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Artigo de método

Estudo do metabolismo in vivo da glicose em camundongos alimentados com dieta de alto teor em gordura usando o teste oral de tolerância à glicose (OGTT) e o teste de tolerância à insulina (ITT)

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DOI:

10.3791/56672

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7 de janeiro de 2018

 , 
1Department of Laboratory Medicine, Medical University of Vienna

Neste artigo

Resumo

O atual artigo descreve a geração e caracterização metabólica de ratos alimentados com dieta de alto teor de gordura como um modelo de obesidade e resistência à insulina induzida pela dieta. Possui ainda mais protocolos detalhados para executar o teste de tolerância à glicose oral e o teste de tolerância à insulina, monitoramento de alterações de todo o organismo de glicose metabolismo na vivo.

Resumo

A obesidade representa o mais importante fator de risco único na patogênese do diabetes tipo 2, uma doença que se caracteriza por uma resistência à captação de glicose estimulada por insulina e uma descompensação bruta do metabolismo da glicose sistémica. Apesar dos progressos consideráveis na compreensão do metabolismo da glicose, os mecanismos moleculares da sua regulação na saúde e na doença permanecem sob-investigado, enquanto novas abordagens para prevenir e tratar o diabetes são urgentemente necessárias. Níveis de dieta derivada de glicose estimula a secreção pancreática de insulina, que serve como o principal regulador dos processos anabólicos celulares durante o estado alimentado e, assim, equilibra a glicose no sangue para manter o status de energia sistêmica. Sobrealimentação disparadores meta-inflamação crônica, que leva a alterações na insulina periférica associada do receptor a sinalização e assim reduz a sensibilidade à eliminação de glicose mediada por insulina. Esses eventos, finalmente, resultam na glicemia de jejum elevada e níveis de insulina, bem como uma redução na tolerância à glicose, que por sua vez, servem como importantes indicadores da resistência à insulina. Aqui, apresentamos um protocolo para a geração e caracterização metabólica de dieta hiperlipídica (HFD)-alimentou ratos como modelo usado com frequência de resistência à insulina induzida pela dieta. Podemos ilustrar em detalhes o teste de tolerância à glicose oral (OGTT), que monitora a disposição periférica de uma secreção de carga e insulina glicose administrada por via oral ao longo do tempo. Além disso, apresentamos um protocolo para o teste de tolerância à insulina (ITT) monitorar a ação da insulina de corpo inteiro. Juntos, esses métodos e suas aplicações a jusante representam ferramentas poderosas para caracterizar o fenótipo metabólico geral de ratos, bem como avaliar especificamente alterações no metabolismo da glicose. Eles podem ser especialmente úteis no campo de pesquisa amplo de resistência à insulina, diabetes e obesidade para fornecer uma melhor compreensão da patogênese, bem como para testar os efeitos de intervenções terapêuticas.

Introdução

No mundo desenvolvido, obesidade e diabetes atingiu dimensões epidemias devido à inatividade física e o consumo excessivo de alimentos processados, efeitos que são impulsionados pela rápida urbanização, industrialização, bem como a globalização. Embora pesquisas sobre resistência à insulina e é co-morbidades, tais como dislipidemia e aterosclerose, ganhou destaque durante as últimas décadas, os mecanismos biológicos complexos que regulam o metabolismo na saúde e na doença permanecem incompleta Entendido e ainda há uma necessidade urgente de novas modalidades de tratamento prevenir e tratar essas doenças1.

Insulina e é counter-regulatory hormônio glucagon servem como os principais reguladores do balanço de oferta e macronutrientes energia celular, mantendo assim também de concentrações de glicose de sangue sistêmico adequado2. Glicose em si atua como um dos principais estimuladores da secreção de insulina pelas células β do pâncreas, enquanto outros macronutrientes, fatores humorais bem como entrada neural mais modificar essa resposta. Insulina, consequentemente, desencadeia os processos anabólicos do estado federal facilitando a difusão de glicose no sangue em excesso em músculos e células de gordura e mais ativando glicólise, bem como proteínas ou síntese de ácidos graxos, respectivamente. Além disso, insulina suprime a saída de glicose hepática, inibindo a gliconeogênese. Consumo de energia em excesso crônico e meta-inflamação levar a hiperinsulinemia e a resistência de insulin periférica devido a para baixo-regulamento da expressão do receptor de insulina, bem como alterações nas vias de sinalização a jusante, resultando assim em prejudicada sensibilidade à eliminação de glicose mediada por insulina, bem como a insuficiente inibição da produção hepática de glicose3,4,5,de6.

Uma vasta gama de modelos animais com indução experimental, nutricional ou genética da doença tem sido provado para ser excelentes ferramentas para estudar os mecanismos moleculares da resistência à insulina e várias formas de diabetes, bem como seus acompanhamento doenças7 . Um exemplo é o modelo amplamente utilizado e bem estabelecida HFD-induzido do rato, que é caracterizado pelo rápido ganho de peso devido ao aumento da ingestão dietético em combinação com redução da eficiência metabólica, resultando em insulina resistência8, 9. tanto em modelos animais e humanos, uma elevação em jejum níveis sanguíneos glicose e insulina, bem como uma tolerância prejudicada à administração de glicose são utilizados indicadores de resistência à insulina e outras alterações sistêmicas de glicose metabolismo. Monitoramento glicose e insulina os níveis de sangue no estado basal ou após estimulação, portanto, são leituras facilmente acessíveis.

O presente protocolo descreve a geração de HFD-alimentou ratos, bem como dois métodos usados com frequência, o teste de tolerância à glicose oral (OGTT) e teste de resistência a insulina (ITT), que são úteis para caracterizar o fenótipo metabólico e investigar alterações no metabolismo da glicose. Descrevemos o OGTT detalhadamente, que avalia a eliminação de uma secreção de carga e insulina glicose administrada por via oral ao longo do tempo. Além disso, nós fornecemos instruções sobre como conduzir a ITT para investigar a insulina-ação do corpo inteiro ao monitorar a concentração de glicose do sangue em resposta a um bolus de insulina. Os protocolos descritos neste artigo são bem estabelecidos e têm sido usados em vários estudos10,11,12. Além de pequenas modificações que podem ajudar a aumentar o sucesso, nós fornecemos orientações para delineamento experimental e análise de dados, bem como dicas úteis evitar possíveis armadilhas. Os protocolos descritos neste documento podem ser ferramentas muito poderosas para investigar a influência da genéticas, farmacológicas, dietéticas e outros fatores ambientais sobre o metabolismo de glicose de corpo inteiro e em seus distúrbios associados como resistência à insulina. Estimulação com glicose ou insulina, além de uma variedade de outros compostos pode ser utilizada para estimulação dependendo da finalidade da pesquisa individual. Embora fora do escopo deste manuscrito, muitas outras aplicações a jusante podem ser executadas sobre as amostras de sangue desenhada, como a análise dos valores de sangue além de glicose e insulina (por exemplo, lipídios e lipoproteínas perfis) bem como detalhadas análise dos marcadores metabólicos (por exemplo, pela reação em cadeia de polimerase (PCR) quantitativa em tempo real, análise ocidental do Borrão e ensaio de imunoabsorção Enzyme-Linked (ELISA)). Ainda mais a citometria de fluxo e fluorescência ativado celular classificação (FACS) podem ser aplicadas para investigar os efeitos nas populações distintas única célula, enquanto transcriptomic, proteómica e metabolómica abordagens também podem ser utilizadas para análise não segmentado.

No geral, nós fornecemos um protocolo simples para gerar um modelo de rato induzida por HFD, enquanto descrevia ainda mais duas abordagens poderosas para estudar alterações metabólicas de todo o corpo, o OGTT e a ITT, que pode ser ferramentas úteis para estudar a patogênese da doença e desenvolvimento de novas terapias, especialmente no campo do metabolismo associadas a doenças como resistência à insulina e diabetes.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso da universidade médica de Viena e cuidado Animal e realizados de acordo com a Federação de Europeu laboratório Animal ciência associações (FELASA). Por favor, note que todos os procedimentos descritos no presente protocolo só devem ser realizados após a aprovação governamental e institucional, bem como pelo pessoal que são tecnicamente eficientes.

1. HFD-alimentou ratos

Nota: Manter todos os camundongos C57BL/6J em um ciclo de luz/escuro de 12-h com acesso gratuito à comida e água.

  1. Com 6 semanas de idade, coloque os ratos para 8-12 semanas em um HFD (40-60% gordura calorias) para induzir a obesidade, enquanto o grupo-controle magro de alimentação uma dieta de baixo teor de gordura (LFD) (10% de gordura calorias).
  2. Determine o peso corporal dos ratos em uma base semanal. As curvas de peso devem mostrar padrões similares em ambos os grupos, com uma inclinação superior no grupo HFD-alimentados.

2. OGTT

Nota: Se os pontos de tempo de amostragem de sangue são escolhidos durante OGTT a cada 15 min, o experimento deve ser realizado com um máximo de 15 ratos em paralelo, a fim de ter pelo menos 1 min-tempo de manuseio por rato.

  1. Preparativos no dia anterior OGTT
    1. Transferir os ratos em uma gaiola com roupa de cama fresca e rápido-los durante a noite antes do teste (14 h), garantindo que os ratos têm acesso à água potável (por exemplo, remover o alimento às 18:00 para uma hora de início, na manhã seguinte às 08:00).
      Nota: Ratos de jejum durante a noite é a abordagem padrão, no entanto um jejum mais curto (5-6 h) é mais fisiológico para ratos (veja a discussão para detalhes).
  2. Preparativos no dia do experimento (mas antes da experiência)
    1. Prepare-se 10 mL da solução de glicose de 20% (dissolver D-(+)-glicose em água destilada).
      Nota: Todos os reagentes que são administrados aos animais tem que ser classe farmacológica e estéril.
    2. Preparar uma placa de 96 poços para coleta de plasma, através do preenchimento de um poço para cada ponto de tempo de amostragem e cada rato, com 5 µ l NaEDTA (0,5 M EDTA, pH 8.0 em 0,9% NaCl, armazenamento em RT). Durante o experimento, armazene esta placa no gelo.
      Nota: Ver complementar Figura 1 para uma lista de verificação detalhada.
  3. Medir o peso corporal de todos os mouses e marcar suas caudas com um marcador permanente para que os ratos facilmente distinguíveis (por exemplo, traço do rato 1 = 1, traços de rato 2 = 2, etc.).
  4. Medição de glicose e de amostra de sangue (Figura 2)
    1. Cuidadosamente corte 1-2 mm da ponta da cauda com uma tesoura afiada ("A variante" na Figura 2). Sempre limpe a primeira gota de sangue para evitar hemólise ou contaminação com fluido de tecido antes de tomar amostras de sangue novo para determinação de glicose do sangue. Desenhe uma amostra pequena de sangue (~ 3 µ l) para a medição do nível de glicose sangue basal (= ponto de tempo 0) com o glicosímetro.
      Atenção: Verifique e ajuste o número de carga de tiras de teste em um monitor de glicose.
      Nota: Como um método de amostragem de sangue alternativo, cortar a veia lateral da cauda de um rato com uma lâmina de bisturi afiado ("variante B" na Figura 2). Veia lateral da cauda geralmente é acessada aproximadamente um terço ao longo do comprimento da cauda da ponta da cauda, movendo-se em direção à base da cauda para várias amostras. Recomenda-se o uso de um creme anestésico local. Interromper o fluxo de sangue, aplicando pressão com o dedo sobre os tecidos moles pelo menos 30 s antes que o animal é retornado à sua jaula.
    2. Recolha uma amostra de sangue (cerca de 30 µ l) usando um tubo capilar fresco (manter o tubo capilar horizontal). Esvazie o tubo capilar com uma pipeta, colocando a ponta da pipeta na parte superior da extremidade do tubo capilar e, com cuidado, empurrando o sangue coletado em um poço da placa de 96 poços, evitando bolhas de ar. Repita este procedimento para todos os mouses - um de cada vez.
      Nota: Como uma alternativa para coleta de sangue através de um tubo capilar, usar uma pipeta ajustada para o volume correcto (por exemplo, 30 µ l) para coletar o sangue, ou coletar uma gota de sangue da cauda na película de parafina e pipeta-para a solução de EDTA. Estritamente, evite o contato da vaselina com tiras de teste de sangue ou glucometer, como ele pode influenciar medições posteriores de glicose e insulina.
      Atenção: O OGTT é muito estressante para ratos: ratos magros podem perder cerca 15% de seu peso corporal durante um jejum durante a noite. Além disso, amostras de sangue em pontos diferentes do tempo leva a uma considerável perda de sangue. Para amostragem de sangue mais fácil, é possível massagear cuidadosamente o mouse-tail com vaselina.
      Nota: As orientações institucionais podem limitar a quantidade admissível de sangue coletado dentro de um determinado período. Os volumes de amostragem e momentos devem ser ajustados para não exceder os valores máximos permitidos. O peso corporal dos ratos deve ser usado para calcular o total permitida de retirada de sangue.
  5. Calcular o volume necessário de solução de glicose com base no peso corporal (1G glicose/kg de peso; esta pode ser aumentada até 3 g/kg) deve ser administrado por gavagem oral para cada rato. Por exemplo, um mouse com um peso de 30 g precisaria de 150 µ l de uma solução de glicose de 20% para administrar a 30 mg de glicose.
    Nota: Para a base a dose de glicose no peso do rato é o procedimento padrão. Se estiverem disponíveis dados de composição do corpo, a dose de glicose OGTT deve ser calculado com base na carne magra massa corporal (ver discussão para detalhes).
  6. Administração de glicose
    1. Prepare tudo o que é necessário durante todo o experimento com antecedência (temporizador, folha de registo do experimento, seringas de tiras, capilares e monitor de glicose, solução de glicose, placa de 96 poços, bisturi, calculadora, equilíbrio, marcador permanente, os papéis do banco, um pipeta com uma ponta e luvas).
    2. Para aplicação de glicose, contenha o rato agarrando-a firmemente pela nuca. Aplique bastante firmeza para a pele ao redor do pescoço para impedir que o mouse torcendo fora a conter e devidamente incline sua cabeça para trás. Também, certifique-se de que o rato pode respirar corretamente.
      Nota: Uma vez que a administração de glicose é iniciada, gerenciamento de tempo bom é muito importante.
    3. Administre com cuidado a solução de glicose (com base na etapa 2.5) diretamente para o estômago, usando uma agulha de alimentação. Cautelosamente direto a agulha alimentação através da boca para o esôfago. Permitir que o mouse para engolir a agulha: a agulha afunda-se inteiramente dentro do esôfago/estômago inferior do mouse. Então injete a solução de glicose (Figura 3a).
      1. Se encontrar qualquer resistência ou se o animal se esforça imediatamente, retirar a agulha e reposicioná-lo. Iniciar o temporizador imediatamente após a primeira gavagem e administrar glicose para todos os outros ratos em intervalos de 1 min.
        Nota: Pode ser útil aplicar uma gota de solução de glicose diretamente da agulha de alimentação para a boca do rato, que estimulará a lamber e engolir, facilitando, assim, mais fácil inserção da agulha alimentação. Não aplique pressão ao inserir a agulha de alimentação como isto pode ferir gravemente o animal.
  7. Depois de 15 min, medir os níveis de glicose do sangue com o glicosímetro e além disso tirar amostras de sangue (~ 30 µ l) (como descrito em detalhe na etapa 2.4) de cada mouse na mesma ordem, como eles foram injetados.
    Nota: A gestão do tempo é muito importante; seguem-se tanto quanto possível, usando os mesmo intervalos de tempo quanto a gavagem. Deixe os ratos circular tão livremente quanto possível e limite de restrição a um mínimo durante todo o processo para reduzir o stress, que pode modificar os resultados. Leite a cauda com uma mão e coletar o sangue com o outro.
  8. Repita a etapa 2.7 em pontos de tempo selecionado, dependendo dos resultados esperados (por exemplo, em 30, 45, 60, 90, 120, 150 e 180 min após a administração de glicose). Se os pontos de tempo selecionado são mais de 120 min, certifique-se de que os ratos têm acesso à água potável. Certifique-se de que os ratos sempre têm acesso à água potável. Quando terminar com o experimento, retorne os ratos para casa gaiolas equipadas com comida e água.
    Atenção: O OGTT é muito desgastante para os ratos. Portanto, espere pelo menos 1 semana antes de realizar o próximo teste metabólico, tais como um ITT.
  9. Após o experimento, Centrifugar as amostras de sangue em 2.500 x g, 30 min, 4 ° C. Transferi o sobrenadante (plasma) para esvaziar as cavidades da placa e armazená-lo a-20 ° C até análise.
    1. Gravar a hemólise das amostras, se presente (ver secção 3).
  10. Determinar os níveis de insulina de plasma usando um ELISA comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as instruções do fabricante do kit.
    Nota: Dependendo do estado de jejum, bem como sobre o metabolismo dos ratos investigados, dificuldades durante este ensaio podem ocorrer: níveis de insulina de jejum durante a noite (ponto de tempo 0) aproximam-se muito baixo e, portanto, o limite de detecção. Para evitar esse problema, dobrar a quantidade de volume de plasma recomendados e consequentemente reduzir pela metade o resultado do ensaio ELISA. Por outro lado, se os ratos alcançar o pico de insulina durante OGTT, especialmente em ratos HFD-fed, os níveis de insulina podem exceder o limite de detecção: diluir a amostra (por exemplo, 10 vezes com 0,9% NaCl) e repetir o ensaio de ELISA. Hemólise em amostras de plasma pode levar à degradação da insulina, resultando em uma diminuição dos valores de leitura. A degradação depende do tempo, temperatura e a concentração de hemoglobina na amostra. Sempre manter amostras hemolisadas frio ou no gelo para reduzir a degradação de insulina.

3. ITT

Nota: As mesmas precauções descritas para OGTT (manipulação de camundongos, sangue, glicosímetro e uso vaselina) também deve ser aplicada ao realizar a ITT. Por exemplo, todas as injeções devem ser efectuadas 15 min em intervalos de 1 min se 15 ratos são testados em paralelo. Para a ITT, subsequente coleta de amostras de sangue com tubos capilares é opcional.

  1. Preparações antes do experimento
    1. Rápido de ratos pelo menos 2 h antes da injeção de insulina, garantindo que os ratos têm acesso à água potável (por exemplo, remover o alimento às 08:00, teste de ratos 2-5 h mais tarde).
    2. Diluir a insulina 1:1,000 em 0,9% NaCl (estoque: 100 insulina U/mL; trabalho concentração 0.1 U/mL) e prepare-se 20% de glicose (D-(+)-solução de glicose dissolvida em água destilada) deve ser administrado se os ratos tornam-se hipoglicemia.
      Nota: A ITT normalmente é realizada após um rápido curto para evitar o hipoglicemia, que caso contrário pode ocorrer na noite jejuou animais. Todos os reagentes que são administrados aos animais precisam ser classe farmacológica e estéril.
  2. Medir o peso corporal de ratos, marcar a cauda, corte a ponta da cauda com uma tesoura afiada e medir glicemia basal como descrito anteriormente para o OGTT na etapa 2.4.
  3. Injeção de insulina
    1. Para injetar insulina intraperitonealmente (0,75 U insulina/kg de peso corporal, calculado de antemão), conter o mouse pelo método de nuca.
    2. Use um fresco, estéril 27 ou 30 medidor de agulha para cada animal evitar o desconforto e o risco de qualquer infecção do local da injeção.
      Nota: A esterilização da pele pode prolongar a duração da administração de insulina e assim pode causar perturbações adicionais para o animal. Portanto, não é recomendável.
    3. Incline a cabeça do rato para baixo em um ângulo ligeiro para expor o lado ventral do animal. Coloque a agulha com o bisel para cima e em um ângulo de 30 ° no quadrante inferior direito do abdômen do animal (Figura 3b). Inicie o temporizador imediatamente após o primeiro rato é injetado.
      Nota: É de baixa dose (0,1 U/kg) podem ser realizados para avaliar especificamente a sensibilidade hepática à insulina. Quanto o OGTT, cálculo do volume de injeção com base no peso corporal é o procedimento padrão, enquanto baseando a dose corporal magra massa é preferida se estiverem disponíveis dados de composição do corpo.
  4. Medir os níveis de glicose no sangue em pontos de tempo selecionado (por exemplo, após 15, 30, 45, 60 e 90 min).
    Nota: Como a insulina tem um curto intervalo de ~ 10 min em ratos13, tarde diferenças após a administração de insulina (por exemplo, depois de 2 h) podem não refletir um efeito direto da ação da insulina. Administrar a solução de glicose de 20% no caso de um mouse torna-se hipoglicemia (níveis de glicose abaixo de 35 mg/dL de sangue) e está em risco de morrer.
  5. Depois que o tempo final aponta, coloque os ratos volta em suas gaiolas casa preparadas com muita comida e água.

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Resultados

A Figura 1 ilustra um cronograma esquemático para fenotipagem metabólico de ratos em dietas. Com uma idade de aproximadamente 6 semanas, os ratos devem ser colocados em um HFD, enquanto um LFD-grupo pode servir como grupo controle. Importante, peso corporal deve ser determinado semanalmente para observar se há um esperado aumento no peso corporal. Qualquer tipo de stress (por exemplo, ruído ou comportamento agressivo masculino) pode interferir no gan...

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Discussão

Com a alta prevalência de diabetes e doenças associadas na população do mundo, há uma forte exigência de pesquisa abordando o mecanismo molecular, prevenção e tratamento da doença de19. O protocolo apresentado descreve métodos bem estabelecidos para a geração de ratos HFD, um robusto modelo animal usado para investigação metabólica, bem como a condução do OGTT e ITT, que são potentes ferramentas para a avaliação de alterações metabólicas de corpo inteiro tais como resistência à insulina. Os método...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo médico científico do prefeito da cidade de Viena e o Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cepa de camundongo: C57BL/6JThe Jackson Laboratory664LFD/HFD
Accu Chek Performa - GlicosímetroRoche6870228OGTT/ITT
Accu Chek Performa - TirasRoche6454038OGTT/ITT
D-(+)-Solução de glicoseSigma-AldrichG8769OGTT
Actrapid - InsulinaNovo Nordisk417642ITT
Agulhas de alimentação reutilizáveisFine Science Tools#18061-22OGTT; calibre 22 (calibre -24 para camundongos jovens)
Seringas de dosagem Omnifix-FineBraun9161406VOGTT/ITT
Agulha de insulina Sterican (30G x 1/3"; ø 0,30 x 13 mm)Braun304000ITT; camundongos magros
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0,40 x 20 mm)   Braun4657705ITT; camundongos em
placas de PCR de 96 poços HFD, sem rodapé, flexíveisBraintree Scientific, Inc.SP0016Kit
ELISA de insulina de camundongo ultrassensívelCrystam Chem90080OGTT
Dieta de roedores com 60% de kcal% de gorduraResearch Diets IncD12492camundongos em
dieta de roedores HFD com 10% de kcal% de gordura.Research Diets IncD12450Bcamundongos com
micro hematócrito capilar da marcaSigma-AldrichBR749321OGTT / ITT
Vaselina - cremeRivieraP1768677OGTT / ITT
OGTT LFD

Referências

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