Ectopically manifestámos NR1 subunidade do receptor NMDA marcado com proteína verde fluorescente em células embrionárias humanas (HEK293) como antígeno para detectar anticorpos contra o receptor NMDA no sangue de pacientes suspeitado com encefalite auto-imune. Este método simples pode ser adequado para fins em situações clínicas de triagem.
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Artigo de método
Um ensaio simples baseada em célula imunofluorescência para detectar anticorpos contra o Receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) no sangue
Neste artigo
Resumo
Resumo
A presença de auto-anticorpos de anti-NMDA receptor pode causar vários sintomas neuropsiquiátricos nos pacientes afetados, denominados encefalite auto-imune do anti-NMDA receptor. Detecção dos auto-anticorpos específicos contra o receptor NMDA no sangue ou no líquido cerebrospinal (CSF) é essencial para o diagnóstico preciso desta condição. O receptor NMDA é um íon canaleta complexo proteico que contém quatro subunidades, incluindo dois subunidade obrigatória de receptores NMDA 1 (NR1) e um ou dois receptores NMDA 2A subunidade (NR2A), 2B de subunidade do receptor NMDA (NR2B), subunidade do receptor NMDA 2C (NR2C), ou o receptor NMDA subunidade 2D (NR2D). O epítopo de auto-anticorpos de receptor NMDA-anti foi relatado para estar presentes no domínio N-terminal extracelular de NR1 subunidade do receptor NMDA. O objetivo deste estudo é desenvolver um ensaio de imunofluorescência baseada em célula simples que pode ser usado como um teste de triagem para detectar a presença de auto-anticorpos contra NR1 subunidade do receptor NMDA no sangue para facilitar a pesquisa clínica e básica de encefalite auto-imune do receptor NMDA-anti.
Introdução
Anti-NMDA receptor auto-imune encefalite é uma entidade de doença recentemente reconhecidas que pode ocorrer em pacientes de todas as idades e afeta predominantemente feminino pacientes1,2. É um da encefalite mais frequentemente diagnosticada entre os pacientes com etiologia desconhecida inicial de encefalite3. Pacientes afetados com encefalite do receptor NMDA anti geralmente têm sintomas prodrômicos de uma dor de cabeça ou febre, seguida pelo rápido desenvolvimento de mudança de nível de consciência e de uma variedade de sintomas neuropsiquiátricos agudas, incluindo agitação, irritabi....
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Protocolo
O estudo foi aprovado pelo institucional Review Board de Chang Gung Memorial Hospital em Linkuo, Taoyuan, Taiwan (102-2577A3).
1. preparação do plasmídeo de expressão a NR1-GFP
- Mix 10 ng de plasmídeo NR1-GFP com 100 µ l de estirpe de células competentes de Escherichia coli DH5α em uma estéril 1,5 mL centrifugar o tubo, pipetar a mistura suavemente até e para baixo 4 - 6 vezes e incubar o tubo no gelo por 20 min.
- Incubar o tubo a 42 ° C por 1 min em um banho de água, retire o tubo do banho, adicionar 1 mL de meio de caldo de carne (LB) lisogenia no tubo e incubar o tubo a 37 ° C numa incubadora com agitação por 1....
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Resultados
Em média, poderíamos obter 200-300 µ g plasmídeo de expressão livre de endotoxinas NR1-GFP e GFP de cultura bacteriana 250 mL, seguindo os procedimentos descritos na secção 1 do protocolo. Um montante de 100 ng/poço do plasmídeo a expressão foi usado para o transfection das células HEK293 cultivadas na placa de 48 conforme descrito na seção 2 do protocolo. 24-30 h após a transfeccao, as células expressaram a NR1-GFP, e proteínas recombinantes de GFP poderiam ser detectadas sob microscópio.......
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Discussão
Existem vários ensaios imunológicos cell-based para a tela a presença de auto-anticorpos contra o receptor NMDA relatados na literatura, incluindo imunofluorescência baseada em célula viva do ensaio11, fixada ensaio imunofluorescência baseada em célula9 , e baseados em citometria de fluxo do ensaio14. O ensaio de imunofluorescência baseada em célula ao vivo deve ser realizado logo após a preparação de células ectopically, expressando a proteína NR1, .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Fundação médica do Chang Gung (o número de concessão CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 e CMRPG3E0633).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| GRIN1 (GFP-tagged) - Receptor de glutamato humano, ionotrópico, N-metil D-aspartato 1 (GRIN1), variante de transcrição NR1-1 | Origene (Rockville, MD, EUA) | RG219368 | clone NR1-cDNA marcado com sequências tGFP C-terminal |
| pCMV6-AC-GFP | Origene (Rockville, MD, EUA) | PS100010 | vetor mamífero com etiqueta tGFP C-terminal |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen (Hilden Alemanha) | 12362 | |
| Reagente de Transfecção de Lipofectamina 2000 | Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Soro Reduzido Meio | Thermo Fisher | 31985-070 | |
| DMEM, Glicose Alta, Piruvato | Thermo Fisher | 11995-065 | |
| Soro Bovino Fetal Caracterizado, Origem dos EUA | GE Healthcare Life Sciences | SH30071.01 | |
| Anticorpo secundário anti-IgG humano (H+L) de cabra, conjugado Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher | A-11014 | |
| Controle positivo: receptor anti-glutamato (tipo NMDA) | Euroimmun AG, Lü beck, Alemanha | CA 112d-0101 | |
| Ensaio Euroimmun |
Referências
- Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis. Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).
- Lancaster, E. The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis. J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).
- Pruss, H., ....
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Reimpressões e permissões
