Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

As funções cognitivas, motor e sensoriais do cérebro são altamente complexo e suscetível a mudanças físicas e ambientais. O cérebro é composto por três partes gerais o hind-, mid-e prosencéfalo, que estão profundamente ligados. Dentro do posencéfalo, o telencéfalo pode ser dividido em um telencéfalo dorsal (DT) e um telencéfalo ventral (VT). O DT de ratos consiste de seis camadas corticais que são formadas entre E11.5 e E18.5 em uma maneira de "dentro para fora"¹. O VT inclui as Eminências ganglionar em desenvolvimento, que mais tarde formam o gânglio basal^2,3. Vários tipos de células podem ser classificados no sistema nervoso central dos mamíferos como neurônios, astrócitos ou oligodendrócitos⁴, que se desenvolvem em uma maneira temporo-espacial⁵. Primeiro, as células progenitoras neurais (NPCs) dão origem a diferentes tipos de neurônios, interneurônios no VT e os neurônios de projeção no DT e mais tarde sobre células gliais (por exemplo, astrócitos⁶). Durante o desenvolvimento cortical, a camada mais superficial (camada mim), que contém células de Cajal-Retzius, é formado em primeiro lugar. Então, entre E12.5 e E14.5, NPCs geram camadas mais profundas neuronais (VI, V) enquanto entre 14,5 e 16.5, progenitores dão origem a camada superior (IV-II) neurônios^7,8. Identidade neuronal é especificada por programas de transcriptional temporo-espacial induzida por morphogen diferentes e, adicionalmente, por programas epigenéticas².

O cerebelo, que está implicado na coordenação motora, situa-se no rombencéfalo e se desenvolve entre E10 e aproximadamente P20 em ratos⁹. Ele contém o córtex cerebelar e os núcleos Cerebelares¹⁰. O córtex cerebelar adulto consiste de três camadas, a camada mais externa de molecular, a camada de células de Purkinje e a camada mais interna granular contendo neurônios granulares¹⁰. As células grânulo cerebelar são os menores neurônios e representam cerca de 80% de todos os neurônios do cérebro de vertebrados¹¹. Eles desenvolvem a partir de precursores, localizados na zona germinal externa e migram através da camada de células de Purkinje para seu destino¹². Como no telencéfalo, o desenvolvimento do cerebelo é regulamentado por vários morphogens importantes, que têm funções específica e espaço-dependente do tempo e iniciar definido programas transcriptional¹⁰.

O desenvolvimento das camadas corticais e Cerebelares é controlado pela expressão transcricional de morphogens específicas e, assim, pelo estado da cromatina do DNA. Em uma visão simplificada, cromatina Estados podem ser divididos em eucromatina como transcricionalmente ativo e heterocromatina como regiões transcriptionally silenciosas. Nucleossoma como unidade básica da cromatina contém duas cópias de cada histona núcleo H2A, H2B, H3 e H4, rodeado por 147 pares de bases do ADN¹³. Histonas são altamente post-translationally modificadas por metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitination, sumoylation, ADP-do ribosylation do, desaminação e prolina isomerização^14,15. Metilação de histonas lisina é considerada a modificação do histone mais estável que controla a transcrição, replicação, recombinação¹⁶, danos no DNA resposta¹⁷e imprinting genômico¹⁸. Lisinas podem ser mono-, di- ou tri-misturado¹⁹ e aparecem não só sobre as caudas de histona acessível, mas também dentro do domínio globular de histonas²⁰. Methylations específicos em H3K4 e H3K36 são principalmente associados com eucromatina, methylations específicas em H3K9, H3K27 ou H4K20 são encontradas principalmente em regiões heterocromático, apesar de todos os resíduos estão localizados dentro da cauda do histone^{14, 19,21}. Metilação de H3K79 está localizada dentro do domínio globular de histona e tem sido associada com atividade transcricional, mas também com as regiões genômicas transcricionalmente inerte²². A modificação é evolutivamente conservada desde que foi observado no fermento, timo de vitela, frango e humano²³. H3K79 mono, di e trimethylation (H3K79me1, me2, me3) são catalisadas por histona metiltransferases DOT1L^24,25 e o Nuclear conjunto domínio-contendo proteínas 2 (Nsd2)²⁶. DOT1L está implicada na proliferação e reparação do DNA celular reprograming²⁷. Perda de Dot1l em ratos leva a uma morte pré-natal em torno de^28,de E10.5 o estágio desenvolvente²⁹. Durante o desenvolvimento do coração e na diferenciação de myocardiocyte, DOT1L é essencial para a expressão de gene Regulamento³⁰. No sistema nervoso central, função DOT1L pode ser implicada no tubo neural desenvolvimento³¹, está envolvido em suprimir Tbr1-expressão durante o desenvolvimento de prosencéfalo³²e podem funcionar na regulação do stress-ER genes de resposta³³. O contexto-dependente ativando ou reprimir ação de H3K79me, especialmente com situações na vivo como o desenvolvimento do sistema nervoso central, é até à data apenas parcialmente compreendido³². Desde que a metilação de H3K79 situa-se no domínio globular de histona 3, é estericamente menos acessível em comparação com as modificações sobre a caudas de histona flexível²³. Para entender a função do methylation H3K79, são necessários métodos de análise confiável e reprodutível para determinar sua localização e ambiente genômico. Neste trabalho de métodos, apresentamos os métodos de isolamento de diferentes progenitores neurais (CPCs para o córtex) e CGNPs para o cerebelo, tratamento eficaz de inibidor de DOT1L e um método de ChIP para analisar H3K79 metilação através do sequenciamento em horário diferente ou qPCR pontos durante o desenvolvimento cortical e cerebelar. Para uma visão geral do protocolo e suas possibilidades, veja a Figura 1.

Comitês de bem-estar animal da Universidade de Freiburg e autoridades locais aprovaram todas as experiências com animais (G12/13, 11/G16) mencionadas no seguinte protocolo.

1. preparações

1. Preparativos para o isolamento de CPCs
   1. Configure cronometrado de acasalamento para obter embriões em diferentes estágios de desenvolvimento do córtex (entre E11.5 e E14.5). Use os ratos da cepa NMRI (Naval Medical Research Institute), que são pelo menos 8 semanas de idade. Após o acasalamento, considere um plug vaginal positivo em E0.5.
   2. Para que o material suficiente, use uma ninhada de ratos NMRI para um ChIP de H3K79me2 de córtices de E12.5 ou E14.5. Para mais tarde estágios embrionários, use uma maca para mais análises do ChIP (tamanho da ninhada NMRI médio: 10 embriões).
   3. Precool Hank´s equilibrada sal solução (HBSS) e fosfato salino (PBS) a 4 ° C (armazenamento de longo prazo na RT).
   4. Equilibrar a 4 ° C armazenados Trypsin-EDTA (0.05% w/v) a 37 ° C.
   5. Meio de preparar cortical-celular (CCM): Completar o meio de neurônios (ver Tabela de materiais) com concentrações finais de suplemento de B-27 de 2% (v/v), 5 µ g/mL Apo-transferrina, 1 µ g/mL glutationa, 0.5 mM L-glutamina, superóxido dismutase de 0,8 µ g/mL e 1% (v/v) Mistura de antibiótica penicilina-estreptomicina-neomicina. Armazená-lo em 4 ° C. Para o experimento, equilibrar a médio e a 37 ° C.
   6. Descongelar o soro fetal bezerro (FCS), alíquota-(50 mL cada) e equilibrar uma alíquota a 37 ° C (armazenamento de longo prazo a-20 º C).
   7. Prepare as existências de DNAse 1 (10 mg/mL) em H₂O para cultura de células. Loja alíquotas a-20 ° C.
   8. Se necessário, dissolva os inibidores de DOT1L específicos EPZ-5676 ou SGC0946 em DMSO a uma concentração de ações de 100 mM. Aplicar uma concentração final de 1-5 µM células no dia 0 e reaplicar o inibidor em dois dias.
   9. Para o cultivo do CPC, casaco celular cultura placas (bem 6 ou 12 bem) com poli-L-ornitina hydrobromide (1 mg/mL em pH ácido bórico de 150mm 8.4) pelo menos 1 h no RT e, posteriormente, com laminina (1 mg/mL) em meio CCM a 37 ° C durante a noite.
2. Preparativos para o isolamento de CGNP
   1. Organize um adequado de acasalamento dos ratos para gerar animais P5-P7 para isolamento do cerebelo (3-5 animais por ChIP e condição).
   2. Prepare HBSS/glicose, acrescentando 6 mg/mL glicose para buffer HBSS.
   3. Prepare o meio de cultura celular CGNP (CGM) pela adição de 1% (v/v) N2 suplemento, 1% (v/v) penicilina-estreptomicina-neomicina, 25 mM KCl e 10% FCS para DMEM-F12. Para o cultivo de CGNP preparar meio CGM sem FCS, mas incluindo ouriço sonic de 0,6 µ g/mL (SHH) (CGM-SHH) e equilibrar isso a 37 ° C, quando necessário.
   4. Revestir as placas de cultura de célula 6-poços com 100 µ g/mL poli-D-lisina para 1-2 h a RT para a remoção de células da glia. Depois lave duas vezes com o ddH estéril₂O e deixa-se secar os pratos. Armazenar as placas para o máxima, uma semana a 4 ° C.
   5. Para o cultivo das placas de cultura de célula 6-poços de casaco de CGNPs com poli-L-ornitina (0,1 mg/mL), a 4 ° C durante a noite. Depois lave duas vezes com H₂O para cultura de células e seque as placas.
      Nota: As placas podem ser armazenadas por semana máxima a 4 ° C.
   6. Preparar a tripsina 0.025% (p/v) em HBSS/glicose e equilibrar isso a 37 ° C, quando necessário.
3. Preparativos para o ChIP de H3K79me2
   1. Prepare o PFA (1% em PBS, pH 8) recentemente antes de reticulação da cromatina. Para preparar o PFA aqueça 50 mL de solução Isotónica no microondas para máximo 65 ° C. Durante agitação constante, adicione 0,5 mg PFA para a PBS. Em seguida, adicionar 50 µ l 10 M de NaOH e espere até que o PFA é dissolvido. Depois, adicionar 42,5 µ l HCl (37% v/v) para obter um pH de 8. Verificar o pH novamente e depois deixe a 1% solução PFA chegar RT
   2. Preparar ações de RNase (1 mg/mL) e Proteinase K (20 µ g / µ l) separadamente em ddH estéril₂O. armazenar as alíquotas a-20 ° C.
   3. Preparar a seguinte buffers e reagentes: PBS contendo 0,02% Tween, Lise, glicina, tampão de diluição, ChIP de buffer de 1, tampão de ChIP 2, tampão ChIP 3 e tampão TE e armazená-los em 4 ° C. Prepare o tampão de eluição na hora cada vez.
      1. Preparar o PBS contendo 0,02% Tween. Loja para mais uma semana a 4 ° C.
      2. Prepare o tampão de Lise usando 50 mM Tris pH 8.0, 10 mM de EDTA, sulfato dodecyl de sódio de 1% (p/v) (SDS) e 1 x inibidor da Protease.
      3. Prepare a glicina de 2,5 M.
      4. Prepare o tampão de diluição usando 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100, SDS de 0.25% (p/v) e 1 x inibidor da Protease.
      5. Prepare o ChIP buffer 1 usando 20 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100 e 0,2% (p/v) SDS.
      6. Prepare o tampão de ChIP 2 usando 20 mM Tris pH 8.0, 500 mM de NaCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) Triton X-100 e 0,2% (p/v) SDS.
      7. Prepare o tampão de ChIP 3 usando 20 mM Tris pH 8.0, 250mm LiCl, 2 mM EDTA, 1% (v/v) NP-40 e 1% (p/v) SDS.
      8. Prepare o tampão TE usando 20 mM Tris pH 8.0 e 2 mM de EDTA.
      9. Prepare o tampão de eluição fresco contendo 1% (p/v) SDS, 100mm NaHCO₃.

2. neurais progenitoras isolamento do tecido cerebral

1. Isolamento e cultivo opcional do CPCs
   1. Eutanásia dos animais grávidos por deslocamento cervical e transferir os embriões para HBSS gelada.
   2. Remover o crânio com uma tesoura e isolar o cérebro e, em seguida, remover as meninges, se for o caso, com pequenas pinças e córtices isolados (inteiros, DT, ou VT) de ambos os hemisférios, removendo todas as outras partes do cérebro no microscópio binocular usando pequenas pinças e, se necessária, pequena tesoura. Armazene os córtices isolados em 5 mL de tampão HBSS a 4 ° C, em um tubo de 15 mL.
   3. Centrifugar o material isolado do cérebro durante 5 min à 1.000 x g e 4 ° C.
   4. Lave os córtices com 5ml HBSS gelada e homogeneizá-los com uma ponta de pipeta de 1ml pipetando para cima e para baixo. Se necessário, corte a ponta da ponta da pipeta.
   5. Centrifugar a amostra homogeneizada por 5 min em 1.000 x g e 4 ° C. Remova o HBSS.
   6. Adicionar 3 mL de tripsina e incubar a amostra por 5 min a 37 ° C.
   7. Adicionar 1 mL FCS, CCM de 5 mL e 30 µ l de DNase 1 para a amostra e homogeneizar a amostra com uma pipeta de vidro de 5 mL, pipetando cuidadosamente acima e para baixo.
   8. Centrifugar as células isoladas por 5 min a 1000 x g e 4 ° C. Descartar o sobrenadante, adicionar 5 mL CCM e homogeneizar a amostra novamente.
   9. Diluir uma alíquota da amostra e contá-lo com uma contagem-câmara de Neubauer. Espera-se uma quantidade média de 4,5 x 10⁶ células por embrião. Para o cultivo do CPCs isolado prosseguir com passo 2.1.10. Para ChIP, proceda imediatamente com o passo 3.
   10. Para o cultivo, placa do CPCs em poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) e laminina (1 mg/mL) revestido pratos em uma densidade entre 8 x 10⁴ e 2,5 x 10⁵ células/cm² no meio de CCM e incube-os a 37 ° C, umidade relativa de 100% e 5% de CO₂.
   11. Desde que o CPCs começam a se diferenciar em neurônios em cultura celular (após cerca de 4 dias), considere a data de dissecação, como o dia em vitro 0 (dia 0). Para termos mais tempo de cultivo, mude metade do meio de cada quarto dia com meio fresco do CCM.
   12. Aplicar 1-5 µM SGC0946 ou EPZ5676 dissolvidos em DMSO no dia 0 (4-5h após o isolamento da célula) e atualizá-la todos os dias de segundo. Uso de DMSO como um tratamento de controle. Teste a eficiência do tratamento inibidor via métodos padrão immunoblot, se necessário.
2. Isolamento e cultivo opcional de CGNPs
   1. Eutanásia em animais P5-7 por decapitação com uma tesoura. Remova a pele do couro cabeludo, abrir o crânio e o cérebro usando pinças e tesouras pequenas. Isolar o cerebelo e transferi-lo para HBSS/glicose gelada. Remover todas as meninges e os vasos sanguíneos e transferir o cerebella para tubos de 15 mL, cheios de frio HBSS/glicose.
   2. Lavar o cerebella três vezes com 10 mL gelada HBSS/glicose (recolhê-los por centrifugação a 650 x g por 5 min a 4 ° C) e homogeneizar cerebella posteriormente pipetando delicadamente acima e para baixo com uma pipeta de 1 mL (máximo 2 - 3 vezes) para obter 0,5-1 mm³ fragmentos.
   3. Adicionar 5 mL de 0.025% tripsina em HBSS/glicose e incubar o tecido sob agitação constante em um banho de água de 37 ° C durante 15 min. parar a digestão pela adição de 5 mL de CGM e coletar o tecido por centrifugação a 650 x g por 5 min a 4 ° C.
   4. Remover o sobrenadante e triture o tecido com uma ponta da pipeta de 1 mL em 1 mL CGM e transferi-lo para um novo tubo de 15 mL.
      Nota: É importante evitar bolhas de ar.
      1. Adicionar 5 mL CGM e incubar a mistura por 2 min no gelo para liquidar os restos de tecido. Transferi o sobrenadante para um novo tubo de 15 mL. Adicionar 2 mL CGM no tecido residual e repita o procedimento de trituração.
   5. Reunir as fracções sobrenadantes (sem restos de tecido, cerca de 10 mL no total) e centrifugar a 650 x g por 5 min a 4 ° C para coletar as células cerebelares. Resuspenda o pellet em 10 mL CGM.
   6. Desde astrócitos aderirem poli-D-lisina que CGNPs mais rápido e mais forte, as células em 100 µ g/mL poli-lisina-D 6-bem-placas revestidas da placa (até 4 mL por alvéolo) e incube por 20 min a 37 ° C para remover os astrócitos.
   7. Agitar a placa e recolher o sobrenadante. Centrifugar a 650 x g por 5 min a 4 ° C, em um tubo de 15 mL. Resuspenda o pellet em 10 mL CGM e contar as células com uma contagem câmara de Neubauer.
      Nota: CGNPs são redondas, pequenas e mostram um halo quando fotografada usando microscopia de contraste de fase.
   8. Se necessário, semente as células em 37 ° C pré aquecido CGM em placas de poli-L-ornitina-revestido (3 x 10⁶ células por 6-poços) e incubam-os a 37 ° C, 5% de CO₂ e 100% de umidade relativa.
      Nota: Se não for realizada a semeadura, continue para o passo 3.1.
      1. Após 6-12 h, troca a médio CGM-SHH. Tratar a isolados CGNPs 6 h (ou quando se muda a CGM-SHH) após isolamento com inibidor de DOT1L e DMSO controlar e renová-lo todos os dias segundo (compare com 2.1.12). Teste a eficiência do tratamento inibidor via métodos padrão immunoblot, se necessário. Para ChIP, prossiga com a etapa 3.3.
         Nota: Deixando CGM nas placas (e com aquele FBS) irá resultar na diferenciação dos CGNPs em neurônios granulares Cerebelares (CGNs).

3. fixação de células e distorção da cromatina

Nota: Execute etapas 3.1 e 3.2, se as células não são cultivadas, se eles são avance para o passo 3.3.

1. Coletar as células por centrifugação durante 4 min em 1.000 g de x e adicionar 1,3 mL de PBS. Transferi a amostra para um tubo de 1,5 mL. Centrífuga para 4 min a 1.000 x g a 4° C. Lave a amostra duas vezes com 1,3 mL de PBS.
2. Etapa crítica: Adicione 350 µ l 1% PFA para a amostra e incube-lo por 5 min a 22 ° C. Para parar a reação, adicione 18.4 glicina µ l e 1 mL PBS. Centrifugar a amostra durante 5 min à 1.000 x g a 4 ° C.
   1. Lave a amostra duas vezes com PBS gelado. Coletar as células fixas por centrifugação durante 5 min em 1.000 g de x e 4 ° C. Mantenha as amostras no gelo, de agora em diante.
      Nota: O tempo de fixação deve ser precisamente 5 min para obter resultados óptimos. Números de telemóvel diferentes podem exigir adaptações de tempo.
3. Etapa crítica: A culta CGNPs (ou CPCs), adicione 1 mL de até 1% PFA diretamente para os poços de placa de cultura de célula. Após uma incubação de 5 min a 22 ° C, adicionar uma quantidade adequada de glicina e PBS e colher as células com um raspador de célula.
   1. Transferir as células para tubos de 1,5 mL e centrifugar a amostra durante 5 min à 1.000 x g e 4 ° C. Lave a amostra duas vezes com PBS gelado. Coletar as células fixas por centrifugação para 5 minat 1.000 x g a 4 ° C. Mantenha as amostras no gelo, de agora em diante.
4. Etapa crítica: Adicione 700 µ l de tampão de lise (+ inibidor da protease) e incubar a amostra por 15 min a 4 ° C. Vórtice da amostra cada 5 min. da tesoura a cromatina das células lisadas 3 x 10 min no sonicador (30 pulso s, 30 s de pausa) na potência máxima.
   1. Certifique-se de que o volume não ultrapasse 350 µ l pelo tubo. Vórtice as amostras a cada 10 min. verificar o lisado para restantes núcleos com um microscópio de contraste de fase.
      Nota: É importante para obter melhores resultados de corte (compare com a figura 1B) para análise posterior. No caso de usar outros métodos para a tosquia a cromatina, otimize a tosquia de fragmentos de cromatina tamanho entre 200-500 bp.
5. Pelota de restos de celular para 10 min, 13.000 x g, 4 ° C. Use o sobrenadante para a etapa pre-lavagem 5.2. Congele a amostra a-20 º C para uso posterior, se necessário.

4. preparação dos grânulos e Preclearing

1. Lave 45 µ l proteína A grânulos magnético/ChIP e grânulos magnético de 20 µ l/amostra com 1 mL PBS gelado contendo 0,02% Tween três vezes usando uma base magnética. Em seguida, adicione 1 mL de PBS gelado para as contas.
2. 1 mL PBS gelado e grânulos de 45 µ l/ChIP, adicione 3 µ g de anticorpo/ChIP (H3K79me2 ou IgG de coelho). Incube as amostras por 2 h a 4 ° C em rotacao para ligar os anticorpos para os grânulos. Dependendo do anticorpo, use ~ 3 µ g anticorpo/ChIP.
3. Lave os anticorpo-limite-grânulos três vezes com 1 mL PBS gelado contendo 0,02% Tween. Adicione o volume do grânulo adequado (o volume inicial de grânulos magnéticos usado) de PBS gelado para os lavado anticorpo-acoplado-grânulos.
4. Adicione 600 µ l de tampão de diluição e 20 µ l de grânulos magnéticos lavados à amostra para preclearing (volume total de 1.320 µ l) e incubar durante 2 h a 4 ° C em rotacao. Remova as contas usando uma base magnética. Com 5% (33 µ l) dos lysates como amostras de entrada e congelá-los a-20 ° C.

5. imunoprecipitação da cromatina

1. Divida o extrato lisado em dois tubos (aproximadamente 643.5 µ l), adicione o mesmo volume de tampão de diluição e os anticorpo-limite-grânulos (45 µ l/amostra; H3K79me2 ou IgG de coelho). Incube as amostras a 4 ° C durante a noite em rotacao.
2. Lave os grânulos com buffer de ChIP gelada 1, tampão de ChIP 2 e tampão de ChIP 3 por 10 min cada a 4 ° C em rotacao. Depois, lavar três vezes com tampão de TE por 5 min a 4 ° C em rotacao.
3. Eluir os grânulos com tampão de eluição por 1h a 1.400 rpm em um shaker em temperatura ambiente.
4. Adicionar 10 µ g RNase (1 mg/mL) pela amostra do ChIP e 5 µ g para as amostras de entrada e incubar as amostras por 30 min a 37 ° C (1.400 rpm).
5. Adicione 100 µ g de Proteinase K (20 µ g / µ l) por ChIP amostra e 50 µ g por entrada e incubar durante uma noite a 65 ° C, a 1.400 rpm.

6. purificação de amostras de ChIP

1. Purificar o ChIP e amostras de entrada com uma purificação de DNA kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com o manual. Use colunas de purificação mais quando mais de 5 µ g de DNA é esperado. Eluir a amostra com 2 x 15 µ l do DNA eluição buffer fornecido no kit.
2. Realizar quantificação das amostras (usar 1 µ l) usando um fluoróforo revelador e um fluorospectrometer (ver Tabela de materiais).

7. análise de amostras de ChIP através de qPCR

1. Para o projeto da primeira demão para análise de qPCR, recupere sequências genômicas de interesse do navegador de visualizador de genômica Integrativa (IGV)³⁴. Projetar as primeiras demão em torno do local de início transcriptional (TSS) de um gene, desde que H3K79me2 é susceptível de ser localizado lá. Como um controle, considere não-codificantes genômica regiões ou regiões cerca de 10 Kb de upstream do TSS ou 10 Kb a jusante do transcriptional fim do site (TES).
   1. Gerar as primeiras demão com https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ usando um tamanho de produto entre 70 e 200 bp e uma temperatura ideal pré-ajuste de 60 ° C. Para fins de teste, use primers para as regiões genômicas, Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 e Npm1 listados na tabela 1.
2. Testar o recém-projetado cartilhas com o seguinte programa de qPCR, mistura de mestre e um gradiente de temperatura de recozimento entre 58 ° C e a 63 ° C e selecione a temperatura do recozimento com a maior quantidade de produto e qualidade.
   1. Aplica a electroforese do gel de ADN para controlar o tamanho do produto esperado. Para análise de qPCR, use um sistema de detecção de PCR em tempo real (ver Tabela de materiais).
   2. Preparar a mistura de mestre usando 10 µ l DNA polimerase mestre mistura, 0,5 µ l cartilha para a frente (10 µM), 0,5 µ l da primeira demão reversa (10 µM), água de livre de nuclease µ l 4 e 5 µ l DNA (1 ng / µ l).
   3. Usar um programa de qPCR 2-passo, como segue: 5 min a 95 ° C, 50 x (30 s a 95 ° C, 30 s em 58 ° C - 63 ° C) e o gradiente de desnaturação constantemente a 4 ° C.
3. Criar uma série de diluições de amostras de DNA genômicas, cortadas, purificadas (2 ng / µ l, 1 ng / µ l, 0,5 ng / µ l, 0,25 ng / µ l e 0,125 ng / µ l) e usar 5 µ l para o teste de eficiência usando qPCR. Determinar a inclinação da curva padrão e calcular a eficiência da primeira demão pela seguinte fórmula:
   Eficiência (%) = (10^{^(-1/slope)}-1) * 100.
   1. Use as primeiras demão com eficiência entre 90% e 105% em um caso ideal, ou pelo menos com eficiência entre 85% e 115%.
4. Para analisar o ChIP e a entrada de amostras, aplicar 0,1-1 ng de DNA ChIP misturado com respectivos para diante e reverso da primeira demão, água livre de nuclease e DNA polimerase mestre misturam em um volume final de 20 µ l de cada reação qPCR.
5. Determinar os valores de ciclo (C_t) limiar de ChIP e amostras de entrada e normalizar a amostra C_t a C_t valores de entrada para calcular enriquecimento (% entrada) com a seguinte fórmula. Usar C_t valores obtidos de IgG de controle para determinar o nível de fundo.
   % de entrada = 100-2^{^}(norma Norm − entrada. ChIP)
   Norm. entrada = C_t (entrada) − log₂(fator de diluição)
   Norm. Microplaqueta = C_t (ChIP) − log₂(fator de diluição)
   Nota: norm. = normalizado

8. análise de amostras de ChIP através de sequenciamento

1. Transferi as amostras de ChIP (entrada e immunoprecipitated amostra de DNA) para uma instalação de sequenciamento.
2. Para preparar um uso de antemão, biblioteca uma preparação adequada biblioteca kit (veja a Tabela de materiais) e converter 2 ng de DNA entrada e tudo de immunoprecipitated DNA em bibliotecas indexados para próxima geração multiplex sequenciamento na indicado a plataforma (veja a Tabela de materiais).
3. Etapa crítica: Seguindo as instruções do kit, ligate adaptadores de sequenciamento (com uma concentração de trabalho de 15 µM) para acabar com os fragmentos de DNA reparados e dA cauda. Para adaptadores de sequenciamento e PCR primers usam oligos apropriados (consulte a Tabela de materiais). Para esta quantidade de DNA de entrada, use 6-9 ciclos PCR para enriquecer o adaptador ligado de fragmentos de DNA.
   Nota: Normalmente, não é necessário realizar uma seleção de tamanho do adaptador ligado DNA. É melhor usar como poucos ciclos PCR quanto possível, desde muitos PCR resultado de ciclos de amplificação em PCR duplicatas e uma alta polarização de GC.
4. Para uma verificação final da biblioteca, tomar 0,5 µ l da reação total para análise de visualizar a distribuição de tamanho em um dispositivo apropriado (consulte a Tabela de materiais). Para a quantificação, use uma tintura revelador em combinação com um fluorospectrometer ou outros métodos (ver Tabela de materiais).
5. Desde que H3K79me2 parece ser uma modificação de histona, que está amplamente espalhada por maiores regiões genômicas, sequenciar amostras emparelhado-final com um comprimento de leitura de 50 bp e com uma profundidade de sequenciamento de 75 leituras de Mio.
6. Analise os dados do ChIP-seq com o servidor de Freiburg Galaxy/Uni (galaxy.uni-freiburg.de).
7. Executar o controle de qualidade, com ChIPseq obtido com FastQC e, se for caso disso, mapeá-los diretamente com Bowtie2 versão 2.2.0³⁵ com ou sem corte. Como referência o assembly de genoma usar mm9 ou a mais recente versão mm10; e como a anotação da referência de Ensembl FTP lançamento 79.
8. Opcional: Remover ler duplicatas usando Picard MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard) antes de chamar de pico.
9. Chame o picos com MACS2 versão 2.1.0³⁶ usando a opção 'ampla' para H3K79me2.
10. Para obter uma proporção de₂ log entre o ChIP e exemplo de entrada, o registro₂ do número de leituras de leituras a ratio de ambas as amostras use BamCoverage e BamCompare.
11. Para todos os outra ChIP-seq específica análise aprofundada, aplicar deepTools2 versão 2.3.5 ou 2.4.1³⁷, ou seja, para gerar arquivos de faixa de cobertura (bamCoverage para o ChIP só, bamCompare para comparação do ChIP para a entrada), para estimar o ChIP desempenho usar plotFingerprint e para gerar uma visão geral use computeMatrix, plotHeatmap. Selecione a K-significa durante o processo de computeMatrix de cluster para cluster regiões genômicas de acordo com a distribuição de H3K79me2.
12. Uso publicado ChIP-seq dados como H3K79me2 de E14.5 DT depositadas no NCBI para fins de julgamento (número de adesão: SRP057733).

Regime geral de progenitoras neurais isolamento, cultivo, métodos de análise H3K79me2 ChIP e ChIP: A Figura 1 mostra um fluxograma para executar o ChIP H3K79me2 de células progenitoras cortical em pontos de tempo diferentes durante o desenvolvimento embrionário do cérebro ou de progenitores cerebelar neurônio granular em estágios pós-natal. Como primeiro passo, o cérebro tem de ser isolado e o telencéfalo (entre E11.5 e E14.5) ou o cerebelo (P5-P7) tem de ser obtida. É possível analisar as diferentes regiões do telencéfalo dividindo-o no DT e VT Depois o tecido vai ser homogeneizado e os progenitores neurais segregadas. Agora, é possível para cultura de células progenitoras e tratá-los com inibidores de DOT1L. Outra possibilidade é reparar os progenitores diretamente e submetê-los ao regime do ChIP. Para o ChIP, a cromatina será cortada em fragmentos de 200-500 bp e incubada posteriormente com grânulos magnético-acoplamento anticorpo contra H3K79me2. Depois de lavar os grânulos e recuperar o DNA, o DNA precipitado pode ser analisado pelo sequenciamento ou por qPCR (figura 1A). É essencial ter uma distribuição de bom tamanho os fragmentos de cromatina, após corte, portanto, é aconselhável verificar o tamanho do fragmento com eletroforese em gel de DNA ou com outros métodos (exemplos na figura 1B). Ao escolher o sequenciamento de genoma-largo, ChIP-seq-leituras para ocupação H3K79me2 fornecerá como um fastq-arquivo para posterior análise (Figura 1). A qualidade do sequenciamento lê precisa ser avaliada pela aplicação de FastQC e, se necessário, os arquivos de fastq podem ser aparados usando TrimGalore. Mapeamento para o Mus musculus genoma mm9 ou mm10 pode ser realizado com Bowtie2 e controlado através de PlotFingerprint. É aconselhável remover duplicatas com MarkDuplicates e normalizar o lê por BamCoverage e comparar o ChIP para as amostras de entrada com BamCompare. O ChIP-seq lê posteriormente pode ser visualizada genoma ampla em heatmaps ou gene-wise em sessões do navegador Visualizador de genômica Integrativa (IGV).

CPC cultura e inibição da DOT1L: PCC foram isolados e tratados com inibidor de DOT1L 5 µM SGC0946 no dia 0 e 2. O solvente DMSO foi usado como um controle. No dia 3, os CPCs foram colhidas, as proteínas foram isoladas, quantificadas e analisadas através de immunoblot (Figura 2A). Figura 2A mostra que os níveis de H3K79me2 são efetivamente diminuiu após três dias de cultivo do CPC e inibição de DOT1L, garantindo um esquema de tratamento eficaz inibidor. A quantidade de proteína de H3, GAPDH ou alfa-tubulina servindo como controles de carga, portanto, não foi prejudicada. Immunostaining de CPCs fixos com anticorpos contra ativo caspase 3 (CASP3 +) para a detecção de apoptose e HuC/D para a visualização de células neuronais indicado que o tratamento dos CPCs com inibidor de DOT1L levado à morte celular aumentada depois de três dias em cultura, como mostrado na Figura 2B. Quantificação das células que são CASP3 + / DAPI + ou HuC/D + / DAPI + dentro da cultura do CPC revelou um aumento significativo de células CASP3 + revelando programada morte celular mediante a inibição de DOT1L. O número de neurônios HuC/D-positivo, no entanto, permaneceu inalterado (Figura 2).

H3K79me2 ChIP-qPCR de Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 e Npm1 do CPCs tratados com inibidor de DOT1L: para testar se o tratamento de inibidor de SGC0946 de DOT1L foi eficiente e levou a uma redução de H3K79me2 em específico genes, realizamos uma análise de ChIP seguida por qPCR do CPC tratada por 3 dias. IgG de coelho foi usado como um controle de cavacos. Uma vez que é sabido que H3K79me2 é localizada a stress-responsivo endoplasmatic genes Aft4, Ddit3, Scd1 e Aft3 também no gene transporte nuclear Npm133,38, usamos qPCR primeiras demão cobrindo o TSS, TES e regiões genômicas no âmbito dos organismos de gene para determinar diferenças na distribuição de H3K79me2 após a inibição da DOT1L (Figura 3A). Genes com altos níveis de H3K79me2 em primeiro lugar como Atf4, Ddit3 e Npm1 foram mais responsiva ao tratamento inibidor que três dias de inibição de DOT1L levou a uma significativa diminuição do H3K79me2. Genes com uma cobertura de H3K79me2 inferior, tais como o Atf3 e Scd1, não mostraram nenhuma mudança significativa em níveis H3K79me2.

Análise de visão geral de H3K79me2 ChIP-seq: Análise de todo o genoma dos níveis H3K79me2 em CPCs de E14.5, realizado e analisado de acordo com os esquemas apresentadas e protocolos (Figura 1), revelou uma ChIP de alta qualidade. Considerando que as contagens binned, classificadas de acordo com sua frequência das entrada leituras na mancha de impressão digital (Figura 4A), foram distribuídas uniformemente, os Condes de H3K79me2 mostraram enriquecimento em regiões específicas (escaninhos classificados com 1), que exibe bem sucedida acumulação de fragmentos de cromatina, modificada em H3K79. Um heatmap de H3K79me2 ao longo de genes entre as TSS e seus TES e + /-10Kb de upstream ou downstream mostra (Figura 4B) que picos de H3K79me2 em torno do TSS e diminuiu para o TES em geral. Há genes, que são completamente cobertos com H3K79me2, e os genes, que têm um pico somente dentro da região de TSS. Endoplasmatic-estresse relacionados genes tais como Atf4, Ddit3 e o porto de Npm1 nucleophosmin, por exemplo, um elevado nível de H3K79me2 TSS, que é apenas ligeiramente diminuído ao longo do corpo todo gene (Figura 4). Em contraste, o Scd1 tem uma baixa ocupação de H3K79me2 no TSS e não H3K79me2 dentro do corpo do gene. Atf3 como um último exemplo tem diferentes afiados e baixos nível H3K79me2 picos ao longo do corpo do gene.

Figura 1: esquema do protocolo de H3K79me2 ChIP do CPCs isolada ou CGNPs e fluxograma de análise de sequenciamento. (A) visão geral do protocolo apresentado. Para isolamento do CPC, primeiro E14.5 cérebro será isolado e os córtices podem ser divididos em DT e VT, se necessário. Para CGNPs, cerebelli tem que ser obtido P5 P7 ratos. O tecido será homogeneizado, os progenitores segregadas, e então as células podem ser cultivadas e tratadas com um inibidor adequado ou usadas diretamente para o ChIP. Para ChIP, fixação da cromatina é seguida por cisalhamento e imunoprecipitação com um anticorpo anti-H3K79me2 e IgG de coelho como controle. Após a purificação de DNA, ChIP amostras podem ser analisadas através de sequenciamento e preparação de biblioteca ou podem ser analisadas através de qPCR. (B) exemplos de cromatina de qualidade adequada e inadequada. A distribuição do fragmento de DNA é mostrada em bp. (C) ChIP-seq resultados podem ser submetidos a um pipeline de análise no servidor Freiburg/galáxia. Depois de um controle de qualidade (FastQC), leituras podem ser aparadas com TrimGalore e então mapeadas através de Bowtie2 para o genoma do rato (na mm9 casos apresentados). PlotFingerprint avalia a qualidade do ChIP. Para definir picos para H3K79me2, MACSpeaks pode ser aplicado. Para normalização BamCoverage e para comparação com o BamCompare de entrada são utilizáveis. Para visualizar os resultados IGV navegador e heatmaps são adequados. Formatos de arquivo esperados estão em itálico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: cultura do progenitor Cortical e inibição de DOT1L. (A) Immunoblots mostrando níveis de H3K79me2 no CPC em E14.5 após a inibição de DOT1L por 3 dias (dia 3, n = 3-11) em comparação com o controle de DMSO. H3, GAPDH e tubulina alfa foram usados como controles de carga. (B) imunocitológico coloração de uma cultura CPC nos dias 2 e 3. Ativado a Caspase 3 (CASP3 verde)-positivo de células e neurônios (HuC/d: vermelho) foram corados. DAPI (azul) foi usado para visualizar o núcleo de células. Barra de escala: 100 µm. quantificação (C) o immunostainings apresentado em (B). A proporção de células positivas para CASP3 + / DAPI + ou HuC/D + / DAPI + em % é dado. Para análise estatística, foram realizados testes t de Student não pareado. p < 0,01 * *. Esta figura foi modificada de Roidl et al . 33 , 38 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: H3K79me2 ChIP-qPCR de Aft4, Ddit3, Aft3, Scd1 e Npm1 do CPCs tratados com inibidor de DOT1L. (A) E14.5-derivado CPCs foram tratados com inibidor de DOT1L 5 µM 4-5h após isolamento e pela segunda vez no dia 2, a cultura. PCC foram fixados no dia 3, que foi seguido por extração de cromatina, experimento de ChIP e qPCR. Os resultados são representados como os média (+ /-SEM) % de entrada (n = 3). IgG foi usado como um controle negativo. A média do nível de IgG é retratada como uma linha tracejada. Para análise estatística, foi aplicado ANOVA de duas vias. p < 005 *; p < 0,01 * *, p < 0,001 * * *; Local de início transcriptional TSS, TES transcriptional final site. Esta figura foi modificada de Roidl et al . 33 , 38 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: visão geral da análise H3K79me2 ChIP-seq. (A) impressão digital de H3K79me2 ChIP-seq do CPCs derivado de E14.5, comparado com o de entrada mostra um enriquecimento de fragmentos do ADN, para H3K79me2, garantindo uma alta qualidade de ChIP-seq. (B) H3K79me2 ChIP-seq resultados plotagem em um heatmap. Regiões genômicas fortemente enriquecidas são apresentadas em azul. Escala de 0 (vermelho escuro) - 45 (azul escuro). H3K79me2 picos perto o TSS e declina em direcção da 3´ TES. (C) H3K79me2 ChIP-seq leituras foram mapeadas para o genoma mm9 e visualizadas com o Visualizador de genoma Integrativa (IGV). A ocupação de H3K79me2 de um gene é exibida como log2 do número de leituras de relação entre o ChIP e leituras de entrada por mil por milhão (escala: 09:50). Estrutura do gene RefSEQ é representada enquanto uma caixa vermelha indica o primeiro exon incluindo o TSS. Os genes Aft4, Ddit3, Scd1, Aft3 e Npm1 são mostrados. Para comparação, é exibido um sinal de H3K4me3 da mesma região genômica. Local de início transcriptional TSS, TES transcriptional final site. Esta figura foi modificada de Roidl38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de primers utilizados para ChIP-qPCR.

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente