Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

Duas funções distintas coclear células sensoriais são essenciais para a audição dos mamíferos: transdução de mechanoelectric (MET) e electromotility^1,2. Por canais MET localizados no pacote o cabelo, IHCs (IHCs) e OHCs converter som vibração em alterações do potencial de membrana, bem como os sinais elétricos dos neurônios do gânglio espiral inervado. OHCs alterar seu comprimento de células com o potencial de membrana e amplificam a vibração do som de baixo nível. Essa atividade denominada electromotility é derivada pelo motor proteína prestin localizado na parede lateral do OHCs³.

Em muitas espécies, incluindo roedores, a função auditiva é imatura na época início pós-natal^4,5. Sem potencial de ação em resposta a sinais sonoros pode ser detectado no córtex auditivo antes do início de audiência^6,7. Desenvolvimento da morfologia e função da cóclea tem sido amplamente estudadas em rato, rato e rato^4,5,8. O mechanotransduction e electromotility de células ciliadas são também desenvolvidos no início da época de vida⁵.

A fim de avaliar a sensibilidade auditiva de ratos em diferentes idades pós-natal, nós desenvolvemos um método para auditivo de tronco encefálico (ABR) gravação em filhotes. Braçadeira do remendo de célula inteira é uma tecnologia ideal para investigar os OHCs electrophysiologically. No entanto, em comparação com a braçadeira do remendo realizada em neurônios e outras células epiteliais, a baixa taxa de selagem da célula inteira limitado a investigação de electromotility de OHCs isoladas.

Aqui descrevemos um procedimento para investigar os OHCs morfologicamente e electrophysiologically na cóclea agudamente dissociada de ratos pós-natal. Esse método pode ser modificado para estudar os mecanismos moleculares que regulam a função e desenvolvimento celular interna do cabelo.

Todos os protocolos experimentais envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética Animal da universidade médica do Sul.

1. prepare soluções para experimentos

1. Preparar o anestésico (ver Tabela de materiais): 1.5% pentobarbital de sódio dissolvido em ddH₂O.
2. Preparar a solução de dissecação (ver Tabela de materiais): dissolver um saco de pó de L-15 do Leiboviz em 1 L de DDQ₂O. ajuste de pH para 7,3 com 1 M de NaOH. Ajuste a osmolaridade para 300-330 mOsm usando um aparelhos e 10 mM HEPES antes do uso.
3. Dissolver 2 mg/mL colagenase IV (ver Tabela de materiais) em solução de dissecação, preparada na etapa 1.2.
4. Preparar as soluções de imunocoloração (ver Tabela de materiais): dissolver o paraformaldeído 4% em salina tamponada fosfato (PBS).
   Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; Use proteção adequada.
5. Dilua o agente de permeabilidade de 0,3% em PBS. Dilua o soro de cabra normal de 10% em PBS como o tampão de bloqueio. Dilua a 1: 200 prestin anticorpo em tampão de bloqueio. Dilua o anticorpo conjugado Alexa488 1:600 em tampão de bloqueio. Dilua a 1: 200 B faloidina-diversos isotiocianato em PBS.
6. Preparar a solução extracelular (ver Tabela de materiais): preparar o meio de L-15 a Leiboviz conforme descrito acima (etapa 1.2).
7. Preparar a solução intracelular (ver Tabela de materiais).

2. gravação ABR

Nota: Gravação ABR foi previamente descrita em detalhe no nosso anterior estudo⁹.

1. ANESTHETIZE ratos Sprague Dawley (SD) (filhotes de 1-14 dias de idade e adultos 2 - meses de idade, ambos os sexos) com uma única injeção de pentobarbital de sódio 1,5% (22 mg/kg para filhotes de cachorro e 30 mg/kg para adultos, intraperitoneal (i.p.)).
2. Coloque o animal anestesiado em um molde de espuma de polietileno para imobilizar o corpo do animal. Coloque o animal em uma mesa de antivibração em uma sala de som-atenuantes. Manter a temperatura do corpo do animal a 37,5 ° C, com uma almofada de aquecimento.
3. Limpe a área de cabeça com etanol a 70% (vol/vol). Usando uma tesoura bem, faça uma incisão de 1-2mm ventrolateral para o pavilhão auricular externo para colocar o eletrodo de referência ou o chão. Um eletrodo de agulha subdérmica (eletrodo de gravação) está localizado sobre o vértice do crânio (figura 1A).
4. Usando o gerador de função, gerar explosões de Tom calibrado (1 ms subida/descida, planalto 3 ms) de várias frequências (2, 4, 8, 16, 24 e 32 kHz) e intensidades (diminuídas de 85 para 10 dB SPL na etapa 5 dB). Variar a frequência e a amplitude manualmente ou usando um computador. Entrega a estímulos sonoros através de um alto-falante eletrostático localizado a 10 cm de distância em direção a cabeça do animal.
5. Filtro (100-1.000 Hz), amplificar e média (256 vezes) o som eliciado potencial usando um processador de multi-função para obter os ABRs. Os vestígios da ABR é monitorado on-line e armazenados para análise off-line. Demora cerca de 40 min para completar o ABR a gravação de um animal.
   Nota: Normalmente, de três a sete picos (onda eu a onda VII) com latências inferior a 15 ms pode ser identificado (figura 1B). O limiar da ABR é definido como o nível mínimo de som no qual wave I e II pode ser detectado.
6. Eutanásia antes os animais acordou da anestesia (com a injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio 1,5% 0,3 mL).

3. a dissecação do órgão de Corti (OC)

1. Filhotes de anestesiar. Para ratos menos de 6 dias de idade (< P6), manter o animal em um prato de cultura de 100 mm e cubra o prato com gelo por 10 min. Para ratos > P6, anestesiar o animal com uma única injeção de pentobarbital de sódio 1,5% (22 mg/kg, i.p.). Decapitar os filhotes de rato após a anestesia.
2. Esterilize a cabeça pulverizando com etanol a 70% (vol/vol).
3. Abrir o crânio ao longo da linha sagital mediana com tesoura; Remova o cérebro para expor o ouvido interno.
4. Transferência da orelha interna em uma placa de Petri 35mm preenchido com 3 mL de gelado L-15 (Figura 2A).
5. Sob o microscópio de dissecação, use pinça fina para remover a cápsula óssea da cóclea (Figura 2B).
6. Desembrulhe o OC e associados do stria vascularis (SV) do modiolus.
7. Mantendo a porção basal do SV com fórceps, separar o OC a SV completamente desenrolando lentamente da base-de-apex (Figura 2).
8. Corte o OC uniformemente em três pedaços, usando uma tesoura fina (Figura 2D).

4. mancha da imunofluorescência

1. Usando uma ponta de pipeta 200 µ l, transferir os segmentos de OC (passo 3.8) numa lâmina de vidro e fixar com 100 µ l de paraformaldeído 4% pelo menos 4 h a 4 ° C.
   Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; Use proteção adequada.
2. Lave o tecido deslocando o paraformaldeído com 100 µ l de PBS fresco. Lave o tecido três vezes por 10 min.
3. Incube o tecido com agente de permeabilidade de 0,3% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
4. Descartar o agente de permeabilidade em PBS e lave o tecido 3 vezes com PBS.
5. Bloco com 10% de soro de cabra normal em PBS por 1h à temperatura ambiente.
6. Incube com anticorpo anti-prestin-C-terminal (1: 200) no bloqueio solução para 2 h à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite.
7. Lave tres vezes com PBS por 5 min.
8. Incube com anticorpos secundarios conjugados a Alexa488 (1:600) em solução de bloqueio por 1h à temperatura ambiente no escuro.
9. Lave tres vezes com PBS por 5 min no escuro.
10. Incube com rodamina-faloidina (1: 200) por 10 min à temperatura ambiente no escuro.
11. Lave tres vezes com PBS por 5 min no escuro.
12. Montar sobre uma lâmina de vidro com meio de montagem (contendo DAPI). Imagem com microscopia confocal usando 405 nm, 488 nm e 594 nm de lasers. Definir a potência do laser em 0.1-0.5 mW e o scan velocidade no quadro/s 0.5.

5. braçadeira de Patch gravação de OHCs isolado

1. Usar o extrator de pipeta e microfalsificador para fazer patch pipetas com um diâmetro de ponta 2-3 µm. Back-preencher as pipetas com solução intracelular. Geralmente, a resistência inicial da pipeta remendo foi MΩ 2.5-3.5 em solução de banho.
2. Usando uma ponta de pipeta de 200 µ l, transferi uma parte do co (da etapa 3.8) em uma placa de Petri de 35mm. Digerir o tecido com 100 µ l de meio de digestão enzimática (colagenase IV, consulte Tabela de materiais) por 5 min à temperatura ambiente.
3. Deslocar o meio da digestão enzimática com 100 µ l de L-15. Corte o tecido em pequenos pedaços, usando um micro bisturi para isolar as células capilares.
4. Após suave pipetagem, transferir as células em uma câmara de plástico pequena caseira (diâmetro ~ 1,5 cm) preenchido com solução de banho livre de enzima (~ 1,5 mL, consulte Tabela de materiais).
5. Coloque a câmara no palco de um microscópio invertido. Encontre os OHCs solitárias saudável-aparecendo.
6. Carrega a pipeta de remendo para o palco principal de um amplificador de 700B. Mover a pipeta de remendo cuidadosamente por um micromanipulador e posicioná-lo em torno do fundo da célula exterior de cabelo (Figura 3A).
7. Braçadeira do remendo de células inteiras o OHC selando a parede lateral do corpo celular. Aplique sucção leve até a membrana celular é rompida. Conjunto da exploração potencial em -70 mV. Células com resistência de acesso variou entre 10 e 17 MΩ e resistência de membrana variaram de 100 a 500 MΩ e são consideradas uma configuração bem sucedida de células inteiras.
8. Usando o controle de computador, aplicar hiperpolarização e despolarizantes tensão (250 ms de duração e que variam de −140 a +94 mV em 13 passos de mV) para a célula para eliciar correntes de células inteiras.
9. Amplificar as correntes de células inteiras, filtrar (frequência de canto de 5 kHz) por um amplificador de 700B. Converta os dados por um conversor de 1440A e loja para análise off-line.
10. Medir a capacitância de membrana de OHCs usando um protocolo de estímulo dois da onda de seno-tensão controlado por um software de braçadeira do remendo. Definir a escala de tensão de estimular de-140 a 110 mV. Armazene os dados para análise off-line.

ABR pode ser provocada de anestesiados filhotes mais velhos que o 7º dia pós-natal (P7) usando rajadas de Tom puro (figura 1A). Como mostrado na figura 1B, as formas de onda ABR obtidas de filhotes mostrou apenas três ou quatro ondas distintas com pequena amplitude. Normalmente, até sete picos foram observadas as formas de onda ABR de animais adultos (figura 1B).

Para seguir imunocoloração e medição eletrofisiológica, rato ouvido recentemente foi dissecado do osso temporal. Vamos mostrar as etapas consecutivas da dissecção do tecido para isolar o OC de SV e o modiolus (Figura 2A–2C). O OC foi cortado em três pedaços uniformemente com microtesoura (Figura 2D). Para mostrar a morfologia das células de cabelo, os segmentos foram corados com a faloidina, anticorpo prestin e DAPI (Figura 2E). Os feixes do cabelo (em vermelho) indicam a superfície apical das células de cabelo, Considerando que o corpo da célula das OHCs foi marcado por prestin (em verde). O núcleo foi rotulado por DAPI (em azul) localizado na região inferior da IHCs e OHCs. Como mostrado na Figura 2E, nenhum prestin foi detectada as OHCs da cóclea na P5. Prestin foi observado pela primeira vez no P7 em OHCs localizado na cóclea basal.

Após a digestão suave, os OHCs foram isoladas a partir do co (Figura 3A). Gravações de tensão-braçadeira de células inteiras foram realizadas entre OHCs aguda isoladas da cóclea rato. Um exemplo representativo da célula inteira corrente gravado a partir de um OHC P9 isolado em resposta ao potencial de membrana mudada de −140 para +107 mV é mostrado na Figura 3B. Por favor, note a região N-forma da curva I-V, indicando a presença de KCa atual que é uma resposta única da OHCs. Impulsionado pela tensão de membrana, o Cl intracelular– combinado com o prestin, aparecendo como uma capacitância de membrana não-linear (NLC) muda sob a modalidade de braçadeira do remendo de células inteiras. A NLC típico de um OHC maduro é caracterizado por campaniformes dependência do potencial de membrana. A NLC pode ser equipado com uma função de Boltzmann do dois-estado e pode refletir a função de electromotility de OHCs. A função de Boltzmann para encaixe de capacitância é descrita como:

A equação e os parâmetros que foram descritos em nosso anterior papel9. Dois representante NLCs são mostrados na Figura 3.

Figura 1. Gravação de resposta auditiva do tronco encefálico. (A), o eletrodo de gravação foi inserido no couro cabeludo entre duas orelhas. Eletrodos de referência e terra foram colocados sob o pavilhão auricular esquerdo e direito, respectivamente. Um alto-falante campo aberto foi colocada a 10 cm de distância da ponta nasal do rato. (B) dois representante ABR formas de onda em resposta a picos de Tom 16 kHz, 80 dB SPL. Rastreamento superior gravado desde filhote P8. Rastreamento de fundo gravado a partir de um rato adulto. Os números indicam os diferentes picos de ondas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. A dissecação do órgão de Corti. (A) no ouvido interno dissecado de um filhote de rato P9. Da região vestibular e da cóclea são mostrados. (B) a estrutura da cóclea foi exposto após a remoção da parede óssea. (C), o órgão de Corti (OC) e do stria vascularis (SV) foram isoladas a partir do modiolus. (D) o órgão de Corti foi cortado uniformemente em três pedaços. Barras de escala em A-D representam 1.000 µm. (E) imagens Confocal mostrar as células capilares localizadas em diferentes segmentos (basais, médios e apicais) ao longo da cóclea. Rodamina-faloidina (vermelho) representa os pacotes de cabelo localizados na superfície apical das células de cabelo. DAPI (azul) representa os núcleos localizados na parte média-inferior de células ciliadas. O prestin (marcado em verde) só foi expressa na parede lateral das células de cabelo exteriores. Para os segmentos médios e basais no P7, somente o canal verde é mostrado para ilustrar a expressão de prestin em OHCs. Barra de escala representa 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Gravação de braçadeira de remendo de células inteiras de células isoladas de cabelo exteriores. (A) uma célula isolada de cabelo exterior foi selada no modo de células inteiras. Barra de escala representa 10 µm. (B) representante V curva gravado a partir de uma célula de cabelo exterior P9. Capacitância (C), a membrana não-linear (NLC) Obtida de duas células de cabelo exteriores em diferentes idades. As respostas de capacitância-tensão (círculos abertos) foram montadas para a função de Boltzmann (mostrada como as linhas espessas). A NLC foram normalizados para a capacitância linear correspondente (Clin). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.