Summary
Bu iletişim kuralı İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi postnatal fare pups üzerinden kaydetmek için yöntemler açıklanır. Dış saç hücreleri fonksiyonel gelişimi incelemek için tüm hücreli yama kelepçe dış saç hücreleri izole kayıt deneysel işlemin adım adım açıklanmıştır.
Abstract
Dış saç hücre duyu saç hücreleri memeli koklea içinde iki tür biridir. Onlar kendi cep uzunluğu reseptör alt düzey ses sinyalinin zayıf titreşim yükseltmek için potansiyel ile değiştirin. Morfoloji ve dış saç hücrelerinin (OHCs) elektrofizyolojik özelliği erken postnatal yaşlarda geliştirmek. Dış saç hücre olgunlaşma işitme sisteminin gelişimine katkıda bulunabilir. Ancak, OHCs geliştirme sürecinin de incelenmiştir değil. Bunun nedeni kısmen zorluk işlevlerine elektrofizyolojik bir yaklaşım tarafından ölçmek için olmasıdır. Yukarıdaki sorunu gidermek için basit bir yöntem geliştirmek amacı ile burada biz OHCs işlevinde akut Disosiye koklea postnatal fareler üzerinden çalışmak için adım adım bir protokol tanımlamak. Bu yöntemle, saf ton uyaranlara koklear yanıtı değerlendirmek ve ifade düzey ve OHCs motor protein prestin işlevini inceleyin. Bu yöntem aynı zamanda iç saç hücreleri (IHCs) araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Koklear duyu saç hücreleri iki farklı işlevi memeli işitme için önemlidir: mechanoelectric iletim (MET) ve electromotility1,2. Saç demeti, IHCs (IHCs) ve OHCs dönüştürmek ses titreşim membran olası değişiklikleri içine yanı sıra içinde elektrik sinyallerini innervated sarmal ganglion nöronların bulunan MET kanalları tarafından. OHCs onların hücre membran potansiyeli ile değiştirmek ve düşük seviyeli Ses titreşimi yükseltmek. Electromotility olarak adlandırdığı bu faaliyet OHCs3lateral duvarında bulunan motor protein prestin tarafından türetilmiştir.
Kemirgenler de dahil olmak üzere birçok tür, işitme fonksiyonu erken postnatal dönem4,5' te olgunlaşmamış. Hiç aksiyon potansiyeli seda cevaben önce işitme başlangıçlı6,7işitsel korteks tespit edilemedi. Morfoloji gelişimi ve koklea fonksiyonu, yaygın olarak fare, fare ve sıçan4,5,8çalışılmıştır. Mechanotransduction ve electromotility saç hücrelerinin de erken gelişmiştir hayat dönemi5.
Fareler işitme duyarlılığını farklı postnatal yaş değerlendirmek için fare pups içinde kayıt İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi (ABR) için bir yöntem geliştirdi. Bütün hücre yama kelepçe OHCs electrophysiologically araştırmak için ideal bir teknolojidir. Ancak, sinir hücreleri ve diğer epitelyal hücreler yıllarındaki yama kelepçe ile karşılaştırıldığında, tüm hücreli sızdırmazlık oranı düşük izole OHCs electromotility incelenmesi sınırlı.
Burada OHCs morfolojik ve electrophysiologically Doğum sonrası fareler gelen akut Disosiye koklea içinde araştırmak için bir yordam açıklanmaktadır. Bu yöntem iç saç hücre gelişimi ve işlev düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan konular içeren tüm deneysel protokoller Güney Tıp Üniversitesi hayvan Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. deney için çözümleri hazırlayın
- Anestezi hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek): % 1.5 Fentobarbital sodyum çözünmüş GKD2' O.
- Diseksiyon çözüm hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek): bir GKD2O. ayarlama pH 7,3 için 1 L 1 M NaOH ile Leiboviz'ın L-15 toz torba geçiyoruz. OSMOLARİTE 300-330 mOsm için bir osmometer ve 10 mM HEPES kullanmadan önce kullanarak ayarlayın.
- 2 mg/mL collagenase IV dağıtılması ( Tablo malzemelerigörmek) 1.2 adımda hazırlanan diseksiyon solüsyona.
- (Bkz: Malzemeler tablo) immunostaining çözümleri hazırlamak: fosfat tamponlu tuz (PBS) % 4 paraformaldehyde geçiyoruz.
Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun koruma giymek. - PBS % 0,3 geçirgenliği Ajan sulandırmak. PBS % 10 normal keçi serum engelleme tampon olarak sulandırmak. Prestin antikor 1: 200 engelleme arabelleği sulandırmak. Alexa488 Birleşik antikor 1:600 engelleme arabelleği sulandırmak. Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate 1: 200, PBS sulandırmak.
- Hücre dışı çözüm hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek): Leiboviz'ın L-15 orta (yukarıdaki adım 1.2) açıklandığı şekilde hazırlayın.
- Hücre içi çözüm hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek).
2. ABR kayıt
Not: ABR kayıt daha önce ayrıntılı bizim önceki çalışma9olarak tarif edilmiştir.
- Sprague Dawley (SD) fareler (1-14 gün eski pups ve 2 - ay yaşlı yetişkinler, her iki cinsiyette) % 1.5 sodyum Fentobarbital (22 mg/kg için yavru ve yetişkin, mayi için 30 mg/kg (IP)) tek bir enjeksiyon ile anestezi.
- İmzalat hayvan hayvanın vücut hareketsiz için Polietilen köpük kalıp içine yerleştirin. Hayvan ses inceltiyorum oda bir anti-titreşim tablosunda yerleştirin. Hayvanın vücut sıcaklık 37,5 ° C bir ısıtma yastığı ile tutun.
- % 70 (vol/vol) etanol ile baş alanı silin. İyi makas kullanarak, bir 1-2 mm kesi ventrolateral referans elektrot veya yere yerleştirmek için dış pinna için yapın. (Elektrot kayıt) bir deri altı iğne elektrot (Şekil 1A) kafatası tepe üzerinde yer alır.
- İşlev üreteci kullanarak oluştur kalibre edilmiş sesi patlamaları (1 ms yükselme/düşme, 3 ms Yaylası) çeşitli frekansları (2, 4, 8, 16, 24 ve 32 kHz) ve yoğunluklarda (5 dB adımda 10 dB SPL için 85 azalmış). Frekans ve genlik el ile farklı farklı veya bir bilgisayar kullanarak. 10 cm uzakta hayvan Başkanı doğru yer alan bir elektrostatik hoparlöründen ses uyaranlara teslim.
- (100-1000 Hz) filtre ve bir çok fonksiyonlu işlemci ABR'lerden almak için (256 kere) ses elicited potansiyel kullanarak ortalama yükseltmek. ABR izlemeler çevrimiçi ve çevrimdışı analiz için saklı izlenir. Bir hayvan kayıt ABR tamamlamak için yaklaşık 40 dakika sürer.
Not: genellikle, üç ila yedi tepeler (dalga ben dalga VII) gecikme süreleri ile 15 ms olabilir daha az (Şekil 1B) tespit. ABR eşik hangi dalga ı ve II tespit edilebilir en düşük ses seviyesi tanımlanır. - Anestezi (ile 0.3 mL % 1.5 sodyum Fentobarbital mayi bir enjeksiyon) üzerinden uyanık hayvanlar önce ötenazi.
3. Organ of Corti (OC) diseksiyon
- Fare pups anestezi. İçin rats az 6 günlük (< P6), hayvan bir 100 mm Kültür çanak tutmak ve 10 min için buz ile çanak kapağı. Fareler için > P6, % 1.5 sodyum Fentobarbital (22 mg/kg, IP) tek bir enjeksiyon hayvanla anestezi. Fare pups anestezi sonra başını kesmek.
- Baş % 70 (vol/vol) etanol ile püskürtülerek sterilize.
- Kafatası sagittal orta çizgi boyunca makasla açın; beyin iç kulak ortaya çıkarmak için kaldırın.
- İç kulak içine buz gibi L-15 (Şekil 2A) 3 mL ile dolu 35-mm Petri kabına aktarın.
- Diseksiyon mikroskop altında iyi forseps koklea (Şekil 2B) kemikli kapsül kaldırmak için kullanın.
- OC paketini açmak ve çizikleri vascularis (SV) modiolus üzerinden ilişkili.
- Tutarak SV ile forseps, bazal bölümünü ayrı OC SV tamamen tarafından yavaş yavaş gevşemek Bankası-için-apex (Şekil 2C).
- OC eşit iyi makas (Şekil 2B) kullanarak üç parçalar halinde kesin.
4. ayirt boyama
- 200 µL pipet ucu kullanarak, OC (adım 3.8) kesimleri bir cam slayt üzerine transfer ve % 4 paraformaldehyde için en az 4 h 4 ° C'de 100 µL ile saptamak
Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun koruma giymek. - Doku paraformaldehyde ile taze PBS 100 µL yerinden tarafından yıkayın. Doku 10 min için üç kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 30 dk için PBS içinde % 0,3 geçirgenliği Ajan dokuyla kuluçkaya.
- PBS geçirgenliği Ajan atın ve doku üç kez PBS ile yıkayın.
- Oda sıcaklığında 1 h için PBS içinde % 10 normal keçi serum ile engelleyin.
- Oda sıcaklığında veya 4 ° C'de 2 h için çözüm gecede kapatmaktır anti-prestin-C-terminus antikor (1: 200) ile kuluçkaya.
- Üç kez PBS ile 5 dakika yıkayın.
- Alexa488-Birleşik ikincil antikorlar ile (1:600) içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 1 h için engelleme çözümde kuluçkaya.
- Üç kez karanlıkta 5 min için PBS ile yıkayın.
- Rodamine-phalloidin (1: 200) ile karanlık oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
- Üç kez karanlıkta 5 min için PBS ile yıkayın.
- Bir cam slayt üzerinde (DAPI içeren) montaj orta ile bağlayın. 405 kullanarak confocal mikroskobu ile görüntü nm, 488 nm ve 594 nm lazerler. Lazer güç 0.1-0,5 ayarla mW ve tarama hızı 0.5 kare/s.
5. yama kelepçe izole OHCs kayıt
- Yama yapmak için mikro-kalpazan uç çapı ile pipettes 2-3 µm. geri dolgu ile hücre içi çözüm Pipetler ve pipet çektirmenin kullanın. Genellikle, yama pipet ilk direnç 2.5-3.5 MΩ banyo çözüm oldu.
- 200 µL pipet ucu kullanarak, OC (Kimden adım 3.8) bir parça bir 35 mm Petri kabına aktarın. Enzimatik sindirim orta 100 µL dokuyla sindirmek (collagenase IV, bkz: Malzemeler tablo) Oda sıcaklığında 5 min için.
- L-15 100 µL ile enzimatik sindirim orta yerinden. Doku saç hücreleri izole etmek için mikro neşter kullanarak küçük parçalar halinde kesin.
- Nazik pipetting sonra hücreleri bir ev yapımı küçük plastik odasına aktar (çapı ~ 1,5 cm) enzimi içermeyen banyo çözüm ile dolu (~ 1,5 mL, Tablo malzemelerigörmek).
- Odası ters bir mikroskop sahnesinde yerini. Sağlıklı görünen yalnız OHCs bulmak.
- Yama pipet 700B amplifikatör baş sahne içine yükleyin. Yama pipet dikkatli bir micromanipulator tarafından hareket ve dış saç hücresi (Şekil 3A) alt konumlandırın.
- Bütün hücre yama kelepçe hücre vücut lateral duvarına mühürleyerek OHC. Hücre zarı yırtıldı kadar ışık emici uygulamak. Holding-70 potansiyel ayarla mV. Hücreleri için 17 MΩ 10 değişiyordu erişim direnç ve membran direnç için 500 MΩ 100 değişiyordu ve başarılı bir bütün-hücre yapılandırma olarak kabul edilir.
- Bilgisayar kontrolü, kullanarak uygulama hyperpolarizing ve gerilim depolarize (250 ms süresi ve −140 + 94 için değişen 13 mV adımda mV) bütün hücreli akımları temin için hücreye.
- Bütün hücre akımları yükseltmek, 700B amplifikatör tarafından (5 kHz Frekans köşe) filtre. 1440A converter ve çevrimdışı analiz için mağaza tarafından verileri dönüştürmek.
- Bir yama kelepçe yazılım tarafından kontrollü bir iki sinüs dalga gerilim uyarıcı iletişim kuralı kullanılarak OHCs membran kapasitans ölçmek. Stimulate voltajı 110 -140 ayarla mV. Çevrimdışı analizleri için veri depolar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ABR saf ton patlamaları (Şekil 1A) kullanarak imzalat fare pups postnatal gün 7 büyük (P7) elde edildi. Şekil 1B, sadece üç-dört ayrı dalgalar küçük genlik ile gösterdi fare pups elde edilen ABR dalga biçimleri gösterildiği gibi. Genellikle, en fazla yedi tepeler Yetişkin hayvanlar (Şekil 1B) ABR dalga biçimleri gözlendi.
Aşağıdaki immunostaining ve elektrofizyolojik ölçüm için fare iç kulak taze şakak kemiğinden disseke. Biz OC SV ve modiolus (Şekil 2A-2 C) izole etmek için doku diseksiyon ardışık adımlar gösterir. OC eşit olarak mikro-makas (Şekil 2B) ile üç parçalar halinde kesilmiş. Saç hücreleri morfolojisi göstermek için segmentleri phalloidin, prestin antikor ve DAPI (Şekil 2E) ile lekeli. OHCs hücre gövdesi prestin (içinde yeşil) tarafından işaretlenmiş, ancak Saç demetleri (kırmızılı) saç hücrelerinin apikal yüzey gösterir. Çekirdeği IHCs ve OHCs alt bölgesinde bulunan DAPI (mavili) tarafından etiketli oldu. Şekil 2Eiçinde gösterildiği gibi hiçbir prestin koklea P5, OHCs algılandı. Prestin ilk P7 bazal koklea içinde yer alan OHCs içinde gözlenen.
Nazik sindirim sonra OHCs OC (Şekil 3A) izole edildi. Bütün hücre voltaj-kelepçe kayıtları akut izole sıçan koklea OHCs üzerinden yapıldı. Bütün hücre geçerli bir temsilcisi örnek kaydedilen üzerinden −140 +107 için değişti yanıt membran potansiyel olarak izole bir P9 OHC mV Şekil 3B' gösterilir. N-şekil bölge OHCs benzersiz bir yanıt olan KCa geçerli varlığını gösteren ı-V eğrinin unutmayın. Membran gerilim tarafından tahrik, hücre içi Cl- bir doğrusal olmayan membran kapasite (NLC) bütün hücreli yama kelepçe modu altında değişiklikleri gibi görünen prestin ile birlikte. Olgun bir OHC tipik NLC çan şeklindeki bağımlılığını membran potansiyeli ile karakterizedir. NLC iki durumlu Boltzmann fonksiyon ile monte edilebilir ve OHCs electromotility fonksiyonu yansıtabilir. Boltzmann işlevi için kapasite uygun olarak tanımlanmaktadır:
Denklemi ve parametreleri bizim önceki kağıt9' tarif edildi. İki temsilcisi NLCs Şekil 3 ciçinde gösterilir.
Şekil 1. İşitsel Beyin sapı yanıt kayıt. (A) kayıt elektrot iki kulak arasındaki kafa derisi içine eklenmiş. Zemin ve referans elektrotlar sırasıyla sol ve sağ pinna altında yerleştirildi. Bir açık alan hoparlör 10 cm uzakta fare burun ucu yerleştirildi. (B) iki temsilcisi ABR dalga biçimleri yanıt olarak 16 kHz, 80 dB SPL sesi patlamaları. Üst izleme P8 yavru kaydedildi. Alt izleme yetişkin bir sıçan gelen kaydetti. Sayıları dalga biçimleri farklı doruklarına gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Organ of Corti diseksiyon. (A)iç kulak disseke bir P9 sıçan yavrusu. Koklea ve vestibüler bölge gösterilir. (B) koklea yapısı kemikli duvar çıkarıldıktan sonra ortaya çıkmıştır. (C) Corti (OC) ve çizikleri organı vascularis (SV) modiolus izole edildi. (D) organ ve Corti eşit olarak üç parçalar halinde kesilmiş. A-D ölçek barlarda koklea boyunca farklı kesimleri (bazal, orta ve apikal) saç hücreleri bulunan 1000 µm. (E) Confocal görüntüleri gösterisi temsil eder. Rodamine-phalloidin (kırmızı) saç hücrelerinin apikal yüzeyinde bulunan saç demetleri temsil eder. DAPI (mavi) saç hücreleri orta-alt kısmında bulunan çekirdeklerin temsil eder. (Yeşil etiketli) prestin sadece dış saç hücrelerinin lateral duvarda ifade edildi. P7, orta ve bazal segmentler için sadece yeşil kanal prestin OHCs içinde ifade göstermek için gösterilir. Ölçek çubuğu temsil eder 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Bütün hücre yama kelepçe kayıt izole dış saç hücrelerinin. (A) izole bir dış saç hücresi bütün hücre modunda kapalı. Ölçek çubuğu P9 dış saç hücreden kaydedilen 10 µm. (B) A temsilcisi ben-V eğrisi temsil eder. (C) doğrusal olmayan membran kapasite (NLC) farklı yaş iki dış saç hücrelerinden elde. Kapasitans voltajlı yanıt (açık dairelerden) (koyu çizgiler olarak gösterilir) Boltzmann işlevine monte edildi. NLC karşılık gelen doğrusal kapasite (Clin) için normalleştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rat 11 gün genç, yanıt olarak ses stimülasyon yok Aksiyon potansiyeli işitsel korteks6,7' gözlenen. Bu nedenle, postnatal gün 11 "işitme başlangıçlı"10tanımlanır. İşitme başlangıçlı henüz de incelenmiştir değil önce işitme fonksiyonu geliştirilmesi. Benzer yöntem yetişkin ABR kaydı için kullanarak, biz saf ton veri bloğu fare pups P11 genç dan tarafından ABR'ler elde edildi göstermek (Şekil 1). Ancak, fare pups elde edilen ABR dalga biçimleri farklı bazı özellikler o yetişkin hayvanların gösterdi. ABR yanıt genlik ile nispeten yüksek eşikli küçüktür. Bu sonucu gelişen işitme sisteminin ses sinyalleri için düşük duyarlılık vardır anlamına gelir. Önemli fark fare pups kaydedilen ABR dalga biçimleri gözlendi. Genellikle, en fazla yedi tepeler yetişkin ABR dalga biçimleri9' tespit edildi. Bu tepeler farklı gecikme süresi11işitsel yol boyunca farklı beyin çekirdekleri tarafından oluşturulur. Bizim sonuçları, sadece ı-IV dalgalar fare pups (Şekil 1B) ABR içinde algılanabilir olduğunu gösterir. I ve II koklea ve siniri11yanıt temsil dalgaları. Bu nedenle, sonuçlar daha yüksek düzey işitsel çekirdek geliştirme sırasında akustik uyaranlara yanıt veremedi gösterir. Bu veri merkezi işitme sisteminin daha önceki o koklea ulaşmak fonksiyonel olgunluk öneririz. Biz burada tarif yöntemi koklea geliştirme ve saç hücre işlevi düzenleyen moleküler mekanizmaları çalışma için önemlidir.
OC yüksek kaliteli diseksiyon daha da immunostaining, Western blot ve elektrofizyolojik ölçüm gibi deneyler için önemlidir. Bu deneyler yetişkin SD fare ve sıçan yavrusu 1 ile 14 gün eski arasında kullanılarak gerçekleştirilir. Fare pups koklear kemik yumuşak değil ve mafyayla zarar vermeden forseps tarafından kolayca kaldırılması gibi ince diseksiyon için idealdir Yetişkin fareler için özel dikkat kemikli sert kapsül kaldırılırken OC parçalanma önlemek için gereklidir. İyi forseps kullanarak, OC ve ilişkili SV modiolus kaldırılabilir. Ayrı OC ve SV farklı doku (Şekil 2C) var. Fare pups için OC 800-1200 µm uzunluğu ile üç bölümler halinde kesebiliriz. Lütfen dikkat, tüm merdiven-meli var olmak kılınmak içinde buz gibi L-15 bozulması ve doku bozulması en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk.
OC izole segmentlerinin immunostaining, Western blot ve RNA analizi için iyi hazırlıklar vardır. İşte immunostaining tarafından OC duyusal saç hücreleri morfolojisi göstermektedir. OHCs onları çekirdeğe sahiptir, ancak onların apikal yüzeyinde Saç demetleri var basally bulunan12. Motor protein prestin OHCs yanal membran üzerinde ifade edilir. Confocal görüntüleme veri prestin ilk P6-P7 ifade ve sonraki hafta (2E rakam) sürekli bir artış gösterdi belirtti. Daha fazla deney, Batı kurutma ve q-PCR (veri gösterilmez) geliştirme sırasında prestin gözlenen ifade düzeyi değişiklikleri ölçmek için yapıldı. Saç hücreleri OC azınlıkta olduğu için 6-10 cochleae güçlü sinyaller elde etmek için tek bir deneyde tavsiye edilir.
Yama kelepçe kayıtları OHCs için hafif enzimatik sindirim OHCs ayırmak için gerçekleştirildi. Saç hücreleri kırılgan ve özel dikkat bu adımda istenebilir. 200 µL pipet ucu ayrı hücre ve doku aktarmak için kullanın. OC izole segment collagenase çözüm bir damla için transfer oldu (~ 100 µL) bir petri oda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika içinde. OHCs hücre zarı zarar verir uzun sindirim kez kaçının. Mikroskop altında sağlıklı görünümlü OHCs yama kelepçe kayıt için seçildi. Şişme, büzülme, herhangi bir belirti gösteriyor hücrelerine de zarar veya translocation çekirdeği sonraki deneme hariç. Sağlıklı yalnız görünen OHCs ve IHCs tarafından morfolojik onların fark tespit etmek kolaydır. IHCs şişesi şeklindeki sıkı boyun12ile ise OHCs silindir şeklinde ve daha büyük bir eksenli çap oranı gösterir. OHCs bütün hücreli yama kelepçe alanındaki bu nöronlar ve diğer epitelyal hücreler biraz zordur. Başarılı bütün hücreli yapılandırma için yama pipet genellikle yüksek yoğunluklu (Şekil 3A) prestin parçacıkların içeren üst lateral membran uzak tutulması çekirdeği, yakınında. Zarı yırtıldı sonra bir iki sinüs dalga gerilim uyarıcı protokol OHCs membran kapasite elde etmek için hücreye uygulanan. Aynı tekniği ile gerilim adımları kullanarak bu bütün hücre geçerli temin mümkündür.
Bu yöntem OHCs vitro9,13electromotility işlevi araştırmak için iyi bir araçtır. Bu yöntem, iyon kanalları işlevinin yanı sıra, OHCs ve IHCs-14reseptörlerinin farmakolojik özellikleri araştırmak için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser hibe 973 programı (2014CB943002) ve Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (11534013, 31500841) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
References
- He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
- Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin Neurobiol. 18, 370-376 (2008).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405, 149-155 (2000).
- Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
- Waguespack, J., Salles, F. T., Kachar, B., Ricci, A. J. Stepwise morphological and functional maturation of mechanotransduction in rat outer hair cells. J Neurosci. 27, 13890-13902 (2007).
- Zhang, L. I., Bao, S., Merzenich, M. M. Persistent and specific influences of early acoustic environments on primary auditory cortex. Nat Neurosci. 4, 1123 (2001).
- De, V. -S. E., Chang, E. F., Bao, S., Merzenich, M. M. Critical period window for spectral tuning defined in the primary auditory cortex (A1) in the rat. J Neurosci. 27, 180-189 (2007).
- He, D. Z., Evans, B. N., Dallos, P. First appearance and development of electromotility in neonatal gerbil outer hair cells. Hearing Res. 78, 77-90 (1994).
- Hang, J., et al. Synchronized Progression of Prestin Expression and Auditory Brainstem Response during Postnatal Development in Rats. Neural Plast. , 4545826 (2016).
- Ehret, G. Development of absolute auditory thresholds in the house mouse (Mus musculus). J Am Audiol Soc. 1, 179-184 (1976).
- Møller, A. R. Hearing:anatomy, physiology, and disorders of the auditory system. , Academic Press. Dallas. (2006).
- He, D. Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P. Isolation of cochlear inner hair cells. Hearing Res. 145, 156-160 (2000).
- Tang, J., Pecka, J. L., Tan, X., Beisel, K. W., He, D. Z. Z. Engineered Pendrin Protein, an Anion Transporter and Molecular Motor. J Biological Chem. 286, 31014-31021 (2011).
- Fu, M., et al. The Effects of Urethane on Rat Outer Hair Cells. Neural Plast. 2016, 1-11 (2016).
