Investigando os prejudiciais efeitos de baixa pressão Plasma esterilização na sobrevivência de esporos de Bacillus subtilis usando Live celular microscopia

Resumo

Este protocolo ilustra as etapas consecutivas importantes, necessárias para avaliar a pertinência de monitoramento parâmetro de vitalidade e os processos de reparação do DNA em reviving esporos de Bacillus subtilis após o tratamento com plasma de baixa pressão de tracking proteínas através do tempo-resolvido microscopia confocal e microscopia eletrônica de reparo de DNA marcado com fluorescência.

Resumo

Esterilização plasma é uma alternativa promissora para os métodos de esterilização convencionais para fins de exploração espacial e industrial, clínica. Descargas de baixa pressão plasma (LPP) contenham um amplo espectro de espécies ativas, que levam a inativação microbiana rápida. Para estudar a eficiência e a mecanismos de esterilização por LPP, usamos os esporos do Bacillus subtilis organismo teste por causa de sua extraordinária resistência contra procedimentos de esterilização convencionais. Descrevemos a produção de monocamadas de esporos de b. subtilis , o processo de esterilização por plasma de baixa pressão em um reator de plasma indutivo duplo, a caracterização da morfologia dos esporos usando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e o análise da germinação e consequência de esporos por microscopia de células vivas. Um alvo principal das espécies de plasma é material genómico (DNA) e reparo de lesões de DNA induzida por plasma sobre avivamento esporo é crucial para a sobrevivência do organismo. Aqui, podemos estudar a capacidade de germinação dos esporos e o papel do DNA reparo durante a germinação dos esporos e consequência natural após o tratamento com LPP rastreando fluorescente etiquetado DNA reparo proteínas (RecA) com microscopia de fluorescência confocal tempo-resolvido. Tratados e monocamadas de esporos não tratados são ativadas para a germinação e visualizadas com um microscópio invertido confocal célula viva ao longo do tempo a seguir a reação dos esporos individuais. Nossas observações revelam que a fração de germinação e superando os esporos é dependente da duração do LPP-tratamento, atingindo um mínimo após 120 s. RecA-YFP fluorescência (proteína de fluorescência amarela) foi detectada apenas em alguns esporos e desenvolvida em toda a superando as células com uma ligeira elevação no LPP-tratados esporos. Além disso, algumas das bactérias vegetativas derivado LPP-tratados esporos mostrou um aumento no citoplasma e tendiam a lyse. Os métodos descritos para análise de esporos individuais podem ser exemplares para o estudo de outros aspectos da germinação de esporos e consequência.

Introdução

Dos principais objetivos da exploração espacial é a busca de assinaturas de formas de vida e biomoléculas em outros planetas e luas em nosso sistema solar. A transferência de microorganismos ou biomoléculas de origem terrestre, de áreas críticas de exploração é de risco especial para o impacto do desenvolvimento e integridade das missões de deteção de vida em planetas como Marte e Europa¹. As diretrizes internacionais de proteção planetária, estabelecida pelo Comité de pesquisa espacial (sistema) em 1967, impor normas rigorosas em missões tripuladas e robóticas para outros planetas, suas luas, asteroides e outros corpos celestes e regular o lim....

Protocolo

1. produção de esporos de bacillus subtilis e purificação

1. Para a produção de esporos, transferir uma cultura da noite 5 mL das respectivas estirpe de b. subtilis , suplementada com antibióticos apropriados, para 200 mL dose dupla Schaeffer esporulação meio líquido (por litro caldo nutriente de 16G, KCl 2 g, 0,5 g de MgSO ₄* 7 H₂O, 2ml 1 M Ca (NO₃)₂, 2 mL 0,1 M MnCl₂ * • 4 H₂O, 2ml 1 mM Filipa₄, 2 mL de glicose 50% (p/v)¹⁸) e cultivá-lo com aeração vigorosa a 37 ° C por 72 h ou até > 95% da cultura tem esporulada. Os esporos dos seguintes est....

Resultados

Sobrevivência dos tratados com plasma b. subtilis esporos

Tratamento de plasma de esporos do b. subtilis utilizadas neste estudo show uma diminuição na sobrevivência com o aumento da duração do tratamento a plasma (Figura 2). Esporos da estirpe expressando o recA-gene fundido a YFP mostrou curvas de sobrevivência semelhante a esporos da estirpe selvagem tipo, indicando que a .......

Discussão

Esterilização de superfícies utilizando baixa temperatura, baixa pressão plasma é uma alternativa promissora para procedimentos de esterilização bastante convencional, tais como o tratamento com radiação ionizante a radiação, produtos químicos (por exemplo, gases como H₂O₂ ou óxido de etileno) ou calor seco e úmido,²³. Métodos de esterilização comum principalmente fornecem uma esterilização eficaz, mas eles são conhecidos por influenciar o material tratado e represen.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bico de duas substâncias (modelo 970-8)	Schlick	14.404	230 V, 50 Hz, D 4.484/8, diâmetro do furo de 0,8 mm
Luria Bertani Medium	Sigma Aldrich	70122-100G
Conectores de tubo	Festo	n/a	G 1/8
Válvula magnética DO35-3/2NC-G018-230AC	Bosch Rexroth	820005100
PLN Tubo de poliamida	Festo	558206	d = 6 mm
Corrediças de vidro	VWR	48300-026
Temporizador elétrico 550-2-C	Câmara	Gefran F000074	220 V
	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25 mm, redondo
MgSO4*7 H2O	Sigma Aldrich	13152
Ca(NO3)2	Sigma Aldrich	202967
MnCl2 * 4 H2O	Sigma Aldrich	244589
FeSO4 * 7H2O	AppliChem	13446-34-9
Caldo	da glicose Merck	215422
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G
(NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
placa de 96 poços	ThermoFisher	243656
Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
Leo 1530 Gemini	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
ZEN 2 e ZEN lite 2012 (Software)	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
SigmaPlot, versão 13.0 (Software estatístico)	Systat GmbH, Erkrath, Alemanha	n/a
Câmara celular Attofluor	Invitrogen	A7816
µ-Dish 35 mm, alta Grid-500 Fundo de vidro	ibidi	81168

de célula de attofluor nutriente