivamente conservada e pode ser encontrada em uma ampla gama de espécies de Homo sapiens de Saccharomyces cerevisiae. A modificação ocorre em populações de células diferentes dentro de organismos, incluindo os progenitores neurais. A localização da metilação de H3K79 no domínio globular de histona 3 torna difícil de avaliar. Aqui, apresentamos métodos para isolar células e e progenitoras cortical de cultura (CPCs) de tecido embrionário cerebral cortical (E11.5-E14.5) ou progenitores cerebelar neurônio granular (CGNPs) do tecido pós-natal (P5-P7) e de forma eficiente immunoprecipitate H3K79me2 por PCR quantitativo (qPCR) e sequenciamento do genoma-largo.

Introdução

As funções cognitivas, motor e sensoriais do cérebro são altamente complexo e suscetível a mudanças físicas e ambientais. O cérebro é composto por três partes gerais o hind-, mid-e prosencéfalo, que estão profundamente ligados. Dentro do posencéfalo, o telencéfalo pode ser dividido em um telencéfalo dorsal (DT) e um telencéfalo ventral (VT). O DT de ratos consiste de seis camadas corticais que são formadas entre E11.5 e E18.5 em uma maneira de "dentro para fora"1. O VT inclui as Eminências ganglionar em desenvolvimento, que mais tarde formam o gânglio basal2,3. Vários tipos de células p....

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Protocolo

Comitês de bem-estar animal da Universidade de Freiburg e autoridades locais aprovaram todas as experiências com animais (G12/13, 11/G16) mencionadas no seguinte protocolo.

1. preparações

  1. Preparativos para o isolamento de CPCs
    1. Configure cronometrado de acasalamento para obter embriões em diferentes estágios de desenvolvimento do córtex (entre E11.5 e E14.5). Use os ratos da cepa NMRI (Naval Medical Research Institute), que são pelo menos 8 semanas de idade. Após o acasalamento, considere um plug vaginal positivo em E0.5.
    2. Para que o material suficiente, use uma ninhada de ratos NMRI para um Ch....

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Resultados

Regime geral de progenitoras neurais isolamento, cultivo, métodos de análise H3K79me2 ChIP e ChIP: A Figura 1 mostra um fluxograma para executar o ChIP H3K79me2 de células progenitoras cortical em pontos de tempo diferentes durante o desenvolvimento embrionário do cérebro ou de progenitores cerebelar neurônio granular em estágios pós-natal. Como primeiro passo, o cérebro tem de ser isolado e o telencéfalo (entre E11.5 e E14.5) ou o cerebelo (.......

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Discussão

Há duas maneiras principais para realizar a imunoprecipitação da cromatina para detectar a ocupação genômica de modificações do histone, fatores de transcrição, leitores de código de histona, escritores ou borrachas. Um é o método de ChIP nativo usando nuclease digerida, cromatina nativa para a imunoprecipitação, e o outro é o método apresentado usando cromatina PFA-fixas, distorcida, em que os nucleosomes e outras proteínas DNA-inscritos são ligados covalentemente ao DNA 39. ChIP nativo com sua t.......

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente

Agradecimentos

Agradecemos Henriette Bertemes ajudando a estabelecer o protocolo de cultivo CGN dentro do laboratório. Este papel método foi suportada pela DFG-financiado CRC992 médica epigenética financiamento para TV. Os autores reconhecem o apoio da equipe Galaxy Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning e Prof Rolf Backofen, bioinformática, Universidade de Freiburg, Alemanha, financiado pela colaboração pesquisa centro 992 médica epigenética (grant DFG SFB 2012 992/1) e o Ministério Federal alemão de educação e pesquisa (BMBF concessão 031 A538A RBC (de. NBI)).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anti-GAPDHAbcamab8245Categoria: Anticorpo
Abreviatura/Comentário: Diluição de immunoblot 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Categoria: Anticorpo
Abreviatura/Comentário: Diluição de immunoblot 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Categoria: Anticorpo
Abreviação/Comentário: Anticorpo ChIP
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Categoria: Anticorpo
Abreviatura/Comentário: Diluição de imunotransferência 1:1000
Diagenodeanti-IgG de coelhoC15410206Categoria: Anticorpo
Abreviação/Comentário: Anticorpo ChIP Ctrl
Anti-Tubulina alfaAbcamab108629Categoria: Anticorpo
Abreviação/Comentário: Diluição de immunoblot 1:3000
Apo-Transferrina (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para
CCM B27 Suplemento (50x)Life Technologies17504044Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para CCM
BioanalyzerAgilent technologiesG2940CACategoria: ChIP
Abreviação/Comentário: Para análise de cromatina cisalhada
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Category: ChIP
Abreviação/Comentário: Ultrasonicator
Ácido bórico pH 8,4Sigma AldrichB6768Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para cultura de CPC
Sistema de detecção de PCR CFX Connect RTBio-Rad1855201Categoria: ChIP Analysis
Abreviação/Comentário: Sistema de detecção para qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Categoria: Cultura de células
Abreviatura/Comentário: Para CGM
Dynabeads Proteína AInvitrogen10001DCategoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: Grânulos magnéticos, para ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Categoria: Inibição de DOT1L
Abreviatura/Comentário: Para inibição de DOT1L em cultura
de células Ácido etilenodiamina tetracéticoSERVA39760.01Categoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: EDTA
Fetal Soro Bovino 10% (v/v)Gibco10082147Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para isolamento de CPC e
CGM GlucoseSigma-AldrichG5767Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para isolamento de CGNP
Glutationa (1,25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para CCM
GlycineCarl Roth3187Categoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: Para fixação celular
GoTaq mastermixPromegaA6002Category: ChIP Analysis
Abreviação/Comentário: DNA polimerase master mix para qPCR
Hank' s Solução de sal balanceadaLife Technologies14025-100Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: HBSS
L-glutamina (200 mM)Life Technologies25030081Categoria: Cultura de células
Abreviatura/Comentário: Para CCM
LamininaSigma-AldrichL2020Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para cultura de CPC
Cloreto de lítioSigma-AldrichL4408Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: Suplemento LiCl
N2Life Technologies 17502048Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Categoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: Fluoroespectrômetro para quantificação
de DNA NEB Next Kit de preparação para biblioteca de DNA Ultra para IlluminaNEBE7645SCategoria: ChIP Analysis
Abreviação/Comentário: Kit para preparação de biblioteca
NEBNext Multiplex Oligos para IlluminaNEBE7335Category: ChIP Analysis
Abreviação/Comentário: Oligos para preparação de biblioteca
Meio neurobasalGibco21103049Categoria: Cultura de células
Abreviatura/Comentário: Para CCM
NP-40Calbiochem492016Categoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: Para tampão ChIP
ParaformaldeídoCarl Roth335Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: PFA, para fixação celular
Penicilina-Estreptomicina-Neomicina 1% (v/v)Life Technologies15640055Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: PSN, para solução salina tamponada com fosfato CCM e CGM
Life Technologies10010023Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: PBS, para isolamento de CPC
PicoGreen KitThermo FisherP11496Categoria: ChIP Analysis
Abreviação/Comentário: Visualizando corante para quantificação
de DNA Poli-D-lisinaSigma-AldrichP6407Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para isolamento de CGNP
Bromidrato de poli-L-ornitinaSigma AldrichP3655Categoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: Para cultura de CPC
Cloreto de potássioThermo FisherAM9640GCategoria: Cultura de células
Abreviação/Comentário: KCl, para o
inibidor de proteaseRoche4693159001Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: Para
ChIP Proteinase KSigma-Aldrich3115879001Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: Para ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: Kit para purificação de DNA
RNAseSigma-AldrichR6513Categoria: ChIP
Abreviação / Comentário: < / strong> Para ChIP
SGC0946SelleckchemS7079< strong > Categoria: < / strong> Inibição de DOT1L
Abreviatura / Comentário: < / strong> Para inibição de DOT1L em cultura de células
Bicarbonato de sódioCarl Roth8551.1 Categoria: < / strong> ChIP
Abreviatura / Comentário: < / strong> para tampão de eluição
Cloreto de sódioCarl Roth9265< strong > Categoria: < / strong> ChIP
Abreviatura / Comentário: < / strong> NaCl, para tampão ChIP
Desoxicolato de sódioSigma-Aldrich30970< strong > Categoria: < / strong> ChIP
< strong > Abreviatura / Comentário: < / strong> Para ChIP
Sódio dodecilsulfatoCarl Roth183Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: SDS, para ChIP
Sonic hedgehock (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Categoria: Cultura de células
Abreviatura/Comentário: Para isolamento CGNP
Superóxido dismutase (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Categoria: Cultura de células
Abreviatura/Comentário: Para CCM
Tris(hidroximetil)aminometanoCarl Roth9090Categoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: TRIS, para tampão ChIP
Triton X-100Carl RothX100Categoria: ChIP
Abreviatura/Comentário: Para tampão ChIP
Tripsina-EDTA 0,05% (p/v)Sigma Aldrich59417CCategoria: Cultura de células
Abreviatura/Comentário: Para isolamento CPC
Tween20Carl Roth28320Categoria: ChIP
Abreviação/Comentário: Para preparação de esferas
Outros dispositivos de laboratório: Câmara de contagem de Neubauer, Incubadora, Rotador, Agitador, Conjunto de dissecação, Banho-maria
CCM: Meio
CGM: Meio
Alternativo CGM de célula cortical de cultura de células CGNP

Referências

  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science....

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Reimpressões e permissões

Etiquetas

Progenitores de Neur nios Granulares CerebelaresC lulas Progenitoras CorticaisDigest o de TecidosCultura CelularCitometria de FluxoWestern BlotAn lise de qPCR