Uma identificação baseado em Rede Neural de ovócitos já crescido mentalmente competente ou incompetente do Mouse

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliação não invasiva de competência no desenvolvimento de oócito realizada durante sua em vitro maturação da vesícula germinal à fase de metáfase II. Este método combina imagens de lapso de tempo com análises de rede neural e Velocimetria por imagem (PIV).

Abstract

Clínicas de infertilidade beneficiaria a habilidade de selecionar mentalmente competente vs incompetente oócitos usando procedimentos invasivos, melhorando assim o resultado global da gravidez. Recentemente desenvolvemos um método de classificação baseado em observações ao vivo microscópicas de ovócitos de rato durante sua em vitro maturação da vesícula germinal (GV) à fase metáfase II, seguido da análise dos movimentos citoplasmáticos ocorrem durante este período de lapso de tempo. Aqui, apresentamos protocolos detalhados deste procedimento. Oócitos são isolados de folículos antrais já crescidos e cultivados para 15 h no interior de um microscópio equipado para a análise de lapso de tempo a 37 ° C e 5% de CO₂. Fotos são tiradas em intervalos de 8 min. As imagens são analisadas usando o método Particle Image Velocimetry (PIV) que calcula, para cada oócito, o perfil de velocidades de movimento citoplasmático (CMVs) ocorrendo durante todo o período de cultura. Finalmente, os CMVs de cada único oócito são alimentados através de uma ferramenta de classificação matemática (Feed-forward de Rede Neural Artificial, FANN), que prevê a probabilidade de um gameta ser mentalmente competente ou incompetente com uma precisão de 91.03%. Este protocolo, configurar para o mouse, agora poderia ser testado em oócitos de outras espécies, incluindo seres humanos.

Introduction

Infertilidade feminina é uma patologia que afecta um número crescente de mulheres. De acordo com a Organização Mundial de saúde, cerca de 20% dos casais são inférteis, com um 40% devido à infertilidade feminina. Além disso, um terço das mulheres passando por tratamentos contra o cancro (300.000 por ano e 30.000/ano nos EUA e Itália, respectivamente) desenvolver falência ovariana prematura.

Uma estratégia para impedir a infertilidade em pacientes com câncer é o isolamento e criopreservação de folículos nos ovários antes do tratamento oncológico, seguido em vitro maturação (IVM) de ovócitos GV à fase MII (transição de GV-para-MII). A....

Protocol

Todos os procedimentos que envolvam animais foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso e comitês de ética na Universidade de Pavia. Os animais foram mantidos em condições de 22 ° C, umidade do ar de 60% e um ciclo claro/escuro de 12:12 h.

1. ovário isolamento

1. Injete intraperitonealmente 2-para-quatro as onze semanas CD1 ratos fêmeas com 10 U de hormônio folículo estimulante com uma seringa de insulina de 1ml estéril.
2. Espere 46-48 h.
3. Pesar o mouse e anestesiar com uma injeção intramuscular de 50 mg/kg de Zoletil (zolazepan Tiletamina e cloridrato). Eutanásia por deslocamento cervical.
4. S....

Results

A Figura 2 mostra um representante oócito mentalmente competente e incompetente, respectivamente no início (GV) e no final do procedimento de IVM (MII). IVM de ovócitos de rato já crescido ocorre durante a cultura de 15 h. A observação de lapso de tempo grava a progressão da meiose e detecta grandes eventos meióticos, incluindo a GVBD e a extrusão do primeiro corpo polar.

Análise e comparação de mai.......

Discussion

Existem várias etapas críticas um deve cuidar da durante a execução do presente protocolo com oócitos de rato, bem como com os de outras espécies. Uma vez isolados de seus folículos, oócitos devem ser imediatamente transferidos para as gotas de gravação, como a separação do cumulus companheiro células disparadores o início da transição GV-para-MII. Uma eventual modificação do presente protocolo pode ser a adição de 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) para o meio de M2 utilizado para isolamento de COCs. IBMX impede o desen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Folligon	Intervet	A201A02	Tratamento hormonal
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	Para coloração de heterocromatina de oócitos
Cultura de células Placa de Petri 35 mm x 10 mm	Corning	430165	Para isolamento de COCs
EmbryoMax M2 Medium (1X), Líquido, com vermelho de fenol	Merck-Millipore	MR-015-D	Para isolamento de COCs
MEM Alpha medium (1X) + Glutamax	Sigma-Aldrich	M4526	Para maturação in vitro de oócitos
Cultura de células Placa de Petri 35 mm com fundo de vidro	WillCo	GWSt-3522	Para experimentos de imagem
BioStation IM-LM	Sistema	de triagem de células ao vivo	Nikon MFA91001
Pipeta Pasteur	Delchimica Scientific Glassware	6709230	Para manipulação de folículos
Óleo mineral	Sigma-Aldrich	M8410	Para prevenir contaminação e evaporação do meio
Penicilina / Estreptomicina	Life Technologies	15070063	Para prevenir contaminação do meio
Soro bovino fetal (FBS)	Sigma-Aldrich	ML16141079	para compor &alfa; Meio MEM
L-Glutamina	Life Technologies	25030	Para maquiagem α Meio MEM
Taurina	Sigma-Aldrich	T0625	Para compor α Meio MEM
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A3310	para compor α Meio MEM
Piruvato de sódio	Sigma-Aldrich	P4562	Para maquiagem &alfa; Mídia MEM
Zoletil (cloridrato de Tiletamina e Zolazepan)	Virbac Srl QN01AX9		Para anestesia Cell_PIV software de camundongos
	Gentilmente cedido pelo Dr. Shane Windsor, Universidade de Bristol, Reino Unido	-	-
MATLAB	O MathWorks, Natick, MA	-	Para computação numérica multiparadigma