Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Patrick Bovio; Deborah Roidl; Stefanie Heidrich; Tanja Vogel; Henriette Franz

doi:10.3791/56631

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Artigo de método

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

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DOI:

10.3791/56631

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26 de janeiro de 2018

Patrick Bovio¹^,² , Deborah Roidl¹ , Stefanie Heidrich¹ , Tanja Vogel¹ , Henriette Franz¹

¹Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, ²Faculty of Biology, University of Freiburg

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Resumo

Desenvolvimento do cérebro é um processo complexo, que é controlado de forma temporo-espacial por gradientes de diferentes programas transcriptional e morphogens. Além disso, modificações epigenéticas cromatina, como metilação de histonas, têm um papel importante para o estabelecimento e manutenção de destinos de célula específica dentro deste processo. A grande maioria de metilação de histonas ocorre na cauda do histone flexível, que é acessível para modificadores de histona, borrachas e histona leitor de proteínas. Em contraste, a metilação de H3K79 situa-se no domínio globular de histona 3 e está implicada nas diferentes funções do desenvolvimento. H3K79 metilação é evolutivamente conservada e pode ser encontrada em uma ampla gama de espécies de Homo sapiens de Saccharomyces cerevisiae. A modificação ocorre em populações de células diferentes dentro de organismos, incluindo os progenitores neurais. A localização da metilação de H3K79 no domínio globular de histona 3 torna difícil de avaliar. Aqui, apresentamos métodos para isolar células e e progenitoras cortical de cultura (CPCs) de tecido embrionário cerebral cortical (E11.5-E14.5) ou progenitores cerebelar neurônio granular (CGNPs) do tecido pós-natal (P5-P7) e de forma eficiente immunoprecipitate H3K79me2 por PCR quantitativo (qPCR) e sequenciamento do genoma-largo.

Introdução

As funções cognitivas, motor e sensoriais do cérebro são altamente complexo e suscetível a mudanças físicas e ambientais. O cérebro é composto por três partes gerais o hind-, mid-e prosencéfalo, que estão profundamente ligados. Dentro do posencéfalo, o telencéfalo pode ser dividido em um telencéfalo dorsal (DT) e um telencéfalo ventral (VT). O DT de ratos consiste de seis camadas corticais que são formadas entre E11.5 e E18.5 em uma maneira de "dentro para fora"¹. O VT inclui as Eminências ganglionar em desenvolvimento, que mais tarde formam o gânglio basal²^,³. Vários tipos de células p....