Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

Este protocolo descreve métodos para gravar a resposta auditiva do tronco encefálico de filhotes pós-natal. Para examinar o desenvolvimento funcional de células exteriores do cabelo, o procedimento experimental da braçadeira do remendo de células inteiras gravação em células isoladas de cabelo exteriores é descrito passo a passo.

O objetivo geral deste ensaio eletrofisiológico é investigar as alterações morfológicas e funcionais das células ciliadas da cóclea durante o desenvolvimento pós-natal. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do departamento de assistente auditivo, como quando nossas células ciliadas ganham suas funções durante o início da audição? A principal vantagem desta técnica é que somos capazes de avaliar a função de células ciliadas individuais, isoladas dos filhotes de ratos pós-natais.

Demonstrando o procedimento estarão Wenlu Pan, Shasha Guo e Nana Xu, que eram alunos de nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, coloque o animal anestesiado em um molde de espuma de polietileno para imobilizar o corpo do animal. Em seguida, coloque o animal em uma mesa antivibração em uma sala de atenuação de som.

Mantenha a temperatura corporal do animal em 37,5 graus Celsius com uma almofada de aquecimento. Em seguida, limpe a área da cabeça com 70% de etanol. Faça uma incisão de um a dois milímetros ventral-lateralmente ao pavilhão auricular externo para colocar o eletrodo de referência ou eletrodo de aterramento.

Em seguida, coloque um eletrodo de registro subdérmico sobre o vértice do crânio. Usando o gerador de funções, gere rajadas de tons calibradas de várias frequências e intensidades. Entregue os estímulos sonoros através de um alto-falante eletrostático localizado a 10 centímetros de distância da cabeça do animal.

Para obter as respostas auditivas do tronco encefálico, os potenciais sonoros são filtrados, amplificados e calculados usando um processador multifuncional. O registro do ABR de 40 minutos é monitorado online e armazenado para análise offline. Nesta seção, esterilize a cabeça do animal pulverizando com etanol 70%.

Em seguida, abra o crânio ao longo da linha média sagital com uma tesoura e remova o cérebro para expor o ouvido interno. Em seguida, transfira o ouvido interno para uma placa de Petri de 35 milímetros cheia de três mililitros de L-15 Medium de Leibovitz gelado. Sob o microscópio de dissecação, use uma pinça fina para remover a cápsula óssea da cóclea.

Depois disso, desembrulhe OC e SV associados de modíolo. Segurando a porção basal da VS com uma pinça, separe completamente o CO da VS, desenrolando-se lentamente da base ao ápice. Em seguida, corte o OC uniformemente em três pedaços usando uma tesoura fina.

Todas as etapas devem ser realizadas em L-15 gelado o mais rápido possível, a fim de minimizar a degradação e a deterioração do tecido. Nesta etapa, usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, transfira os segmentos de OC para uma lâmina de vidro. Fixe-os com 100 microlitros de paraformaldeído a 4% por pelo menos quatro horas a quatro graus Celsius.

Em seguida, lave o tecido deslocando o paraformaldeído com 100 microlitros de PBS fresco. Em seguida, lave o lenço três vezes por 10 minutos de cada vez. Em seguida, incube o tecido com agente de permeabilidade a 0,3% em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente.

Após 30 minutos, descarte o agente de permeabilidade e lave o tecido três vezes com PBS. Em seguida, bloqueie o tecido com soro de cabra 10% normal e PBS por uma hora em temperatura ambiente. Incubar o tecido com anticorpo anti-prestina C terminal e solução de bloqueio por duas horas à temperatura ambiente ou a quatro graus Celsius durante a noite.

Em seguida, lave o lenço três vezes com PBS por cinco minutos de cada vez. Depois, incube o tecido com anticorpo secundário conjugado com Alexa 488 em solução de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente no escuro. Lave o lenço três vezes com PBS por cinco minutos de cada vez no escuro.

Em seguida, incube o tecido com rodamina faloidina por 10 minutos em temperatura ambiente no escuro. Lave o lenço três vezes com PBS por cinco minutos no escuro. Em seguida, monte a amostra em uma lâmina de vidro com meio de montagem.

Imagem-o com microscopia confocal usando lasers de 405 nanômetros, 488 nanômetros e 594 nanômetros. Neste procedimento, use o extrator de pipeta e o microperfurador. Faça pipetas de remendo com um diâmetro de ponta de dois a três mícrons.

Em seguida, preencha as pipetas com solução intracelular. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, transfira um pedaço de OC para uma placa de Petri de 35 milímetros. Digerir o tecido com 100 microlitros de meio de digestão enzimática durante cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, desloque o meio de digestão enzimática com 100 microlitros de L-15. Corte o tecido em pedaços pequenos usando um microbisturi para isolar as células ciliadas. Após uma pipetagem suave, transfira as células para uma pequena câmara de plástico caseira cheia de solução de banho sem enzimas.

Em seguida, coloque a câmara no palco de um microscópio invertido e encontre os OHCs solitários de aparência saudável. Em seguida, carregue a pipeta de conexão no cabeçote stage de um amplificador 700B. Posicione a pipeta de adesivo ao redor da parte inferior da célula ciliada externa.

Em seguida, o remendo de células inteiras prende o OHC selando a parede lateral do corpo celular. Aplique uma leve sucção até que a membrana celular seja rompida. Em seguida, defina o potencial de retenção em 70 milivolts.

Células com resistência de acesso variando de 10 a 17 megaohms e resistência de membrana variando de 100 a 500 megaohms são consideradas uma configuração de célula inteira bem-sucedida. Aplique tensão hiperpolarizante e despolarizante à célula para obter correntes de células inteiras. Meça a capacitância da membrana dos OHCs usando um protocolo de estímulo de tensão de onda senoidal controlado pelo software patch clamp.

Defina a faixa de tensão de estimulação de 140 a 110 milivolts e armazene os dados para análise offline. Após uma digestão suave, as CCE foram isoladas do CO. Os registros de grampo de voltagem de células inteiras foram realizados a partir de CCEs agudamente isoladas da cóclea de ratos. Um exemplo representativo de toda a corrente celular registrada de um P9 OHC isolado em resposta ao potencial de membrana alterado de 140 para 107 milivolts é mostrado aqui.

Esta figura mostra a capacitância de membrana não linear obtida de duas CCE em idades diferentes. As respostas de tensão de capacitância foram ajustadas à função de Boltzmann. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas, se for executada adequadamente.

Após este procedimento, outras medidas como Western blotting e PCR podem ser realizadas para responder a perguntas adicionais, como avaliar o nível de expressão de alguma proteína, como a prestina em nossas células ciliadas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de células ciliadas explorarem propriedades eletrofisiológicas no sistema coclear e vestibular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como investigar as alterações morfológicas e funcionais das células ciliadas da cóclea durante o desenvolvimento pós-natal.