Neste estudo, descrevemos a abordagem de canal semicircular posterior como um método confiável para a entrega de gene do ouvido interno em camundongos neonatais. Mostramos que a entrega do gene através do canal semicircular posterior é capaz de perfundir toda orelha interna.
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Artigo de método
Abordagem do Canal Semicircular posterior para a orelha interna Gene entrega no rato Neonatal
Neste artigo
Resumo
Resumo
Terapia de gene do ouvido interno uma grande promessa como um potencial tratamento para perda de audição e tontura. Um dos determinantes essenciais do sucesso da terapia de gene do ouvido interno é encontrar um método de entrega que resulta em eficiência de transdução consistente dos tipos de célula alvo, minimizando a perda de audição. Neste estudo, descrevemos a abordagem de canal semicircular posterior como um método viável para a entrega de gene do ouvido interno em camundongos neonatais. Mostramos que a entrega do gene através do canal semicircular posterior é capaz de perfundir toda orelha interna. A fácil identificação anatômica do canal semicircular posterior, bem como, manipulação mínima do osso temporal exigido, fazer neste cirúrgico aproximar-se uma opção atraente para entrega de gene do ouvido interno.
Introdução
Terapia de gene do ouvido interno é um campo de rápido desenvolvimento de investigação. Aplicação em vários modelos animais para combate ototoxicidade, trauma de ruído e de perda de audição hereditária1. Vários estudos recentes têm mostrado recuperação funcional da audição e funções de equilíbrio em camundongos mutantes após ouvido interno gene terapia entrega2,3,4,5,6, 7. um dos principais fatores na determinação do sucesso da terapia do gene de orelha interna é a abordagem cirúrgica utilizada para acessar o ouvido interno. Idealmente, a abordagem cirúrgica seria fácil de executar, os marcos anatômicos seria consistente e fácil de identificar e a transdução resultante de tipos de células alvo seria alta.
Em um estudo recente, mostramos que, quando a terapia do gene viral foi injectada através do canal semicircular posterior do rato mutante whirler (um modelo de perda auditiva e disfunção vestibular), transdução eficiente de células sensoriais do cabelo foi vista nos vestibulares órgãos, assim como a cóclea5. A alta eficiência de transdução sensorial cabelo célula resultou em melhora das funções auditivas e vestibulares nestes ratos mutantes.
Neste artigo, descrevemos em detalhe a abordagem de canal semicircular posterior para acessar o ouvido interno do rato neonatal.
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Protocolo
Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo Comitê de uso no Instituto Nacional de surdez e outros distúrbios de comunicação (NIDCD ASP1378-15) e cuidado Animal.
1. preparação e instalação do procedimento
- Esterilize todos os instrumentos com óxido de etileno no início do experimento. Entre os animais, limpe instrumentos usando a esterilização do grânulo.
- Carrega a solução contendo terapia genética viral em uma micropipeta no micro-injector. O vector viral utilizado neste estudo foi AAV2/8-whirlin (1 x 1013 genoma cópias por mililitro, consulte a tabela de materiais).
Nota: Normalmente, o volume total de 1,1 µ l é carregado na micropipeta.
2. anestesia
Nota: A tensão de rato utilizada neste estudo é o mouse whirler. Ambos homozigotos mutantes (quandowi/wi) e littermates heterozigotos (quando+ / wi) foram utilizados.
- Coloca a mãe em uma gaiola separada (separar o lixo).
- Coloque a gaiola em casa contendo a ninhada (P0 - P5 filhotes) sobre uma almofada de calor recirculação (conjunto a 37,5 ° C) para aquecer os ratos.
- Cortar a parte de dedo de uma luva de látex e coloque um filhote nele.
- Coloque o filhote no polegar da luva de látex em um balde de gelo para ~ 2 min.
- Coloque o filhote anestesiado em um pacote grande praça comercial congelamento de plástico com uma gaze 4 "x 4" entre o filhote e superfície do pacote.
- Encha uma luva de látex resistente com gelo picado e coloque a luva de gelo ao redor o filhote.
- Verificar se o filhote é devidamente anestesiado pela completa falta de resposta a estímulos diversos (incluindo uma pitada de dedo firme). Deixe o filhote na calota de gelo para a duração da cirurgia (aproximadamente 5-10 min).
Nota: Recomendamos deixar os filhotes na calota de gelo para não mais de 15 min durante a cirurgia.
3. abordagem cirúrgica (Figura 1)
- Limpe a pele atrás da orelha com uma compressa com iodo e uma compressa com álcool, uma vez que o animal é anestesiado.
- Faça uma incisão postauricular ~ 2 mm atrás da orelha usando microtesoura e dividir o músculo esternocleidomastoideo com microtesoura.
- Identifica o nervo facial e o bulla. O bulla é cartilaginoso e semi transparente nesta idade e situa-se medial ao nervo facial. A artéria estapédica pode ser vista através do bulla nesta idade, o que é um ponto de referência útil.
- Siga o nervo facial, superiormente e posteriormente para localizar o canal semicircular posterior (PSCC). Retire as fibras musculares e tecidos moles sobrejacentes o canal semicircular posterior usando microtesoura.
Nota: O PSCC é cartilaginoso nesta idade. - Penetra o PSCC usando uma micropipeta de vidro (~ 10 μm de diâmetro) na micro-injector.
- Terapia do gene viral Injete no ouvido interno.
Nota: Normalmente, um total de 20 injeções de 49 nL da terapia do gene são entregues para o canal semicircular posterior mais de 40 ~ s (volume total ~ 1 µ l). O título viral utilizado foi de 1 x 1013 genoma cópias / mL. - Feche a incisão de pele usando uma sutura de Poliglactina 5-0.
4. pós-operatório cuidados
- Coloque o filhote em uma almofada de aquecimento para restaurar uma temperatura normal do corpo durante a recuperação da anestesia com constante manual estimulação/rolamento com luvas dedos humanos.
- Uma vez que o filhote está acordado, colocá-lo volta para sua gaiola em casa.
- Acaricie cada filhote com um cotonete de algodão que tem sido exposto para a roupa de cama de gaiola em casa.
Nota: O propósito disto é ter os ratos cheirar como fizeram antes da cirurgia, o que aumenta a probabilidade da mãe re-aceitando seu pós-operatório de maca. Se possível, urina da mãe pode ser coletada e esfregada sobre os filhotes usando um cotonete para diminuir ainda mais a probabilidade de rejeição. - Aplicar óleo mineral para o nariz da mãe para dessensibilizar a8e reintroduzir a gaiola em casa com a mãe.
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Resultados
Injeção de AAV8-whirlin de terapia gênica em camundongos whirler neonatal através do canal semicircular posterior resultou em whirlin expressão (verde) em células ciliadas utricular (Figura 2), com a eficiência global de infecção de 53,1% (SD 38,1, n = 28)5 . Células de cabelo transduzidas tinha alongado Estereocílio (vermelho) em comparação com células ciliadas de orelhas não injectada contralaterais (5,35 ± 2.11 µm vs 3,20 ± 0,34 µm,...
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Discussão
Várias abordagens cirúrgicas têm sido descritas para acessar roedor ouvido interno. Cochleostomy e janela redonda abordagens são mais comumente usadas para acessar a cóclea, Considerando que o canal semicircular posterior e saco endolinfático abordagens são normalmente usadas para acessar os órgãos vestibulares1. Em um estudo recente, nós mostramos aquele canal semicircular posterior injeções da terapia do gene viral resultaram em alta eficiência de transdução celular cabelo em ambos os órgãos ves...
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Divulgações
Os autores têm sem divulgações relevantes para fazer.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por fundos do NIDCD divisão de Intramural Research /NIH (DC000082-02 para W.W.C.), bem como DC000081 para núcleo avançado de imagem. Agradecemos a equipe de instalação animal NIDCD por cuidar de nossos animais.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microscópio cirúrgico | Zeiss | OPMI Pico Microscópio otorrinolaringológico. Outros microscópios de dissecção também funcionariam. | |
| Micro-forcepts | Fine Science Tools | 11251-10, 11295-51 | #5 e #55 Dumont |
| Micro-tesoura | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Microinjetor Nanoliter2000 | World Precision Instruments | ||
| Almofada de aquecimento | Mastex | Modelo 500/600 | |
| 5-0 suturas de vicryl | Ethicon | ||
| AAV8-whirlin | Vector Biolabs | ||
| pipeta de vidro | Sutter Instruments | B100-75-10 | Vidro de borosilicato |
Referências
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Reimpressões e permissões
