Name: Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a realizar gravações de patch clamp em células ciliadas externas isoladas de ratos pós-natais. Este método permite investigar as mudanças morfológicas e funcionais durante o desenvolvimento auditivo.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do programa 973 (2014CB943002) e o Nacional Natural Science Foundation da China (11534013, 31500841).

Todos os protocolos experimentais envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética Animal da universidade médica do Sul.
1. prepare soluções para experimentos
<ol><li>Preparar o anestésico (ver Tabela de materiais): 1.5% pentobarbital de sódio dissolvido em ddH2O.</li>
	<li>Preparar a solução de dissecação (ver Tabela de materiais): dissolver um saco de pó de L-15 do Leiboviz em 1 L de DDQ2O. ajuste de pH para 7,3 com 1 M de NaOH. Ajuste a osmolaridade para 300-330 mOsm usando um aparelhos e 10 mM HEPES antes do uso.</li>
	<li>Dissolver 2 mg/mL colagenase IV (ver Tabela de materiais) em solução de dissecação, preparada na etapa 1.2.</li>
	<li>Preparar as soluções de imunocoloração (ver Tabela de materiais): dissolver o paraformaldeído 4% em salina tamponada fosfato (PBS). Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; Use proteção adequada.</li>
	<li>Dilua o agente de permeabilidade de 0,3% em PBS. Dilua o soro de cabra normal de 10% em PBS como o tampão de bloqueio. Dilua a 1: 200 prestin anticorpo em tampão de bloqueio. Dilua o anticorpo conjugado Alexa488 1:600 em tampão de bloqueio. Dilua a 1: 200 B faloidina-diversos isotiocianato em PBS.</li>
	<li>Preparar a solução extracelular (ver Tabela de materiais): preparar o meio de L-15 a Leiboviz conforme descrito acima (etapa 1.2).</li>
	<li>Preparar a solução intracelular (ver Tabela de materiais).</li>
</ol>2. gravação ABR
Nota: Gravação ABR foi previamente descrita em detalhe no nosso anterior estudo9.
<ol><li>ANESTHETIZE ratos Sprague Dawley (SD) (filhotes de 1-14 dias de idade e adultos 2 - meses de idade, ambos os sexos) com uma única injeção de pentobarbital de sódio 1,5% (22 mg/kg para filhotes de cachorro e 30 mg/kg para adultos, intraperitoneal (i.p.)).</li>
	<li>Coloque o animal anestesiado em um molde de espuma de polietileno para imobilizar o corpo do animal. Coloque o animal em uma mesa de antivibração em uma sala de som-atenuantes. Manter a temperatura do corpo do animal a 37,5 ° C, com uma almofada de aquecimento.</li>
	<li>Limpe a área de cabeça com etanol a 70% (vol/vol). Usando uma tesoura bem, faça uma incisão de 1-2mm ventrolateral para o pavilhão auricular externo para colocar o eletrodo de referência ou o chão. Um eletrodo de agulha subdérmica (eletrodo de gravação) está localizado sobre o vértice do crânio (figura 1A).</li>
	<li>Usando o gerador de função, gerar explosões de Tom calibrado (1 ms subida/descida, planalto 3 ms) de várias frequências (2, 4, 8, 16, 24 e 32 kHz) e intensidades (diminuídas de 85 para 10 dB SPL na etapa 5 dB). Variar a frequência e a amplitude manualmente ou usando um computador. Entrega a estímulos sonoros através de um alto-falante eletrostático localizado a 10 cm de distância em direção a cabeça do animal.</li>
	<li>Filtro (100-1.000 Hz), amplificar e média (256 vezes) o som eliciado potencial usando um processador de multi-função para obter os ABRs. Os vestígios da ABR é monitorado on-line e armazenados para análise off-line. Demora cerca de 40 min para completar o ABR a gravação de um animal. Nota: Normalmente, de três a sete picos (onda eu a onda VII) com latências inferior a 15 ms pode ser identificado (figura 1B). O limiar da ABR é definido como o nível mínimo de som no qual wave I e II pode ser detectado.</li>
	<li>Eutanásia antes os animais acordou da anestesia (com a injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio 1,5% 0,3 mL).</li>
</ol>3. a dissecação do órgão de Corti (OC)
<ol><li>Filhotes de anestesiar. Para ratos menos de 6 dias de idade (< P6), manter o animal em um prato de cultura de 100 mm e cubra o prato com gelo por 10 min. Para ratos > P6, anestesiar o animal com uma única injeção de pentobarbital de sódio 1,5% (22 mg/kg, i.p.). Decapitar os filhotes de rato após a anestesia.</li>
	<li>Esterilize a cabeça pulverizando com etanol a 70% (vol/vol).</li>
	<li>Abrir o crânio ao longo da linha sagital mediana com tesoura; Remova o cérebro para expor o ouvido interno.</li>
	<li>Transferência da orelha interna em uma placa de Petri 35mm preenchido com 3 mL de gelado L-15 (Figura 2A).</li>
	<li>Sob o microscópio de dissecação, use pinça fina para remover a cápsula óssea da cóclea (Figura 2B).</li>
	<li>Desembrulhe o OC e associados do stria vascularis (SV) do modiolus.</li>
	<li>Mantendo a porção basal do SV com fórceps, separar o OC a SV completamente desenrolando lentamente da base-de-apex (Figura 2).</li>
	<li>Corte o OC uniformemente em três pedaços, usando uma tesoura fina (Figura 2D).</li>
</ol>4. mancha da imunofluorescência
<ol><li>Usando uma ponta de pipeta 200 µ l, transferir os segmentos de OC (passo 3.8) numa lâmina de vidro e fixar com 100 µ l de paraformaldeído 4% pelo menos 4 h a 4 ° C. Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; Use proteção adequada.</li>
	<li>Lave o tecido deslocando o paraformaldeído com 100 µ l de PBS fresco. Lave o tecido três vezes por 10 min.</li>
	<li>Incube o tecido com agente de permeabilidade de 0,3% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Descartar o agente de permeabilidade em PBS e lave o tecido 3 vezes com PBS.</li>
	<li>Bloco com 10% de soro de cabra normal em PBS por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incube com anticorpo anti-prestin-C-terminal (1: 200) no bloqueio solução para 2 h à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Lave tres vezes com PBS por 5 min.</li>
	<li>Incube com anticorpos secundarios conjugados a Alexa488 (1:600) em solução de bloqueio por 1h à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Lave tres vezes com PBS por 5 min no escuro.</li>
	<li>Incube com rodamina-faloidina (1: 200) por 10 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Lave tres vezes com PBS por 5 min no escuro.</li>
	<li>Montar sobre uma lâmina de vidro com meio de montagem (contendo DAPI). Imagem com microscopia confocal usando 405 nm, 488 nm e 594 nm de lasers. Definir a potência do laser em 0.1-0.5 mW e o scan velocidade no quadro/s 0.5.</li>
</ol>5. braçadeira de Patch gravação de OHCs isolado
<ol><li>Usar o extrator de pipeta e microfalsificador para fazer patch pipetas com um diâmetro de ponta 2-3 µm. Back-preencher as pipetas com solução intracelular. Geralmente, a resistência inicial da pipeta remendo foi MΩ 2.5-3.5 em solução de banho.</li>
	<li>Usando uma ponta de pipeta de 200 µ l, transferi uma parte do co (da etapa 3.8) em uma placa de Petri de 35mm. Digerir o tecido com 100 µ l de meio de digestão enzimática (colagenase IV, consulte Tabela de materiais) por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Deslocar o meio da digestão enzimática com 100 µ l de L-15. Corte o tecido em pequenos pedaços, usando um micro bisturi para isolar as células capilares.</li>
	<li>Após suave pipetagem, transferir as células em uma câmara de plástico pequena caseira (diâmetro ~ 1,5 cm) preenchido com solução de banho livre de enzima (~ 1,5 mL, consulte Tabela de materiais).</li>
	<li>Coloque a câmara no palco de um microscópio invertido. Encontre os OHCs solitárias saudável-aparecendo.</li>
	<li>Carrega a pipeta de remendo para o palco principal de um amplificador de 700B. Mover a pipeta de remendo cuidadosamente por um micromanipulador e posicioná-lo em torno do fundo da célula exterior de cabelo (Figura 3A).</li>
	<li>Braçadeira do remendo de células inteiras o OHC selando a parede lateral do corpo celular. Aplique sucção leve até a membrana celular é rompida. Conjunto da exploração potencial em -70 mV. Células com resistência de acesso variou entre 10 e 17 MΩ e resistência de membrana variaram de 100 a 500 MΩ e são consideradas uma configuração bem sucedida de células inteiras.</li>
	<li>Usando o controle de computador, aplicar hiperpolarização e despolarizantes tensão (250 ms de duração e que variam de −140 a +94 mV em 13 passos de mV) para a célula para eliciar correntes de células inteiras.</li>
	<li>Amplificar as correntes de células inteiras, filtrar (frequência de canto de 5 kHz) por um amplificador de 700B. Converta os dados por um conversor de 1440A e loja para análise off-line.</li>
	<li>Medir a capacitância de membrana de OHCs usando um protocolo de estímulo dois da onda de seno-tensão controlado por um software de braçadeira do remendo. Definir a escala de tensão de estimular de-140 a 110 mV. Armazene os dados para análise off-line.</li>
</ol>

<ol><li>He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+in+to+the+amazing+outer+hair+cell%3A+membrane+wizardry+with+a+twist+and+shout%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout.</a> J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).</li>
<li>Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+amplification%2C+outer+hair+cells+and+prestin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cochlear amplification, outer hair cells and prestin.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405, 149-155 (2000).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+morphological+and+functional+maturation+of+mechanotransduction+in+rat+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells.</a> J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).</li>
<li>Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+specific+influences+of+early+acoustic+environments+on+primary+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex.</a> Nat Neurosci. 4, 1123(2001).</li>
<li>De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+period+window+for+spectral+tuning+defined+in+the+primary+auditory+cortex+%28A1%29+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat.</a> J Neurosci. 27, 180-189 (2007).</li>
<li>He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+appearance+and+development+of+electromotility+in+neonatal+gerbil+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells.</a> Hearing Res. 78, 77-90 (1994).</li>
<li>Hang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronized+Progression+of+Prestin+Expression+and+Auditory+Brainstem+Response+during+Postnatal+Development+in+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats.</a> Neural Plast. , 4545826(2016).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+absolute+auditory+thresholds+in+the+house+mouse+%28Mus+musculus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Audiol+Soc%22%5BJournal%5D)">Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus).</a> J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).</li>
<li>Møller, A. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%B8ller%2C+AR+%22Hearing%3Aanatomy%2C+physiology%2C+and+disorders+of+the+auditory+system%22">Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system</a>. , Academic Press. Dallas. (2006).</li>
<li>He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cochlear+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of cochlear inner hair cells.</a> Hearing Res. 145, 156-160 (2000).</li>
<li>Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Pendrin+Protein%2C+an+Anion+Transporter+and+Molecular+Motor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biological+Chem%22%5BJournal%5D)">Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor.</a> J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).</li>
<li>Fu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Urethane+on+Rat+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells.</a> Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Em ratos mais jovens do que de dia 11, sem potencial de ação em resposta à estimulação sonora pode ser observada no córtex auditivo6,7. Portanto, dia pós-natal 11 é descrito como "início de audiência"10. O desenvolvimento da função auditiva antes de início da audiência não foi bem estudado ainda. Usando o método semelhante para a gravação de ABR adulta, demonstramos que ABRs poderiam ser provocados pela explosão de Tom puro de filhotes mai...

Duas funções distintas coclear células sensoriais são essenciais para a audição dos mamíferos: transdução de mechanoelectric (MET) e electromotility1,2. Por canais MET localizados no pacote o cabelo, IHCs (IHCs) e OHCs converter som vibração em alterações do potencial de membrana, bem como os sinais elétricos dos neurônios do gânglio espiral inervado. OHCs alterar seu comprimento de células com o potencial de membrana e amplificam a vibração do som de baixo nível. Essa atividade denominada electromotility é derivada pelo motor proteína prestin localizado na parede lateral do OHCs3.
Em muitas espécies, incluindo roedores, a função auditiva é imatura na época início pós-natal4,5. Sem potencial de ação em resposta a sinais sonoros pode ser detectado no córtex auditivo antes do início de audiência6,7. Desenvolvimento da morfologia e função da cóclea tem sido amplamente estudadas em rato, rato e rato4,5,8. O mechanotransduction e electromotility de células ciliadas são também desenvolvidos no início da época de vida5.
A fim de avaliar a sensibilidade auditiva de ratos em diferentes idades pós-natal, nós desenvolvemos um método para auditivo de tronco encefálico (ABR) gravação em filhotes. Braçadeira do remendo de célula inteira é uma tecnologia ideal para investigar os OHCs electrophysiologically. No entanto, em comparação com a braçadeira do remendo realizada em neurônios e outras células epiteliais, a baixa taxa de selagem da célula inteira limitado a investigação de electromotility de OHCs isoladas.
Aqui descrevemos um procedimento para investigar os OHCs morfologicamente e electrophysiologically na cóclea agudamente dissociada de ratos pós-natal. Esse método pode ser modificado para estudar os mecanismos moleculares que regulam a função e desenvolvimento celular interna do cabelo.

<table><tbody><tr><td><forte>Anestésico</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td>1,5% em água</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Empresa</forte></td><td><forte>Número de catálogo</forte></td><td><forte>Comentários</forte></td></tr><tr><td><forte>Solução de dissecação</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 pacote em 1 L de água</td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td>2 mg/mL em L-15</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de Catálogo</td><td>Comentários</ soluções ></td></tr> <tr><td>< imunocoloração fortes > < / fortes ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PH 7.3</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>4% em PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>ZS-0694</td><td>0.3% em PBS</td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10000C</td><td>10% em PBS</td></tr><tr><td>anticorpo prestin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-22694</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugado anticorpo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td>dil 1:600</td></tr><tr><td>Faloidina-Tetrametilrodamina B isotiocianato</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>dil 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>C0060</td><td>dil 1:20</td></tr><tr><td>Nome</td><td> Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Solução extracelular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leiboviz's L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>41300-039</td><td>1 pacote em 1 L de água</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Solução intracelular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>7647-17-8</td><td>140 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>7791-18-6</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>67-42-5</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmômetro</td><td>Gonotec</td><td>OSMOMAT 3000 básico</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pinça WPI</td><td>14095</td><td>Pinças dumont</td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta</td><td>Sutter Instrument</td><td>MODLE-P97</td><td></td></tr><tr><td>Micro Forge</td><td>Narishigen</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mini Sistema Operacional</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp</td><td>Axon</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de aquisição de dados de baixo ruído</td><td>Axon</td><td>1440A</td><td></td></tr><tr><td>ES1 alto-falante</td><td>Sistema TDT da Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigGenRP</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software BioSigRP</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jClamp</td><td>Scientific Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Centro</td> de <td>Animais Experimentais de Ratos SD da Southern Medical University</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira patch clamp gravação em ratos pós-natal

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

A célula externa do cabelo é um dos dois tipos de células sensoriais ciliadas da cóclea mamíferos. Eles alteram seu comprimento de células com o receptor do potencial para amplificar a vibração fraca do sinal de som de baixo nível. A morfologia e a propriedade eletrofisiológica de células ciliadas exteriores (OHCs) desenvolvem na idade pós-natal. A maturação da célula exterior de cabelo pode contribuir para o desenvolvimento do sistema auditivo. No entanto, o processo de desenvolvimento de OHCs não é bem estudado. Isto é parcialmente devido à dificuldade de medir sua função por uma abordagem eletrofisiológica. Com o objetivo de desenvolver um método simples para resolver o problema acima, aqui descrevemos um protocolo passo a passo para estudar a função do OHCs na cóclea agudamente dissociada de ratos pós-natal. Com este método, podemos avaliar a resposta coclear aos estímulos de Tom puro e examinar o nível de expressão e a função da proteína motor prestin em OHCs. Esse método também pode ser usado para investigar as células ciliadas interiores (IHCs).

ABR pode ser provocada de anestesiados filhotes mais velhos que o 7º dia pós-natal (P7) usando rajadas de Tom puro (figura 1A). Como mostrado na figura 1B, as formas de onda ABR obtidas de filhotes mostrou apenas três ou quatro ondas distintas com pequena amplitude. Normalmente, até sete picos foram observadas as formas de onda ABR de animais adultos (figura 1B).
<p class="jove_content" fo:keep-t...

Este protocolo descreve métodos para gravar a resposta auditiva do tronco encefálico de filhotes pós-natal. Para examinar o desenvolvimento funcional de células exteriores do cabelo, o procedimento experimental da braçadeira do remendo de células inteiras gravação em células isoladas de cabelo exteriores é descrito passo a passo.

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

O objetivo geral deste ensaio eletrofisiológico é investigar as alterações morfológicas e funcionais das células ciliadas da cóclea durante o desenvolvimento pós-natal. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do departamento de assistente auditivo, como quando nossas células ciliadas ganham suas funções durante o início da audição? A principal vantagem desta técnica é que somos capazes de avaliar a função de células ciliadas individuais, isoladas dos filhotes de ratos pós-natais.Demonstrando o procedimento estarão Wenlu Pan, Shasha Guo e Nana Xu, que eram alunos de nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, coloque o animal anestesiado em um molde de espuma de polietileno para imobilizar o corpo do animal. Em seguida, coloque o animal em uma mesa antivibração em uma sala de atenuação de som.Mantenha a temperatura corporal do animal em 37,5 graus Celsius com uma almofada de aquecimento. Em seguida, limpe a área da cabeça com 70% de etanol. Faça uma incisão de um a dois milímetros ventral-lateralmente ao pavilhão auricular externo para colocar o eletrodo de referência ou eletrodo de aterramento.Em seguida, coloque um eletrodo de registro subdérmico sobr

auditory-brainstem-response-outer-hair-cell-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Whole-cell patch-clamp gravações de dendritos do nervo auditivo fibra no interior da fita sinapse das células ciliadas da cóclea de mamíferos.

Gravações pós-sinápticos em Dendrites aferente entrar em contato com células ciliadas da cóclea: Release multivesiculares Monitoramento em uma fita Synapse

Um método confiável para investigar células ciliadas externas (CCE) respostas móveis, incluindo eletromotilidade, motilidade lenta e flexão, é descrito. Motilidade das CCE é eliciada pela estimulação com um campo elétrico externo alternada, eo método tira proveito da alta velocidade de gravação de imagem, baseada em LED, iluminação e de última geração de software de análise de imagem.

Investigando Motilidade das células ciliadas externas com uma combinação de estimulação de campo externo elétrica alternada de alta velocidade e Análise de Imagem

O objectivo deste vídeo é demonstrar os procedimentos para a obtenção de células ciliadas saudáveis, intactas a partir dos órgãos do ouvido interno de peixes-zebra adultos e, em seguida, utilizando-os para os estudos de patch clamp para caracterização das propriedades biofísicas dos seus canais dependentes da voltagem.

Gravações patch clamp em células ciliadas da orelha interna Isolado de Zebrafish

Este vídeo demonstra um método para registrar as respostas auditivas do tronco encefálico (ABRs) de filhotes de ratos. Ele descreve as etapas para colocação de eletrodos, aplicação de estímulo sonoro e análise de processamento de sinal no tronco encefálico para avaliar as respostas neurais.

Registrando as respostas auditivas do tronco encefálico em um filhote de rato

Este vídeo demonstra o procedimento para implantar um dispositivo coclear em um camundongo surdo e aplicar estímulos elétricos para registrar as respostas auditivas do tronco encefálico. Esse procedimento permite entender os mecanismos básicos da audição elétrica e pode contribuir para avanços na tecnologia de implante coclear e na neurociência auditiva.

Registro de respostas auditivas do tronco encefálico evocadas eletricamente em um camundongo surdo

Este vídeo demonstra a técnica patch-clamp para medir correntes iônicas em corpos celulares de neurônios sensoriais do ouvido interno. Ele detalha a preparação e o uso de uma pipeta de grampo de remendo polida preenchida com uma solução interna contendo anfotericina B, que perfura a membrana para permitir o movimento de íons, preservando as condições intracelulares. Os pulsos de tensão são aplicados para acionar e registrar a atividade do canal iônico, fornecendo informações sobre suas...

Gravações perfuradas de patch-clamp de corpos celulares de neurônios sensoriais do ouvido interno

Este vídeo demonstra o exame da excitabilidade dos neurônios sensoriais nos gânglios da raiz dorsal usando a técnica de patch clamp para medir o potencial reobase e de membrana, analisando as respostas dos neurônios a injeções de corrente incremental.

Gravações de grampo de remendo de células inteiras em gânglios intactos da raiz dorsal de ratos

Este manuscrito descreve como preparar gânglios da raiz dorsal intactos para gravações de patch clamp. Esta preparação mantém o microambiente para neurônios e células gliais satélites, evitando assim as alterações fenotípicas e funcionais observadas usando neurônios DRG dissociados.

Remendo Recordings Grampo na Intact gânglios das raízes dorsais de ratos adultos

Apresentamos uma técnica para administração localizada de drogas através da rota trans-timpânicas na cóclea. Entrega da droga através desta rota não iria interferir com a eficácia de anticâncer dos medicamentos quimioterápicos tais como a cisplatina.

Entrega de trans-timpânicas drogas para o tratamento da ototoxicidade

A audiometria evocada da resposta do brainstem é uma ferramenta importante na neurofisiologia clínica. Atualmente, a audiometria de resposta evocada do tronco encefálico também é aplicada na ciência básica e nos estudos pré-clínicos envolvendo modelos animais farmacológicos e genéticos. Aqui nós fornecemos uma descrição detalhada de como as respostas auditivas do tronco encefálico podem com sucesso ser gravadas e analisadas nos ratos.

Aquisição e análise de dados na audiometria de resposta evocada de tronco encefálico em camundongos

São apresentados métodos que fornecem instruções detalhadas para dissecar, dissociar, cultivar e registrar patch-clamp dos neurônios do gânglio vestibular e do gânglio espiral da orelha interna.

Isolamento e Cultivo de Somatas Vestibulares e Gangliões Espirais de Roedores Neonatais para Gravações de Patch-Clamp

Aprenda a realizar gravações de patch clamp em células ciliadas externas isoladas de ratos pós-natais. Este método permite investigar as mudanças morfológicas e funcionais durante o desenvolvimento auditivo.

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

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