Artigo de método

Induzindo a recombinação de Cre-lox no córtex Cerebral de rato através da eletroporação no Utero

11.7K vistas

⸱

DOI:

10.3791/56675

⸱

17 de novembro de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, James Madison University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Funções celulares autónomos de genes no cérebro podem ser estudadas através da indução de perda ou ganham de função em esparsas populações de células. Aqui, descrevemos no utero electroporation para entregar recombinase Cre em populações esparsas de desenvolver os neurônios corticais com genes de floxed para causar a perda da função em vivo.

Resumo

Autónoma-célula neuronais funções dos genes podem ser reveladas, causando perda ou ganham de função de um gene em uma população pequena e esparsa de neurônios. Para fazer isso requer gerando um mosaico em que neurônios com perda ou ganho de função de um gene são rodeados por tecido geneticamente imperturbável. Aqui, nós combinamos o sistema de recombinação de Cre-lox com eletroporação no utero para gerar tecido de cérebro de mosaico que pode ser usado para estudar a função celular autónomos de genes nos neurônios. DNA construções (disponível através de repositórios), que codifica para uma etiqueta fluorescente e Cre recombinase, são introduzidos em desenvolver os neurônios corticais que contém genes ladeados com loxP sites nos cérebros de embriões de rato usando utero em eletroporação. Além disso, descrevemos várias adaptações para o método de eletroporação no utero que aumentam a capacidade de sobrevivência e reprodução. Esse método também envolve o estabelecimento de um título para recombinação mediada por Cre em uma população esparsa ou densa de neurônios. Preparações histológicas do tecido cerebral rotulado não exigem (mas pode ser adaptadas para) imuno-histoquímica. As construções utilizadas garantem que fluorescente etiquetado neurônios carreg o gene recombinase Cre. Preparações histológicas permitem a análise morfológica dos neurônios através da imagem latente confocal de mandris dendríticas e axonal e espinhas dendríticas. Porque a perda ou ganho de função pode é feito de tecido mosaico esparsas, esse método permite que o estudo da célula autónomos necessidade e suficiência do gene produtos na vivo.

Introdução

Gerar um mosaico genético é um paradigma clássico experimental para a compreensão da função de um gene de interesse. Para determinar se um gene é necessário para um fenótipo celular, a abordagem mais simples é causar uma perda de função do gene em todo o organismo (por exemplo, nocaute). No entanto, para determinar se um gene é necessário especificamente em um determinado tipo de célula, nocaute do gene em todo o organismo não é uma abordagem válida. Em vez disso, um método é necessário que causará a perda da função de um gene em uma determinada célula enquanto está rodeado por tecido de sua (ou seja, geneticamente imperturbável) — em outras palavras, criando tecidos de mosaico. Se a célula mutante mostra um fenótipo mutante, mas células circundantes de sua não, fazem as funções de gene de forma autónoma a célula. Análise do tecido do mosaico, no qual as células mutantes estão rodeadas por tecido de sua, é ideal para compreender a célula autónomos funções dos genes, especialmente no cérebro onde os neurônios e glia formam uma vasta rede interligada de tecido.

Várias formas de tecido cerebral de mosaico forneceram modelos poderosos para investigar a célula autónomos funções dos genes. Estudos focados em transplante neuronal1, mosaicismo feminino ligado ao X2,3,4, e mosaicismo somático endógena5,6 ter desenhado suas conclusões com base em mosaico tecido cerebral. Exclusão condicional de um gene através do sistema de recombinação de Cre-lox é um método que tira proveito da grande disponibilidade de linhas de rato transgénico. Neste método, os dois sites loxP são introduzidos em ambos os lados de uma sequência necessária de um gene (tais como um exon), deixando ladeado por loxP sites que ambos enfrentam na mesma direção ("floxed"). CRE recombinase excises a sequência entre os sites de loxP7. Mediada por CRE recombinação pode ser conseguida cruzando ratos de floxed para outra linha de rato que expressam a recombinase Cre junto com um marcador fluorescente em um subconjunto de células ("linha de repórter de Cre"). Isto foi demonstrado em uma variedade de maneiras para descobrir as funções de um gene em subconjuntos de células, como neurônios excitatórios ou astrócitos8. Linhas de repórter CRE podem expressar CreERT2 para permitir a recombinação mediada por Cre ser droga-inducible (single-neurônio etiquetando com nocaute inducible Cre-mediada, ou SLICK)9. Em outra estratégia chamada análise de mosaico com dobro de marcadores (MADM)10,11, mediada por Cre interchromosomal recombinação permite um mutante homozigoto ser criado ao lado de tecido heterozigoto. Essas abordagens, uma nova linha de mouses precisa ser produzido cada vez para cada gene candidato ou subtipo de celular que é testado. Alternativamente, Cre recombinase pode ser introduzido pós-natal a iontoforese12 ou por meio de vetores virais (por exemplo, vírus adeno-associado13 ou lentivírus14 carregando celular subtipo específico promotores). Essa estratégia cria forte e pós-natal de rotulagem. Para direcionar o desenvolvimento de neurônios corticais cerebrais escassamente e pré-natal, uma estratégia ideal é no utero electroporation da Cre recombinase com um marcador fluorescente.

Além de combinar recombinação Cre-lox através no utero electroporation para produzir mosaico tecido na vivo, nós introduzimos várias adaptações aos procedimentos de outros protocolos publicados15,16, 17,18,19,20,21. Nós fornecemos informações para melhorar o sucesso em grávidas cronometrado fêmeas reprodutoras. Também descrevem nossas duas estratégias para introduzir esparsas e brilhantes rotulagem dos neurônios no tecido cortical: uma estratégia é titula-se os níveis de um único construto codifica para Cre recombinase e um marcador fluorescente22. Outra estratégia é usar o sistema de "Supernova", projetado especificamente com esses parâmetros em mente23,24. Além disso, oferecemos melhorias na produção de pipetas de microinjeção consistente e simplificações para a cirurgia de eletroporação no útero . Finalmente, nós esboçamos passos críticos em uma preparação histológica simplificado que permite a análise de espinhas dendríticas e mandris dendríticas e axonal, sem coloração adicional ou imuno-histoquímica.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (ACUC) da Universidade de James Madison e cuidado Animal e estão em conformidade e conformidade com todas as orientações institucionais e regulamentares pertinentes.

1. Mouse set-up

  1. Um jovem de casa (> P60) masculino e feminino floxed homozigotos mouse juntos para configurar um par de obtentor25.
    Nota: Um bom controle negativo é configurar um par adicional criador de sua ratos, no qual Cre expressão recombinase não causará um mosaico de26.
  2. Permitir que a fêmea dá à luz e criar sua primeira ninhada com o macho. Mantenha o macho junto com a fêmea para aumentar a sobrevivência da ninhada. Após o desmame da ninhada, por exemplo, no dia pós-natal (P) 21, separe a fêmea e macho.
  3. Reprodutores de murino
    1. Configure um acasalamento cronometrado entre o feminino e masculino,25. Use pistas visuais para determinar o ciclo de cio da fêmea27e verifique para plugues vaginais na manhã após o acasalamento25.
    2. Se for encontrado um plug, separar e pesar a fêmea. Conte o dia como o dia embrionário (E) 0,5.
    3. Continue pesando a fêmea a cada 3-5 dias para determinar se ela está grávida. As fêmeas grávidas terão um aumento de 10-20% no peso corporal 7-10 dias após a concepção (E0).
      Nota: Este passo confirma gravidez mais cedo e mais confiável do que a inspeção visual25.
    4. Se a fêmea não está grávida, repita os passos 1.3.1-1.3.3.
  4. Uma vez que a gravidez é confirmada, escolha a data da eletroporação no útero . Para atingir a camada II/III cortical piramidal neuronais progenitores, execute eletroporação no E15.5.

2. set-up DNA

  1. Escolha um único DNA construir esse códigos para Cre recombinase, bem como um marcador fluorescente, tais como a proteína verde fluorescente (GFP)28,29. Como alternativa, use o sistema de "Supernova", descrito em detalhes no anterior publicações23,24. Consulte a lista de materiais por exemplo constrói.
  2. Amplifica o DNA construct(s) da etapa 2.1 em Escherichia coli usando técnicas microbiológicas padrão30.
  3. Purifica a construção de DNA com um kit de purificação de plasmídeo livre de endotoxinas seguindo as instruções do fabricante. Eluir a construção com água livre de endotoxinas.
    Nota: Escolher um kit de purificação de endotoxinas-livre sobre um kit de purificação padrão é crítico.
  4. Concentre-se o eluato de DNA para 1-3 mg/mL dependendo desejado rotulagem densidade26.
    Nota: Um título sempre precisa ser estabelecida quando estiver trabalhando com uma nova construção de DNA, dado que eles têm diferentes comprimentos e promotores. Considere-se injetando uma construção em várias concentrações diferentes e/ou valores para avaliar a expressão. Por exemplo, a injeção de 1 µ l ou 1,5 µ l de 2,0 mg/mL GFP. CRE é capaz de causar esparsa (1 µ l) ou denso (1,5 µ l) rotulagem da camada de neurônios piramidais corticais visual II/III26.
  5. Adicionar 0,4% trypan azul em 1 x salina tamponada fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 H2O, ajustado ao pH 7,4 com HCl) 01:10 para a solução concentrada de DNA.
  6. Adicione 10 x PBS 01:10 para a solução concentrada de DNA.
  7. Armazenar a solução concentrada de DNA a 4 ° C. A solução pode ser armazenada indefinidamente.

3. Pipetar set-up

  1. Usando um extrator de vidro capilar, puxe uma pipeta com um muito longo (10-15 mm) cônica e muito fina ponta, típica de pipetas para injeção de células-tronco embrionárias ou transferência nuclear31.
    Nota: Para impedir que detritos contaminando as pipetas, eles devem ser feitos no prazo de 2 dias da cirurgia.
    1. Calibre o puxador de vidro capilar, realizando um teste de rampa, seguindo as instruções do fabricante. Uso o valor resultante do calor para programar um puxando protocolo usando os seguintes parâmetros: calor = (valor do teste de rampa + 15), puxar = 30, vel = 120, tempo = 100, pressão = 200. Inserir o capilar de vidro, fixe com grampos no extrator e ativar o protocolo puxando programado, criando um cone sobre o capilar de vidro.
    2. Certifique-se de que o comprimento do atarraxamento é entre 10-15 mm, utilizando um microscópio óptico composto (por exemplo, 10 objetivo X)31.
  2. Quebre volta a pipeta para formar uma dica duro gumes para 20-25 µm de diâmetro.
    1. Centro de uma limpeza de single-ply tarefa (ver lista de materiais) sobre um 50ml copo e estiramento limpe tenso com uma mão. Com a outra mão, segure e pressione uma pipeta (lado do atarraxamento para baixo) perpendicularmente e totalmente através do centro do wipe, causando uma ruptura na atarraxamento31.
      Nota: Empurrando a pipeta totalmente através da limpeza produzirá uma ponta de diâmetro 20-25 µm cerca de 70% do tempo.
    2. Confirme sob um microscópio óptico composto (por exemplo, objetiva de 20x).
      Cuidado: Use proteção para os olhos ao quebrar o vidro.
  3. Calibrar uma pipeta por aspiração 1 µ l de 0,4% trypan azul em 1X PBS em um piptte parcialmente preenchido e, em seguida, graduando-se a pipeta com marcações de 1 µ l baseado na altura de 1 µ l em pipeta, usando um marcador de ponta fina resistente ao álcool. Use a pipeta calibrada para formar as outras pipetas antes de descartar. Manter pipetas em um suporte de pipeta, livre de poeira e outras partículas.

4. no Utero eletroporação

  1. Coloque Graefe pinça, tesoura de íris, Hartman pinça mosquito, esponjas de gaze não-tecidos, pinça com ponta de anel e placas de Petri em uma bandeja de aço inoxidável e embrulhar com papel alumínio. Coloque a bandeja e soro fisiológico a 0,9% 1L (0,9% wt/vol NaCl em água) em autoclave. Autoclave a 121 ° C e 3,5 kPa para 40 min. retirar do autoclave e coloque em uma área cirúrgica desinfectada.
    Nota: É fundamental para manter condições estéreis durante a cirurgia.
  2. Aquecer o frasco de salina esterilizada 1L num banho de água pequeno a 38 ° C pelo menos 2 h antes da cirurgia.
  3. Conecte os eletrodos tipo pinça e o pedal para o gerador (ver lista de materiais). Seguindo as instruções do fabricante, definir o gerador para entregar cinco pulsos de 50 ms de 50 V (com um intervalo de ms 950) quando acionado pelo pedal do pé. Desinfectar os eletrodos tipo pinça e coloque sobre a área cirúrgica desinfectada.
  4. Faça um cone de nariz anestesia como publicado anteriormente32, mas usar o fim de uma nitrila ou dedo de luva de látex para formar um diafragma que se encaixa firmemente sobre a abertura do cone de nariz. Corte um buraco no diafragma grande o suficiente para caber sobre o focinho do rato.
  5. Profundamente anesthetize ratos grávidas em E15.5 em uma câmara de indução cheia de isoflurano (2-4%) em oxigênio puro fluindo a 1 L/min. Depois de ~ 1 min, testar o reflexo de braço endireitante (delicadamente incline a câmara de indução e certifique-se de que o mouse não está certo em si). Peso do rato para determinar as dosagens de analgesia administrada mais tarde durante a cirurgia.
  6. Transferir o mouse para a área cirúrgica e administrar inalado isoflurano (1-2%) em oxigênio puro fluindo a 1 L/min, através de um cone de nariz para manter o rato no plano cirúrgico. Use a pinça para testar o reflexo de pedal (beliscar a pata com cuidado e certifique-se de que o mouse não retornar um reflexo) para verificar anesthetization. Monitorar a frequência respiratória e esforço, procurando, regular respiração profunda (~ 70-100 respirações por minuto), e que as mucosas são húmidas e coloração rosa.
  7. Aplique bastante pomada oftálmica veterinária sobre os olhos para cobri-los completamente para proteção contra a secagem durante o procedimento.
  8. Supersaturada de Flex o disco de metal ativador de uma bolsa selada preenchido com solução salina (ver lista de materiais), ativando uma cristalização exotérmica do sal. 2 leigos single-ply toalhetes de tarefa na parte superior da bolsa e coloque o mouse sobre a bolsa para manter a temperatura corporal.
  9. Massagem creme depilatório na zona abdominal com cotonetes de algodão até pele abdominal se dissolva (aproximadamente 20-40 s) e, em seguida, limpe a pele abdominal. Cuidadosamente limpe qualquer creme restante de resíduo e creme depilatório com cotonetes de algodão e etanol 70%. Coloque um pano cirúrgico estéril fenestrado sobre a área abdominal.
  10. Utilizando técnica asséptica, puxamos a pele para cima e longe do abdômen com pinça Graefe e fazer uma incisão ventral ~ 2 cm na pele com uma tesoura de íris, garantindo que o músculo subjacente não é cortado.
    Nota: Uma alternativa aceitável para fazer uma incisão com tesoura pinça e íris de Graefe é usar um bisturi, como publicado anteriormente17.
  11. Encontrar a linea alba a visualização da linha mediana do reto abdominal. Puxar o músculo e longe o abdômen com pinça Graefe e fazer outra incisão mediana ~ 2 cm lá com uma tesoura de íris, expondo a cavidade abdominal (útero é translúcido e embriões será visíveis por baixo). Certifique-se de que o subjacente de tecido uterino e intestinal não é cortado. Fazer a incisão apenas grande o suficiente (normalmente ~ 2 cm) para puxar e expor o útero confortavelmente.
    Nota: Uma alternativa aceitável para fazer uma incisão com tesoura pinça e íris de Graefe é usar um bisturi, como publicado anteriormente17.
  12. Usando uma ponta de micropipeta estéril 10 µ l, dispense o carprofeno (dissolvido em solução salina 0,9% estéril) 4 mg/kg na cavidade abdominal para analgesia.
  13. Fixe uma pinça mosquito de Hartman na borda esquerda da incisão abdominal reto. Descanse a pinça na placa de Petri virado para a esquerda da incisão, mantendo o lado esquerdo da incisão aberta. Fixe a outra pinça mosquito de Hartman na borda direita da incisão abdominal reto e descansar o fórceps em um prato de Petri virado para a direita da incisão, mantendo o lado direito da incisão aberta. Coloque a compressa de gaze em torno da área da incisão.
  14. Usando a pinça de anel (sem um parafuso limite anexado), puxe o útero entre quaisquer dois embriões vizinhos sem esmagar ou ferindo qualquer tecido. Comece retirando todos os embriões através da incisão, colocando-os em cima da gaze esponja. Quando arrancar os últimos embriões da cavidade abdominal, certifique-se de não puxar no colo do útero ou ovários. Uma vez expostos, é fundamental para manter o útero úmido com solução salina morna. O útero normalmente contém entre 5 e 8 embriões.
    Nota: É possível adicionar penicilina e estreptomicina, para a salina17.
  15. Conectar uma pipeta calibrada para o conjunto do tubo de aspiração (ver lista de materiais) e injete exatamente 1 µ l da solução de DNA preparada no passo 2 através da parede uterina em um ventrículo lateral de cada embrião. Ventrículos laterais aparecem como dois patches sobre o telencéfalo dorsal do embrião (patches são mais escuras do que o tecido do telencéfalo). Use o polegar e o indicador durante microinjeção e eletroporação para manipular os embriões, revelando os ventrículos laterais e permitindo que os embriões a ser empurrada suavemente contra a parede uterina durante a injeção. Confirme o sucesso injeção observando trypan azul de enchimento do ventrículo lateral.
  16. Colocar o cátodo de eletrodos tipo pinça (ver a lista de materiais) sobre o útero, diretamente sobre o córtex medial e caudal para atingir o córtex visual (direcionamento alternativas áreas do cérebro vai exigir a colocação de eletrodos diferentes)16, 26. Coloque o ânodo sobre o útero, só inferior e anterior da cabeça do embrião.
  17. Confirme que o ânodo e o cátodo estão tocando o útero em torno do embrião em locais apropriados. Com um pedal, acionar a entrega de cinco pulsos de 50 ms de 50 V (com um intervalo de 950 ms) entre os eletrodos.
    Nota: O injetado, carga negativa DNA se moverá em direção ao catodo e será incorporado em células da zona ventricular mais próximas para o cátodo.
  18. Retorne o útero para a cavidade abdominal na mesma orientação que foi encontrado. Utilize soro fisiológico para lubrificar o útero enquanto guiando-o manualmente e extremamente suavemente, tomando cuidado para não deslocar os embriões de sua posição no útero.
  19. Fechar os músculos abdominais com suturas absorvíveis (ver lista de materiais) usando um simples ponto interrompido, amarrando as extremidades com um nó de cirurgião. Fazer não clip que as extremidades muito perto do nó ou o nó se tornará soltar.
    Nota: É fundamental para a sutura dos músculos abdominais tal que as bordas da ferida são completamente fechadas Calem-se, mas sem causar branqueamento do músculo. Knots devem ser apertados, então eles não podem ser soltar.
  20. Feche a camada de pele com suturas absorvíveis (ponto de interrupção simples, cirurgião do nó, como na etapa 4.19). Aplique uma pequena quantidade de cola de tecido para fechar a ferida. Aplique o adesivo de tecido sobre os maçaricos para evitar desapertar. Use uma micropipeta para remover qualquer adesivo de tecido ao redor da ferida que pode ser aspirada pela micropipeta.
  21. Baixar os níveis de isoflurano para 0,5-1,5%. Uma vez que o tecido adesivo é seca (teste tocando luva ao adesivo), retire do isoflurano e permitir feminino para recuperar-se sozinho em uma gaiola quente. Administrar a buprenorfina intraperitonealmente em 0,03 mg/kg, utilizando uma seringa de 1 mL com um 26G, ½" agulha.
  22. Continuar a acompanhar o mouse até que o mouse está totalmente recuperado e se comportando normalmente (ou seja, aliciamento, explorando a gaiola, comer ou beber). Uma vez recuperado, lugar feminino de volta à jaula com macho.
    Nota: Se todos os passos são seguidos, o mouse normalmente recuperar a consciência dentro de 2 min e imediatamente começar a mover-se sobre a gaiola, não mostrando sinais de desconforto.
  23. Se o mouse exibe sinais de desconforto (por exemplo, curvado, postura, secreções de porfirina)33, administre carprofeno a 0,1 mg/mL em abastecimento de água. Se existirem vários sinais de desconforto, ou se o desconforto persistir por mais de 4 h, apesar da administração de carprofeno, eutanásia imediatamente o mouse ao administrar uma injeção letal intraperitoneal de cetamina (240 mg/kg) - xilazina (48 mg/kg)- cocktail de acepromazina (1,85 mg/kg), utilizando uma seringa de 1 mL com um 26 G, ½" agulha e segue com uma forma secundária aprovada de eutanásia33.
  24. Para aumentar a sobrevivência de embriões electroporated após o nascimento, manter a gaiola num ambiente calmo a sala, livre de ruídos e vibrações. Enriquece o ambiente com os iglus de plástico, materiais de assentamento e suplementos alimentares, tais como sementes de girassol (ver lista de materiais). Não mover ou perturbar a gaiola, especialmente durante os 3 primeiros dias após o parto.

5. histológica preparação para microscopia de fluorescência

Nota: Este protocolo de histologia é otimizado para a preparação de tecidos de animais mais velhos que dia pós-natal (P) 13 que foram electroporated no utero. Para preparar o tecido de animais mais jovens de pós-natal (P0-P13), recomenda-se seguir todas as etapas (incluindo a perfusão transcardial), embora o cérebro deve ser incorporado no agar antes de preparar seções (etapa 5,9). Tecido ainda pode ser preparado de embriões dentro de 1-2 dias após electroporation, usar métodos descritos anteriormente18,20.

  1. Prepare a solução de paraformaldeído (PFA).
    Nota: É imperativo para preparar PFA fresco, dentro de um dia do experimento.
    Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico e deve ser tratada em uma coifa com equipamento de protecção adequado.
    1. Tornar-se 50 mL de 4% PFA, calor 40 mL de água a 60 ° C. Adicione 2 g PFA, agitando com vidro haste ou mexendo na barra. Adicione 10 µ l de 10 M NaOH cada 2 min, até que se dissolva PFA.
    2. Adicionar 5 mL de 10 x PBS e trazer a solução para um volume final de 50 mL com água.
    3. Depois de trazer solução a 50 mL, ajustar o pH para 7,4 conforme necessário, com solução de HCl. Allow 10m para esfriar e guarde a 4 ° C.
  2. Eutanásia em rato com uma injeção intraperitoneal de cetamina (240 mg/kg) - xilazina (48 mg/kg) - cocktail de acepromazina (1,85 mg/kg) utilizando uma seringa de 1 mL com um 26G, ½" agulha. Transcardially perfuse 10 ou 20 mL gelada 1X PBS, seguido de 25 ou 40 mL-acabadas e gelada 4% PFA17. Utilizar volumes menores para jovens pós-natal (P0-P13) ratos e volumes mais elevados para os ratos mais velhos (P14 e acima).
  3. Imediatamente após a perfusão, decapitar a carcaça do mouse entre o osso occipital e a vértebra C1 com grandes tesouras e descascar e descartar a maioria da pele em torno de crânio com uma tesoura de íris, particularmente da pele circundante frontal, parietal e occipital ossos. Manter o crânio e cérebro intacto.
  4. Coloque o crânio e cérebro em 10 mL 4% PFA em um tubo cónico de 50 mL por 24 h a 4 ° C para fixar o tecido. Em seguida, adicionar 30 mL 1X PBS para tubo cônico para diluir a solução a 1% PFA para armazenamento a 4 ° C.
    Nota: Utilize um tubo cónico separado para cada crânio e cérebro pós-fixado. Não Incubar o cérebro em 1% PFA por mais de 2 semanas, ou fluorescência começará a desvanecer-se.
  5. Lugar do cérebro e crânio sobre uma superfície plana com single-ply toalhetes tarefa umedecidos com 1X PBS. Use um par de pinças (ver lista de materiais) para remover qualquer restante de pele ou membrana ao redor do crânio.
  6. Usando uma pinça, retire primeiro o osso occipital, em seguida, Retire cuidadosamente os ossos parietais, movendo-se a pinça para fora da superfície do cérebro. Retire cuidadosamente qualquer meninges para evitar danos ao córtex.
  7. Parte de trás da pinça da Cunha sob o cérebro ao longo do crânio para cortar qualquer nervos cranianos e remover o cérebro.
  8. Para o jovem pós-natal (P0-P13) cérebros
    1. Faça 25 mL de ágar de 4% por aquecimento 25 mL 1X PBS para 80 ° C. Mexa e dissolver o ágar de 1g com uma barra de vidro haste ou agitação).
    2. Solução legal a 35 ° C, continuando a mexer. Coloque o cérebro em um recipiente pequeno (por exemplo, a tampa de um tubo cónico de 50 mL) e despeje a solução de ágar sobre cérebro. Permitir que agar para endurecer.
  9. Fazer um corte coronal manualmente, usando uma lâmina de barbear borda única através do cérebro, aproximadamente 0,5 mm rostral bregma. Fazer outro corte coronal através do cérebro de cerca de 0,5 mm caudal ao córtex visual. Coloca uma piscina de cola de cianoacrilato com o mesmo diâmetro que a extremidade rostral do cérebro no centro do disco espécime micrótomo vibratória. Coloque a extremidade rostral do cérebro em cima da piscina de cola, garantindo que toda a superfície do tecido rostral é ligada para o disco de amostra com cola.
  10. Montar a bandeja de tampão em micrótomo de vibração e fixe com a alavanca de fixação interna. Insira a lâmina porta-navalha e monte o porta-navalha para micrótomo com parafuso de fixação interno de vibração. Fixe o disco de amostra com cérebro em bandeja de reserva usando o dispositivo de fixação interno. Definir a configuração de velocidade para 5,70 (= 0.285 mm/s) e ajuste da frequência de 5,33 (53,3 Hz).
  11. Encha a câmara acima do nível do cérebro com PBS 1x e abaixar a lâmina para a PBS. Começa a tirar 100 µm secções coronal através do tecido.
  12. Se não exigir processamento adicional, como 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração nuclear ou imuno-histoquímica.
    1. Use um pincel com ponta fino para transferir as seções diretamente do micrótomo vibração numa lâmina de microscópio, montagem de 4-6 seções para cada slide.
    2. Permitir que as seções secar wicking solução fora com um pincel com ponta fina, tal que as fatias do cérebro já não deriva nos slides.
    3. Em seguida, coloque uma gota de para montagem (ver lista de materiais) em cada seção do slide.
    4. Gentilmente colocar uma lamínula 24 x 50 mm na parte superior, garantindo que as bolhas de ar 1) não forma nas secções, 2) as seções não se mexa, e 3) a montagem totalmente abrange a área entre a lâmina e lamela. Permita a montagem curar pelo menos 24 a 48 h.
  13. A mancha de núcleos com DAPI para exame histológico de lâminas corticais
    1. Use um pincel com ponta fino para transferir cada seção em uma solução contendo 10 µ g/mL DAPI (ver lista de materiais) diluído em PBS 1x de solução (20 mg/mL DAPI na água).
    2. Incubar em solução DAPI durante 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, use um pincel com ponta fino para transferir a seção de solução DAPI para 1X PBS e incubar em 1X PBS durante 5 min à temperatura ambiente. Transferi a secção dois mais vezes para frescos 1X PBS por 5 min cada. Então, usando um pincel com ponta fino, transferência a seção numa lâmina de microscópio, siga os passos 5.11.2-5.11.4 e prossiga com a etapa 5.13.
  14. Aqueça um prato de Petri de vidro contendo Valap (partes iguais de vaselina, lanolina e parafina) em um prato quente em uma configuração de fogo baixo até derreter totalmente. Selo expõe arestas de slides escovação Valap derretido.
  15. Para inspecionar a fluorescência no tecido, use um microscópio óptico ou microscópio confocal (ver lista de materiais) e um filtro definido adequado para visualizar o fluoróforo (por exemplo, DAPI: excitação 325-375 nm, emissão 435-485 nm; GFP: excitação 450-490 nm, emissão 500-550 nm)17. Imagens confocal podem ser tomadas com baixo - (4 X, abertura numérica, at = 0.20), médio-(20 X, at = 0,75) e de alta potência (60 X, at = 1,40) objectivos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A única construção GFP. CRE (ver lista de materiais) foi electroporated no E15.5 e visualizado no P14. Dependendo da concentração da construção e do volume de injeção, um resultado esparso ou denso pode ser obtido22,26. Por exemplo, a injeção de 1 µ l de 2 mg/mL GFP. CRE resulta em uma distribuição esparsa de pilhas etiquetadas, alguns dos quais podem ser brilhante (figura 1A) e localizadas na camada ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Aqui, apresentamos a combinação de eletroporação no utero com Cre recombinase em camundongos floxed para gerar o tecido cerebral de mosaico. Uma vantagem dessa abordagem é que uma nova linha de rato não precisa ser gerado cada vez um diferente subtipo de celular está a ser alvo: eletroporação no utero pode ser usada para direcionar os neurônios excitatórios, neurônios inibitórios ou glia dependendo do tempo e localização do electroporation15,16<...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os autores graças ao apoio generoso da James Madison University departamento de biologia e da facilidade de Imaging e James Madison University microscopia de luz. Dr. Mark L. Gabriele para conselhos úteis sobre preparação de jovens pós-natal tecido, e DRS Justin W. Brown e Corey L. Cleland para coordenação generoso de espaço e materiais cirúrgicos. Esta pesquisa foi financiada em parte por uma concessão de pesquisa colaborativa por 4-VA, uma parceria de colaboração para fazer avançar a Commonwealth da Virgínia (G.S.V.) e por uma Virginia Academia de ciência pequeno projeto bolsa de investigação (G.S.V.). Suporte foi generosamente fornecido por uma doação de Betty Jo amoroso Butler 58 para bolsa de pesquisa de graduação (para K.M.B.), uma bolsa de pesquisa do verão de Farrell (para K.M.B.), um James Madison University segundo século Scholarship (para K.M.B.), um James Universidade de Madison do centenário uma bolsa (C.J.H.), uma Universidade de James Madison Lucy Robinson busca 30 bolsa de Memorial (para Z.L.H.) e um James Madison Universidade faculdade de Ciências e matemática da faculdade assistência Grant (para G.S.V.).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos C57BL / 6JO Laboratório Jackson# 000664Veja "1. Configuração do mouse" (etapa 1.1, "camundongos selvagens")
GFP. Cre vetor vazioAddGene#20781Veja "2. Configuração de DNA" (etapa 2.1 "construção de DNA único que codifica a Cre recombinase, bem como um marcador fluorescente"). GFP. Cre vetor vazio foi um presente de Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#69138Veja "2. Configuração de DNA" (etapa 2.1 Sistema "Supernova") e http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) foi um presente de Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova)AddGene#69136Veja "2. Configuração de DNA" (etapa 2.1 Sistema "Supernova") e http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) foi um presente de Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)AddGene#85006Veja "2. Configuração de DNA" (etapa 2.1 Sistema "Supernova") e http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) foi um presente de Takuji Iwasato.
Kit Maxi de Plasmídeo EndoFree (10)Qiagen#12362Veja "2. Configuração de DNA" (etapa 2.3 "kit de purificação de plasmídeo livre de endotoxinas")
Pó de azul de tripano, grau BioReagentSigmaT6146-5GConsulte "2. Configuração de ADN" (passo 2.5 "azul de tripano")
Cloreto de sódio, ACS, 2,5 kgVWRBDH9286-2,5 kgVer "2. Configuração de ADN" (passo 2.5 "NaCl")
Cloreto de potássio, ACS, 500 gVWR#97061-566Ver "2. Configuração de DNA" (etapa 2.5 "KCl")
Fosfato de sódio dibásico, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichS0876-100GVeja "2. Configuração de DNA" (etapa 2.5 "Na2HPO4")
Fosfato de potássio monobásico, ReagentPlus, 100 gSigma-AldrichP5379-100GConsulte "2. Configuração de DNA" (etapa 2.5 "KH2PO4")
Ácido clorídrico, reagente ACS, 500 mLFisher ScientificA144-500Ver "2. Configuração de DNA" (etapa 2.5 "HCl")
P-97 Extrator de micropipetaInstrumento SutterP-97Consulte "3. Configuração da pipeta" (passo 3.1 "extrator capilar de vidro")Filamento
de calha de 3,0 mm de larguraSutter InstrumentFT330BConsulte "3. Configuração da pipeta" (passo 3.1 "extrator de capilares de vidro")
Capilares de vidro de parede fina, 4", 1 / 0.75 OD/IDWorld Precision InstrumentsTW100-4Consulte "3. Configuração da pipeta" (passo 3.1.1 "capilar de vidro")
Toalhetes Soft-Tech de camada única, 4.5"PhenixLW-8148Consulte "3. Configuração da pipeta" (etapa 3.2.1 "limpeza de tarefa de camada única"); outros lenços umedecidos (por exemplo, Kimwipes) podem ser usados.
Pinça Graefe, 7 cm, Reta, 0.7 mm 1x2 DentesWorld Precision Instruments#14140Veja "4. Eletroporação no útero" (passo 4.1 "Pinça Graefe")
Tesoura de íris, 11,5 cm, reta, pacote de 12Precision Instruments#503708-12Veja "4. Eletroporação no útero" (passo 4.1 "tesoura de íris")
Pinça Mosquito Hartman, 9 cm, Reta, pacote com 12World Precision Instruments#503728-12Veja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.1 "Pinça de mosquito Hartman")
Esponjas não tecidas de uso geral, 2" x 2", 4 camadasMedrepexpress#2204-cVeja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.1 "esponjas de gaze não tecidas")
Pinça com ponta de anel, 10 cm, reta, 2,2 mm IDWorld Precision Instruments#503203Veja "4. Eletroporação in utero" (etapa 4.1 "pinça com ponta de anel")
Placas de Petri Pyrex completas, OD &vezes; H 100 mm &vezes; 20 mmSigma-AldrichCLS3160102-12EAVeja "4. Eletroporação no útero" (passo 4.1 "Placas de Petri")
Bandeja de instrumentos tipo plano, aço inoxidável, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"AmazonB007SHGAHAVeja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.1 "bandeja de aço inoxidável")
Pinça de platina, 5 mmBTX#45-0489Consulte "4. Eletroporação no útero" (passo 4.3 e 4.16 "eletrodos do tipo pinça")
ECM 830 PedalBTX#45-0211Consulte "4. Eletroporação in utero" (passo 4.3 e 4.17 "pedal")
ECM 830 GeradorBTX#45-0052Consulte "4. Eletroporação in utero" (etapa 4.3 "gerador")
Sistema de anestesia com isoflurano de animal único com caixa de indução pequenaAparelho de Harvard#72-6468Veja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.4 e 4.6 "cone nasal", passo 4.4 "câmara de indução")
Pomada oftálmicaHanna Pharmaceutical Supply Co#0536108691Ver "4. Eletroporação in utero" (passo 4.7 "pomada oftálmica veterinária")
Space Gel (AIMS)VWR#95059-640Ver "4. Eletroporação in utero" (passo 4.8 "bolsa selada cheia de solução salina supersaturada")
Gel Creme Removedor de Pêlos, Fórmula SensívelVeet#062200809951Veja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.9 "creme depilatório")
10ul Low Retention Tip Starter (960 pontas/pk)Phenix Research ProductsTSP-10LKITConsulte "4. Eletroporação in utero" (passo 4.12 "estéril 10 µ L ponta de micropipeta")
Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradasSigma-AldrichA5177Consulte "4. Eletroporação in utero" (passo 4.15 "montagem do tubo aspirador")
Sutura Absorvível Trançada, 4-0, Agulha NFS-2(FS-2), 27"MedrepexpressMV-J397Ver "4. Eletroporação in utero" (etapa 4.19 "suturas absorvíveis")
" LiquiVet Rápido" Adesivo de tecidoMedrepexpressVG3Veja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.20 "adesivo tecidual")
Seringas hipodérmicas, polipropileno, ponta Luer lock, capacidade 1,0 mLSigma-AldrichZ551546-100EAVer "4. Eletroporação no útero" (passo 4.21 "seringa de 1 mL")
BD Precisionglide agulhas de seringa calibre 26, L 1/2 pol.Sigma-AldrichZ192392-100EAVeja "4. Eletroporação in utero" (passo 4.21 "26G, ½ ” agulha")
Nestlets Material de nidificaçãoAncareNES3600Veja "4. Eletroporação in utero" (etapa 4.24 "materiais de nidificação")
Sementes de girassol, óleo preto,bio-servS5137Consulte "4. Eletroporação in utero" (passo 4.24 "sementes de girassol")
Paraformaldeído, 97%Alfa AesarA11313Ver "5. Histologia" (passo 5.1.1 "PFA")
Pinças Econômicas #3, 11 cm, pontas de 0,2 x 0,4 mmWorld Precision Instruments#501976Consulte "5. Histologia" (passo 5.5 "pinças")
Ágar póAlfa Aesar#10752Ver "5. Histologia" (passo 5.8.1 "ágar")
Lâminas de barbear de gume único, lâmina #9Ferramentas Stanley#11-515Consulte "5. Histologia" (passo 5.9 "lâmina de barbear de um gume")
Disco de amostra S D 50 mmLeica#14046327404Ver "5. Histologia" (passo 5.9 "disco de amostra de micrótomo vibratório")
Bandeja tampão S montagemLeica#1404630132Consulte "5. Histologia" (passo 5.10 "bandeja tampão")
VT1000 S VibratomeLeica#14047235612Consulte "5. Histologia" (passo 5.10 "micrótomo vibratório")
Lâminas de barbear de lâmina duplaPersonnaBP9020Veja "5. Histologia" (passo 5.10 "lâmina")
Porta-faca SLeica#14046230131Consulte "5. Histologia" (passo 5.10 "porta-faca")
Conjunto de pincéis redondos de cabo curto dourado Studio ElementsAmazonB0089KU6XEVeja "5. Histologia" (passo 5.12.1 "pincel de ponta fina")
microscopia eletrônicaSuperfrost Plus Slides#71869-11Veja "5. Histologia" (passo 5.12.1 "lâmina de microscópio")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 mlThermofisherP36970Veja "5. Histologia" (passo 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Vidro de cobertura, 24 x 50 mm, nº 1Produtos de pesquisa PhenixMS1415-10Consulte "5. Histologia" (etapa 5.12.4 "lamínula")
4′,6-Dicloridrato de diamidino-2-fenilindol (DAPI)Sigma-AldrichD9542Ver "5. Histologia" (passo 5.13.1 "DAPI")
Microscópio vertical de platina fixaOlympusBX51WIConsulte "5. Histologia" (passo 5.15 "microscópio de luz")
Microscópio Confocal de Varredura a LaserNikonTE2000/C2siConsulte "5. Histologia" (passo 5.15 "microscópio confocal")
4x objetiva, NA = 0.20NikonCFI Plan Apo Lambda 4XConsulte "5. Histologia" (passo 5.15 "objetiva de baixa potência")
Objetiva de 20x, NA = 0.75NikonCFI Plan Apo Lambda 20XConsulte "5. Histologia" (passo 5.15 "objetiva de média potência")
Objetiva de 60x, NA = 1.40NikonCFI Plan Apo VC 60X ÓleoConsulte "5. Histologia" (etapa 5.15 "objetiva de alta potência")
World estéril Serviços de

Referências

  1. Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
  2. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  3. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  4. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  5. McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
  6. McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641(2017).
  7. Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
  8. Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
  9. Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
  10. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  11. Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  12. De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
  13. Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
  14. Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
  15. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).
  16. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).
  17. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
  22. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163(2012).
  23. Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  24. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747(2016).
  25. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  26. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
  28. Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
  29. Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
  30. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd ed, Addgene. Cambridge, Massachusetts. (2017).
  31. Pipette Cookbook. , rev. ed, Sutter Instrument Company. Novato, California. (2015).
  32. Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232(2014).
  33. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois. (2013).
  34. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
  35. Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
  36. Kim, J. -Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  37. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047(2010).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

An lise de Mosaico Gen ticoEstudo do Fen tipo NeuronalInje o de Constructo de DNACalibra o com Azul de TripanoAn lise de Imagem ConfocalT cnica de Marca o EsparsaDirecionamento de Camada Cortical

Artigos relacionados