Um ensaio simples baseada em célula imunofluorescência para detectar anticorpos contra o Receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) no sangue

Anti-NMDA receptor auto-imune encefalite é uma entidade de doença recentemente reconhecidas que pode ocorrer em pacientes de todas as idades e afeta predominantemente feminino pacientes^1,2. É um da encefalite mais frequentemente diagnosticada entre os pacientes com etiologia desconhecida inicial de encefalite³. Pacientes afetados com encefalite do receptor NMDA anti geralmente têm sintomas prodrômicos de uma dor de cabeça ou febre, seguida pelo rápido desenvolvimento de mudança de nível de consciência e de uma variedade de sintomas neuropsiquiátricos agudas, incluindo agitação, irritabilidade , ansiedade, insônia, alucinações, delírios, agressividade, comportamentos bizarros, anormalidades do movimento, desregulação autonômica e apreensão ataca^4,5. Reconhecimento precoce desta condição e tratamento atempado com imunoterapia são importantes para um resultado melhor e até completa recuperação em doentes afectados⁶. Portanto, sugere-se que a encefalite auto-imune do anti-NMDA receptor deve ser considerada como um importante diagnóstico diferencial de pacientes que apresentam com características psicóticas agudas ou novo-início^7,8.

Além de características clínicas, a detecção de auto-anticorpos contra os receptores NMDA no sangue ou CSF é essencial para o diagnóstico preciso de anti-NMDA receptor encefalite auto-imune⁹. A maioria dos testes imunológicos para detectar os auto-anticorpos de receptor NMDA anti estão disponíveis em algumas pesquisa laboratórios^10,11, e há apenas um ensaio de imunofluorescência baseada em célula comercialmente disponível para rastreio do anti-NMDA receptor auto-anticorpos¹². O objetivo deste estudo é desenvolver um ensaio imunofluorescência de baseada em célula interna simples que pode ser convenientemente usado em laboratório para a tela a presença de auto-anticorpos de receptor NMDA anti para facilitar a pesquisa clínica do receptor NMDA anti encefalite auto-imune. O receptor NMDA é um heterotetramer íon canaleta complexo proteico especificamente expressado no cérebro. É feito de duas subunidades de NR1 obrigatórias e a combinação de uma ou duas subunidades de NR2A e NR2B, NR2C, NR2D¹³. Um estudo anterior relatou que o principal epítopo alvejado de anticorpos estava no domínio N-terminal extracelular do NR1 subunidade⁵. Daí, neste protocolo, podemos expressar a proteína NR1-subunidade recombinante humana do receptor NMDA com proteína verde fluorescente (GFP) na linha de células epiteliais de rim embrionário humano (HEK293) e desenvolver um ensaio imunofluorescência baseados em células para detectar a classe IgG de auto-anticorpos de receptor NMDA anti no sangue.

O estudo foi aprovado pelo institucional Review Board de Chang Gung Memorial Hospital em Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3).

1. preparação do plasmídeo de expressão a NR1-GFP

1. Mix 10 ng de plasmídeo NR1-GFP com 100 µ l de estirpe de células competentes de Escherichia coli DH5α em uma estéril 1,5 mL centrifugar o tubo, pipetar a mistura suavemente até e para baixo 4 - 6 vezes e incubar o tubo no gelo por 20 min.
2. Incubar o tubo a 42 ° C por 1 min em um banho de água, retire o tubo do banho, adicionar 1 mL de meio de caldo de carne (LB) lisogenia no tubo e incubar o tubo a 37 ° C numa incubadora com agitação por 1h.
3. A propagação de 50 µ l da mistura em uma placa de ágar LB contendo ampicilina (0,1 mg/mL) e incubar a placa de ágar LB a 37 ° C numa incubadora durante a noite.
4. Escolher uma única colônia da placa de ágar LB durante a noite usando uma ponteira estéril, e agite a ponta em um em um tubo de cultura bacteriana contendo 5 mL de meio LB e ampicilina (0,1 mg/mL). Incube o tubo a 37 ° C numa incubadora com agitação durante a noite.
5. Alíquota 3 mL de cultura bacteriana durante a noite para um balão de 500 mL que contém 250 mL de meio de LB estéril e ampicilina (0,1 mg/mL). Incube o frasco a 37 ° C, com agitação. Verifique regularmente se a densidade óptica (OD) da cultura bacteriana no comprimento de onda de 600 nm, utilizando um espectrômetro até o OD600 atinge 0,6-1,0.
   Nota: Misture bem 800 µ l de cultura bacteriana durante a noite com 200 glicerol µ l para preparar o estoque de glicerol e armazenar o estoque de glicerol sob a-80 ° C para uso futuro.
6. Preparar o plasmídeo de expressão NR1-GFP da cultura bacteriana 250ml
   1. Coletar as células por centrifugação a 6.000 x g, durante 15 min a 4 ° C.
   2. Ressuspender as bactérias em 10 mL de tampão de ressuspensão contendo RNase A; vórtice completamente até que nenhum grupo é visto.
   3. Adicionar 10 mL de tampão de lise da suspensão bacteriana, delicadamente inverter a mistura 4 - 6 vezes e incubar o lisado em temperatura ambiente (RT) por 5 min.
   4. Adicionar 10 mL de tampão de precipitação pre-refrigerados para o lisado, inverta suavemente a mistura 4 - 6 vezes.
   5. Despeje o lisado para o barril de um cartucho de filtro com a tampa Espere por 10 min a RT
   6. Retire a tampa do bocal de saída do cartucho, insira o cartucho de um atuador e pressione suavemente o êmbolo. Recolher o filtrado lisado em um tubo de 50 mL.
   7. Adicionar 2,5 mL proprietárias buffer do fabricante para o filtrado lisado, misture a mistura por inversão do tubo cerca de 10 vezes e incubar a mistura no gelo por 30 min.
   8. Aplique a mistura de lisado filtrada para uma coluna de filtro que foi previamente incubada com 10 mL de tampão de equilibração. Permita que a coluna de drenagem por gravidade.
   9. Lavar a coluna com 30 mL de tampão de lavagem duas vezes e, em seguida, Eluir o DNA da coluna usando 15 mL de tampão de eluição.
   10. Adicionar o isopropanol 10,5 mL (0,7 volumes) para o buffer de DNA eluted, misture bem e centrifugar a mistura a 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C.
   11. Decante o sobrenadante cuidadosamente, lavar o sedimento de DNA com 5 mL de etanol a 70% livre de endotoxina, uma vez e centrifugar a 20.000 x g durante 10 minutos.
   12. Decante o sobrenadante, secar a pelota por 5-10 min numa vizinhança de química e dissolva a pelota em 300-500 µ l de buffer livre de endotoxinas.
   13. Determine a concentração de plasmídeo medindo-se a absorção da solução no UV 260/280 nm, utilizando um espectrofotômetro.
       Nota: Prepare o plasmídeo de expressão usando o mesmo protocolo GFP.

2. transfecção de células HEK293 com plasmídeo de expressão NR1-GFP

1. Alíquota 200 µ l de solução de 2% de gelatina para cada um bem de uma placa de cultura de 48-bem e incubar a placa a 37 ° C durante pelo menos 30 min.
2. Aspire a solução de gelatina das células de 5 x 10⁴ HEK293 bem e sementes em 200 µ l de meio de cultura celular contendo 10% soro bovino fetal (FBS) em cada poço. Incube a placa a 37 ° C numa incubadora umidificado fornecido com 5% CO₂ durante a noite.
   Nota: As células foram contadas usando um hemocytometer.
3. No dia seguinte, substituir o gasto médio de cultura com 200 µ l de meio de cultura fresco contendo 10% FBS por bem.
4. Para cada único bem, preparar solução A misturando 100 ng do plasmídeo NR1-tGFP com 20 µ l meio de cultura e a solução B pelo reagente de transfeccao 0,8 µ l de mistura com meio de cultura 20 µ l. Multiplique o número de poços necessários para preparar o volume total para cada experimento.
5. Preparar a solução C, misturando a solução A e a solução B e incubar a mistura a RT para 20-30 min.
6. Alíquota 40 μL de solução C para cada bem que contém as células HEK293, agitar suavemente o frasco a placa e incubar a placa a 37 ° C numa incubadora umidificado fornecido com 5% CO₂ durante a noite.
7. Verifique a expressão da proteína recombinante de NR1-GFP nas células hospedeiras microscópio fluorescente com ampliação de X-200 X 40 (excitação/emissão: 482/502 nm) e proceder ao ensaio de imunofluorescência baseada em célula.
   Nota: Transfect o plasmídeo de expressão GFP nas células HEK293 usando o mesmo protocolo.

3. ensaio de imunofluorescência cell-based

1. Aspire o gasto médio dos poços, Então lave cada poço com 200 µ l de fosfato tamponado salino (PBS), três vezes.
2. Adicionar 200 µ l de solução de paraformaldeído 4% a cada poço; incube a placa na RT por 15 min.
3. Aspirar a solução de paraformaldeído dos poços e cada um Lave bem com 200 µ l de PBS três vezes.
4. Adicionar 200 µ l de 10% de leite desnatado em PBST (0.1% Tween-20 em PBS) solução para cada bem e incube a placa na RT para 1 h com agitação suave.
5. Aspirar o leite desnatado de 10% em solução PBST do poço e, em seguida, lavar os poços com 200 µ l de PBST uma vez.
6. Incube os poços com plasma diluído (1: 100 em PBST) como o anticorpo primário com agitação suave em RT por 1h.
   Nota: O Plasma é obtido de sangue de doentes com suspeita de ter encefalite auto-imune.
7. Aspire o plasma diluído dos poços e lavar cada bem com 200 µ l de PBST três vezes.
8. Adicionar 200 µ l de anti-humana de cabra IgG conjugada com Alexa Fluor 594 (1:1, 000 diluição em PBST) a cada poço e incubar a placa de cultura em RT com agitação suave por 1h.
9. Aspire o anti-humano de cabra IgG conjugada com Alexa Fluor 594 solução e cada um lavar bem com 200 µ l de PBST três vezes.
10. Adicione solução de glicerol 100 µ l (50% de glicerol em PBS e de 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1: 100.000) para cada poço.
11. Observar e as células sob um microscópio fluorescente usando um 10 X ocular e 4x, 10x e 20 X objetivos da imagem.
    Nota: Utilize o filtro correto para cada tintura: para NR1-GFP (excitação/emissão = 482/502 nm), para Alexa Fluor 594 (excitação/emissão = 561/594 nm), para DAPI (excitação/emissão = 358/461 nm). Realizar o controle negativo usando as células HEK expressando GFP, da mesma forma.

Em média, poderíamos obter 200-300 µ g plasmídeo de expressão livre de endotoxinas NR1-GFP e GFP de cultura bacteriana 250 mL, seguindo os procedimentos descritos na secção 1 do protocolo. Um montante de 100 ng/poço do plasmídeo a expressão foi usado para o transfection das células HEK293 cultivadas na placa de 48 conforme descrito na seção 2 do protocolo. 24-30 h após a transfeccao, as células expressaram a NR1-GFP, e proteínas recombinantes de GFP poderiam ser detectadas sob microscópio fluorescente. A figura 1A mostra a imagem de células hospedeiras que expressam a NR1-GFP, enquanto a Figura 1 mostra as células expressando GFP. O sinal verde pode ser usado como um controlador de qualidade do ensaio: aproximadamente 30% das células tinha os sinais verdes sob o microscópio fluorescente. Figura 1A e 1D mostram a imagem de células hospedeiras que expressam a NR1-GFP. O sinal verde pode ser usado como um controlador de qualidade do ensaio: aproximadamente 30% das células tinha os sinais verdes sob o microscópio fluorescente. As células expressando GFP-NR1 foram usadas para a seleção a presença de auto-anticorpos de receptor NMDA anti da amostra de plasma humano.

No ensaio de imunofluorescência baseada em célula conforme descrito na seção 3 do protocolo, o positivo controle amostra (obtido de uma fonte comercial, consulte Tabela de materiais) foi adicionado ao plasma pool em 01:10 diluição de acordo com o instruções do fabricante. O pool de plasma foi preparado a partir de 5 adultos machos e 5 fêmeas adultas. Figura 1B é a Alexa Fluor-594 imagem de amostra do controlo positivo após incubação com a expressão de células GFP-NR1, enquanto Figura 1E é a Alexa Fluor-594 imagem de amostra do controlo positivo após incubação com a expressão de células GFP. Figura 1 é a imagem mesclada de figura 1A e figura 1B: existem sobreposições significativas de sinais verdes e vermelhos sinais na mesma cela, indicando a localização co do NR1-GFP e os anticorpos contra o subunit NR1 de NMDA receptor (setas). Se sobrepõe a uma amostra de plasma que mostra maior que 30% de verde e vermelhos sinais serão interpretados como positivo neste caso. Figura 1F é a imagem mesclada da Figura 1 e Figura 1E que serve como o controle negativo para a Figura 1. A cor vermelha fraca é fluorescência de plano de fundo da imagem Alexa Fluor-594. Há pouca sobreposição dos sinais verdes e vermelhos, não indicando nenhuma ligação de auto-anticorpos de receptor a anti-NMDA contra a proteína recombinante.

Durante o estabelecimento dos procedimentos experimentais, observou-se uma baixa relação sinal-ruído da imagem Alexa Fluor-594 quando as amostras de plasma foram testadas. Procurou-se otimizar a relação sinal-ruído através da realização de uma diluição serial do plasma forma 01:10, 01:50, 1: 100, e 1: 200 e testando diferentes concentrações de Alex Fluor-594 etiquetados anticorpo secundário de 1: 500 a 1:2, 000. Encontramos essa diluição de 1: 100 de diluição plasma e 1:1,000 ou 1:2,000 o Alexa Fluor-594 foram as condições ideais para a interpretação dos dados.

Figura 1: imagens representativas do ensaio imunofluorescência baseados em células para detectar anticorpos do receptor NMDA anti. Imagem do (A) das células HEK293 que expressam NR1-GFP. (B) a Alexa Fluor-594 imagem retirada o mesmo campo de A após a incubação com a amostra de controle positivo. Sinal vermelho indica a ligação dos auto-anticorpos anti receptor NMDA-anti para o NR1 expressado nas células HEK293. (C) a imagem mesclada de A e B. Cor amarela indica a localização co do NR1 (sinal verde) e os auto-anticorpos de receptor NMDA-anti (sinal vermelho). As setas indicam exemplos de algumas células proeminentes, mostrando a localização co de NR1-GFP e anti-NMDA auto-anticorpos do receptor. (D) imagem do HEK293 células expressando GFP-NR1. (E) a Alexa Fluor-594 imagem retirada o mesmo campo de D após incubação com a amostra de controle positivo. Sinal vermelho fraco indica o ruído de fundo da imagem de Alexa Fluor-594. (F) a imagem mesclada de D e E. Esta imagem serve como um controle negativo, como há pouco amarelo sinal observado. A imagem de controlo negativo mostra a vinculação específica do anti-NMDA anticorpos do receptor para o NR1-GFP no ensaio. Todas as imagens foram tiradas de menos de 10 X olho lente e objectivo de lente X 20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.