Artigo de método

Um modelo do rato de cirurgia ortopédica para estudar a disfunção cognitiva pós-operatória e regeneração de tecidos

DOI:

10.3791/56701

⸱

27 de fevereiro de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, 2Department of Orthopaedic Surgery, Duke University Medical Center, 3Duke Molecular Physiology Institute, 4Center for Translational Pain Medicine, Duke University Medical Center

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um modelo do rato de cirurgia ortopédica que tem sido usado para estudar os mecanismos de neuroinflammation pós-operatória e alterações comportamentais e quando combinado com parabiosis, para estudar a regeneração de tecidos durante o envelhecimento.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cirurgia é comumente usada para melhorar e manter a qualidade de vida. Infelizmente, em pacientes vulneráveis como os idosos, as complicações podem ocorrer e diminuir significativamente o resultado. Com efeito, após a cirurgia ortopédica de rotina para reparar uma fratura, até 50% dos pacientes idosos sofrem de complicações neurológicas como delírio. Além disso, a capacidade de curar e regenerar o tecido após a cirurgia diminui com a idade e pode afetar a qualidade do reparo de fratura e até de osseointegração de implantes. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos que levam a estas mudanças de idade-dependente poderia fornecer alvos estratégicos para minimizar o risco para essas complicações e otimizar os resultados. Aqui, apresentamos um modelo de mouse clinicamente relevantes da fratura da tíbia. As alterações no pós-operatório nestes ratos imitam alguns das deficiências cognitivas comumente observadas após cirurgia ortopédica de rotina em humanos. Brevemente, uma incisão é realizada na extremidade direita do hind sob condições estritamente assépticas. Os músculos são desassociados, e um pino de aço inoxidável-0.38 mm é inserido a crista superior da tíbia, no interior do canal intramedular. Osteotomia, em seguida, é executada, e a ferida é grampeada. Nós usamos este modelo para investigar os efeitos do trauma cirúrgico no pós-operatório neuroinflammation e alterações comportamentais. Aplicando este modelo de fratura em combinação com parabiosis, um modelo cirúrgico no qual são anastomosados 2 ratos, temos estudado as células e fatores secretados que sistemicamente rejuvenescer a regeneração de tecido e função de órgãos após a lesão. Seguindo nosso protocolo passo a passo, estes modelos podem ser reproduzidos com alta fidelidade e podem ser adaptados para interrogar muitas vias biológicas que são alteradas pelo trauma cirúrgico.

Introdução

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Cirurgia transformou-se o sistema de saúde médico e continuamente está contribuindo para a tecnologia de ponta, segurança melhorada e mantida a qualidade de vida. Infelizmente, a cirurgia também induz respostas fisiopatológicas que podem levar a complicações pós-operatórias, incluindo infecções de ferida, deficiências neurológicas e até mesmo mortalidade, especialmente em pacientes idosos,1,2. Cirurgia ortopédica é realizada rotineiramente, especialmente em adultos mais velhos, para melhorar a qualidade de vida e reparar lesões ósseas comuns. No entanto, até 50% dos pacientes de cirurgia ortopédica que são 65 anos e mais velhos experiência de deficiências neurológicas como delírio pós-operatório. Este consistentemente correlaciona-se com mau prognóstico, ou seja, 5-fold aumento do risco de mortalidade em 6 meses, persistente declínio funcional, maior tempo de cada paciente, maior tempo de permanência de hospital e taxas mais elevadas de colocação de repouso de enfermagem 3 , 4 , 5. alguns fatores de risco, incluindo a idade avançada, foram identificados, mas pouco é conhecido sobre os mecanismos responsáveis por deficiências neurológicas após a cirurgia.

Uma vez que as fraturas são muito comuns em idosos, estabelecemos um modelo do rato da fratura da tíbia para determinar o impacto do trauma periférico na recuperação pós-operatória, incluindo neuroinflammation e cérebro saúde (função cognitiva)6, 7. este modelo, originalmente descrito por Harry et al . 8, consiste de fixação intramedular e fratura da tíbia sob anestesia geral e analgesia e, portanto, imita a lesão de pele, trauma muscular, e osso reparar associado com fraturas de ossos longos comuns e reparar nos seres humanos. Após este procedimento, os ratos demonstram alterações em marcadores inflamatórios similares às alterações observadas em seres humanos9,10, bem como a ativação microglial no hipocampo, que está associado com déficits na memória declarativa e Neuroplasticidade hippocampal6,7,11. Nós combinamos anteriormente este modelo de fratura com parabiosis. Parabiosis é um modelo cirúrgico no qual 2 ratos são anastomosados, em assim compartilham um sistema circulatório. Este modelo tem proporcionado um grande avanço na compreensão dos efeitos regulamentares circulantes de células e fatores humorais na função do órgão no contexto da doença e idade12,13,14. Usando essa abordagem recentemente descobrimos sistêmicos fatores associados à fratura de idade-dependente cura12.

Aqui, apresentamos um protocolo que combina o modelo de fratura da tíbia com parabiosis para estudar mecanismos de dependente da idade óssea-para-cérebro, que são relevantes para a medicina regenerativa e neuroimunologia. 1A protocolo descreve o procedimento de parabiosis e protocolo 1B detalhes o procedimento de fratura tibial (figura 1A). Estas podem ser executadas independentemente ou em combinação, dependendo da natureza do interrogatório.

Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório e aprovados pelo cuidado de Animal institucional & Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Duke.

1. animais

  1. Manter os ratos em um ambiente com ar condicionado com ciclos de claro/escuro de 12-h e acesso adequado à água e comida padrão. Não mais que 5 littermates por gaiola de casa e evitar condições que poderiam incentivar a lutar.
  2. Use Camundongos C57BL6/J de fêmeas em 3 meses de idade (jovens) ou 18 meses de idade (velha).
  3. Para parabiosis, aclimate 2 ratos juntos há pelo menos duas semanas antes da cirurgia. Ratos são o selvagem-tipo C57BL6/J ou eGFP +.
  4. Verifique a condição corporal e aparência geral de ratos diariamente.

2. pré instalação para Parabiosis e cirurgia ortopédica

  1. Pese os 2 ratos.
  2. Administre anestesia geral através de um sistema de anestesia caudal constante O2 de 0,2 L/min. uso 5% de isoflurano para indução em uma câmara de indução.
    Nota: A profundidade da anestesia pode ser confirmada usando uma pitada de dedo do pé.
  3. Coloque os ratos em uma almofada aquecida em uma posição supina. Use uma sonda rectal para monitorar a temperatura do corpo durante o procedimento cirúrgico.
  4. Para manter a anestesia, diminuir a concentração inalada de isoflurano para 2,0% em 0,2 L/min, através de uma máscara. Monitor para garantir a adequada profundidade da anestesia.
  5. Monitorar os parâmetros fisiológicos (frequência respiratória, saturação de oxigênio e o coração bateram) forma não-invasiva usando um pulso oxímetro (opcional).

3. parabiosis cirurgia (protocolo 1A)

  1. Administrar a analgesia (lançamento buprenorfina, SR/lento, 0,1 mg/kg por via subcutânea) após a indução e antes de manipulação cirúrgica. Injete bupivacaína (0,25%), os flancos só antes de abrir. Aplique o lubrificante do olho.
    Nota: O protocolo de parabiosis pode ser executado independentemente da fratura da tíbia.
  2. Para todo o corpo interno suturar, use material de sutura polydioxanone 4-0. Para sutura externa todas, use material de sutura de polipropileno 4-0.
  3. Raspe cada um dos 2 ratos ao longo de uma linha contínua desde o cotovelo, o flanco e o joelho do lado a ser Unidas. Desinfetar com iodo + pele de álcool 70% esfregar mais de 3 ciclos em preparação para a incisão alternados.
    Utilizados instrumentos esterilizados e manter um campo esterilizado.
    Nota: Coloque o rato selvagem-tipo para a direita do mouse eGFP e preparar o flanco esquerdo do rato selvagem-tipo e o flanco direito do mouse eGFP para cirurgia (Figura 1).
  4. Em cada mouse, use uma tesoura para fazer uma incisão na pele ao longo do flanco, variando proximal ao joelho para imediatamente proximal ao cotovelo e sem incomodar os músculos debaixo da pele.
  5. Junte-se o tríceps dos animais com 2 suturas interrompidas.
  6. Junte-se as paredes do corpo ao longo dos flancos com uma sutura contínua, execução de passes de 7-9.
  7. Juntar o quadríceps do animal com 2 suturas interrompidas.
  8. Feche a pele dos 2 parabionts com suturas interrompidas.
  9. Permitir que os ratos a despertar no ar ambiente.
  10. Para garantir o sucesso do presente protocolo, deve ser mantida a saúde dos pares: monitorar os pares diariamente; executar a condição corporal, marcando duas vezes por semana; e pesar os pares duas vezes por semana.
    Nota: Cada par está alojado individualmente.
    Nota: Se usando regular buprenorfina (ou seja, não comunicado SR/lento) então Administre 0,1 mg/kg por via subcutânea em 1 mL de solução salina por rato duas vezes ao dia durante 3 dias.
  11. Permita 4 semanas de tempo de recuperação para garantir a circulação compartilhada entre parabionts se realizar cirurgia de fratura da tíbia.

4. cirurgia de fratura tibial (protocolo 1B)

  1. Administrar a analgesia (buprenorfina, 0,1 mg/kg por via subcutânea) após a indução e antes de manipulação cirúrgica. Injete bupivacaína (0,25%), o local cirúrgico proximal ao joelho pouco antes da abertura. Aplique o lubrificante do olho.
  2. Raspe a face medial da extremidade hind direita do mouse para expor a área cirúrgica e desinfetar com iodo + esfoliação de pele de álcool 70% por 3 ciclos alternados. Manter um campo cirúrgico estéril durante todo o procedimento. Para limitar a contaminação; use instrumentos esterilizados em autoclave e luvas; completar a cirurgia sob um microscópio de dissecação (opcional); e usar uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal.
    Nota: Se o protocolo é realizado em parabionts, apenas 1 rato está fraturado no par (a tíbia direita do direito do mouse). Ver figura 1B para um diagrama esquemático da fratura na parabionts.
  3. Use uma tesoura para fazer uma incisão na pele ao longo do aspecto medial da extremidade direita do hind proximal do joelho até o midshaft da tíbia sobre o direito do mouse.
  4. Expor o midshaft da tíbia e localizar visualmente a diáfise. Flexione o joelho e visualizar o planalto tibial utilizando o ligamento da patela-femoral como um marco.
  5. Visualizar o tendão patelar; manualmente broca rolando os dedos polegar e indicador, um buraco de 0,5 mm no canal intramedular usando uma agulha de calibre 25.
    Nota: O orifício perfurado será executado paralelamente ao longo da tíbia, em através da tíbia.
  6. Introduza um pino de aço inoxidável-0.38 mm através do orifício de cerca de 15 mm a cavidade medular, até resistência é senti e cortar flush com o planalto tibial usando um cortador de arame (ver vídeo complementar 1 para uma reconstrução 3D).
  7. Usando a tesoura reta de Bonn, fratura midshaft a tíbia (diáfise). Ver Figura 1 para um diagrama esquemático da fratura.
  8. Observe visualmente o local da fratura e tecidos adjacentes para inspecionar para estabilização da visão da fratura.
  9. Feche com grampos dérmicos.
  10. Coloque os ratos no absorvente aquecida para recuperar antes de retorná-los para uma gaiola limpa em casa. Injete soro fisiológico normal 1 mL pré-aquecido (37 ° C) por via subcutânea em cada rato para a substituição do fluido.
  11. Verifique os ratos diariamente para sinais de claudicação, infecção ou sangramento.
    Nota: Se usando regular buprenorfina (ou seja, não comunicado SR/lento) então Administre 0,1 mg/kg por via subcutânea em 1 mL de solução salina diariamente por 3 dias.

Resultados

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Depois de osteotomias transversais cuidadosamente foram realizadas sob condições estéreis com constante inserção dos pinos e sutura adequada, ratos não mostraram sinais de claudicação, infecção ou sangramento na perna esquerda após a cirurgia. Ortopédica cura foi avaliada por meio de análise radiográfica e Histomorfometria depois de safranina-O mancha (Figura 2). Radiografias de tíbias fraturadas parece indicaram mais deposição de tecido nos calos de fratura de ratos jovens do que nos calos de fratura de ratos envelhecidos. Calos de fratura foram descalcificados e incorporados em parafina em preparação para análise histológica. Seções foram coradas com safranina-O e deposição de tecido foi quantificada utilizando análise de Histomorfometria. Calos de fratura de ratos jovens continham mais osso e tecido fibrótico menos do que os calos de fratura de ratos envelhecidos.

Fratura da tíbia induz inflamação sistêmica e central6,7,11,15,16. Com efeito, níveis periféricos de citocinas pró-inflamatórias e padrões moleculares associadas a perigo (represas) são rapidamente elevados após cirurgia ortopédica, ambos em camundongos e humanos7,17,18. Isto contribui para a ativação de células microglial no cérebro através de vários mecanismos de sinalização que envolve vias neuronais, celular e humoral7,15,19,20, 21. Após cirurgia, disfunção endotelial, abertura da barreira hemato - encefálica e periférico macrófago infiltração contribuir para neuroinflammation hippocampal aguda no selvagem-tipos e Ccr2RFP / + Cx3cr1GFP / + de ratos adultos15 , 19e têm sido associados com déficits de memória subsequentes que se assemelham ao delírio humano e disfunção cognitiva pós-operatória15,19,22. Esta resposta MPTP é exacerbada em animais envelhecidos, com alterações significativas na morfologia microglial, detectadas por imunocoloração IBA-1 (Figura 3).

Usando o modelo de fratura da tíbia descrito aqui, também encontramos neurogênese hippocampal transitoriamente prejudicada, como evidenciado por uma redução em immunostaining doublecortin (DCX) no giro denteado20. Eletrofisiológicos medições de potenciação de longa duração (LTP), um substituto para a função de memória, revelaram uma perturbação dependente do tempo em neuroplasticidade no pós-operatório11. Ratos após a cirurgia também exibem deficiências em função de memória hipocampo-dependente, por exemplo usando o medo condicionado avaliação comportamental (Figura 4). Medo condicionado, ratos são colocados em uma câmara e expostos a um sinal auditivo, seguido por um estímulo contrário (ou seja, footshock). Três dias após a cirurgia da tíbia, os ratos são testados na câmara de condicionamento, desta vez sem qualquer estimulação auditiva ou contrário, e comportamento de congelamento é gravado como um índice de memória (para um protocolo detalhado ver23).

Idade avançada é um fator crítico de risco para o declínio de memória. Ainda, à medida que envelhecemos, a capacidade de reparação tecidual e regeneração também diminui embora estes mecanismos ainda mal compreendidos. Assim, usamos os protocolos descritos neste documento para executar heterocrónico parabiosis (emparelhamento animais jovem/velha) e avaliados fratura cura dentro do mouse envelhecido (para um parabiosis detalhado protocolo ver24). Sangue-partilha entre pares de parabiotic foi confirmado e encontrado para ser igual12. Exposição a um reparo ósseo de circulação jovem reforçada com União anterior, aumento da deposição óssea e diminuição da fibrose (Figura 5)12. Este rejuvenescimento da regeneração óssea ocorreu independente dos endógenos osteocalcina-positivo osteoblastos (célulasFigura 5, marrom), mas prefiro invocado células CD45 positivas que migraram a jovem parabiont (célulasFigura 5, azul) . Estes resultados indicam que as células hematopoiéticas CD45 positivas secretam um nicho jovem e saudável, que é capaz de sinalizar para as células osteoblásticas envelhecidas induzindo-os a tornar-se mais ativo.

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Figura 1: representação esquemática da cirurgia de fratura da tíbia e parabiosis. (A) linha do tempo para a realização de parabiosis e fratura da tíbia (protocolo 1A) ou fratura da tíbia sozinha (protocolo 1B). (B) tíbias de ratos de 20 meses de idade em pares parabiotic Isocrônico ou heterocrónico foram fraturadas (perna direita do direito do mouse está fracturada, conforme indicado com um X). Os ratos cinzas retratam sua ratos enquanto ratos verdes retratam eGFP ratos. (C) diagrama esquemático do modelo de fratura da tíbia, com fixação intramedular e eixo médio fraturamento. Veja também complementar Video 1 para uma reconstrução 3D do membro hind e fixação da tíbia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: fratura da tíbia cura dentro de modelos jovens e velhos rato. As tíbias de ratos jovens ou velhos foram fraturadas e calos de fratura foram investigados 21 dias pós lesão. (A) imagem radiográfica e histológica coloração (safranina-O) foram usados para avaliar a fratura calos 21 dias pós fratura. Coloração mostra colágenas tecidos em azul e os proteoglicanos (contidos dentro da cartilagem) em vermelho. Linhas tracejadas indicam a localização aproximada do calo da fratura. Histomorfometria (B) foi usada para avaliar a quantidade de osso, cartilagem e tecido fibrótico depositados dentro da fratura calo 21 dias pós fratura. Os dados são expressos como média ± intervalo de confiança de 95%, * P < 0.05, estatisticamente significativa (One-Way ANOVA, teste de Dunnett), escala barras representam 2 mm, e imagens foram obtidas utilizando um microscópio, 1.25 x objetivo. n = 9 para cada amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: cirurgia induzida por ativação microglial idade-dependente no hipocampo. Cirurgia de fratura da tíbia induz maior neuroinflammation hippocampal em ratos envelhecidos (20 meses de idade) em comparação com camundongos C57BL6/J de 4 meses de idade. Cérebro-seção coloração com marcador microglial IBA-1 mostra mais positiva de células e alterações morfológicas em cirúrgico agrupa 24 h após a cirurgia. Imagens foram obtidas com um microscópio de epifluorescente com uma ampliação de 100 x.; barra de escala representa 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: prejudicada a neurogênese, potenciação de longa duração e função de memória após a cirurgia de fratura da tíbia. (A) DCX, um marcador quantitativo para a neurogênese, é significativamente reduzida no giro denteado do hipocampo a 24 h após a cirurgia. Imagens foram obtidas com um objectivo de microscópio-varredura a laser confocal com uma ampliação de 10x; escala da barra representa 10 µm. eletrofisiologia (B) em fatias hippocampal de controles ou ratos 24 h após a cirurgia. Potenciação de longa duração (LTP) foi induzida pela estimulação de alta frequência (HFS) e gravou mais de 1 h. potenciais pós-sinápticos excitatórios (fEPSPs) de campo foram registrados desde o CA1 stratum radiatum usando uma pipeta de gravação extracelular repleta de regular líquido cefalorraquidiano artificial. A 24 h após a cirurgia, indução de LTP é notavelmente reduzida em comparação com os ratos controle. Dados são expressos como média ± no MEV mostrou n = 3, * p < 0.05 1-way ANOVA. Dependente de Hippocampal (C) função de memória (definido como % de congelação usando rastreamento medo condicionado) é prejudicada em ratos após a cirurgia, em comparação com controles e animais expostos a anestesia só. Dados são expressos como média ± no MEV mostrou n = 9-10, * p < 0.05 1-way ANOVA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: cirurgia Parabiosis leva ao rejuvenescimento da enxertia de cura, partilha de sangue e células doador fratura. Isocrônico e heterocrónico parabiosis emparelhamentos foram estabelecidos e o mouse envelhecido em cada par foi fraturado e avaliado para consolidação óssea. (A) fratura calos foram investigados utilizando imagens radiográficas. Linhas tracejadas indicam a localização aproximada do calo da fratura. (B) enxertia de células eGFP + foi confirmada dentro da medula óssea. (C) imuno-histoquímica do calo da fratura foi usado para identificar células de doador eGFP+ (azuis) e células osteoblásticas osteocalcina+ (marrons) do parabiont. Barras de escala representam 50 µm e imagens foram obtidas utilizando um objectivo de 40x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo complementar 1: reconstrução 3D da extremidade hind e fixação da tíbia. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

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Fraturas são um problema clínico comum e permanecem a principal causa de morbilidade, nomeadamente o rápido crescimento da população sénior. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para um modelo do rato da fratura da tíbia para estudar os mecanismos responsáveis pela neuroinflammation pós-operatória e comprometimento cognitivo. Este modelo pode ser combinado com cirurgia parabiosis para estudar interações neuro-imune, regeneração de tecidos e outros processos de sinalização. Compreender esses mecanismos fornecerá alvos estratégicos para minimizar os riscos de complicações pós-operatórias e otimizar os resultados.

Vários modelos ortopédicos foram desenvolvidos para estudar a reparação óssea em roedores25. Nós adotado e modificado este procedimento de fratura da tíbia, originalmente descrito por Harry et al . 8, para estudar os efeitos de cirurgia ortopédica na função cerebral. Também usamos este modelo de fratura em combinação com o nosso modelo de parabiosis para investigar os fatores que são responsáveis pela consolidação óssea e a regeneração dos tecidos da idade-dependente. Quando realizada sob anestesia geral volátil, este procedimento de fratura da tíbia requer apenas cerca de 15 min por animal, resulta em zero de mortalidade mínima (dependendo da idade do mouse e susceptibilidade genética subjacente) e recapitula comum insultos associados com fratura de ossos longos e traumas cirúrgicas ortopédicos. Assim, este modelo é ideal para interrogar vias biológicas e executar avaliações longitudinais. No entanto, é fundamental que a osteotomia e fixação são reprodutíveis, e que os danos ao tecido mole são consistente. Danos musculares podem ser modulados, por exemplo por despir o periósteo e a beliscar os músculos ao redor para fazer a cirurgia mais traumático. Modelos de fratura traumática induzido por trauma contuso não fixa ou flexão de três pontos não proporcionaria tal precisão ou consistência. Estes procedimentos geralmente resultam em re-ferimento, o que leva a resposta inflamatória prolongada. Inversamente, os modelos de fratura envolvendo fixação rígida têm uma inflamação mais moderada, o que não totalmente recapitular os danos associados com a cirurgia ortopédica26,27.

Outros modelos usando pinos de liga de titânio foram desenvolvidos para artroplastia humana estreitamente imitar e podem ser mais relevantes para interrogar a instabilidade da prótese, osteólise e complicações associadas a prótese em ratos28,29 . Modelos de furo tais como o apresentado aqui, fornecer estabilização adequada, e os ratos podem ser testados em paradigmas comportamentais sem défices significativos que poderiam confundir tarefas como medo condicionado ou aberto campo locomoção/ansiedade de testes6 ,7,11,15,19,20. No entanto, deformidades rotacionais podem ocorrer se a fixação não é adequadamente bloqueada. Alguns modelos usam um fixador externo, que fornece a estabilização superior, mas é um desafio para implementar em um tibia do rato, embora este possa ser aplicado com sucesso em um rato fêmur27.

Deficiências cognitivas, incluindo delírio e disfunção cognitiva no pós-operatório, são complicações comuns após cirurgia ortopédica para reparação de fratura, especialmente em pacientes idosos e frágeis30. Este modelo de rato clinicamente relevantes da cirurgia de fratura tibial demonstra que citocinas sistêmicas pós-operatórias lançamento6,7,17, prejudicada a barreira sangue - cérebro função15,19 e alterado microglial morfologia16,22, contribuir para a perda de memória e pode representar recursos críticos das complicações neurológicas pós-operatórias vistos em muitos pacientes após cirurgia ortopédica. É importante notar que outros procedimentos cirúrgicos têm sido utilizados para modelar a disfunção cognitiva pós-operatória em ratos. Estes incluem abdominal31,32,33 e cirurgia vascular34 , bem como trauma superficial35,36. A técnica de parabiosis é aplicável a todos esses modelos, que compartilham esses pontos semelhantes, incluindo inflamação, ativação glial e défices comportamentais, que podem ser mediados por mecanismos comuns.

Estudos que incluem parabiosis revelaram novos papéis para fatores circulantes que podem afetar a função cognitiva, neuroinflammation e rejuvenescimento de tecidos em animais envelhecidos37,38,39,40 ,41,42. Temos mostrado que parabiosis pode ser combinado com êxito com o modelo de fratura da tíbia descrito aqui para interrogar vias regenerativas e estudar mecanismos que envolvem fatores pelo sangue que cura de influência e fratura reparar12. Aqui, temos demonstrado que a capacidade de reparação de fratura de um animal envelhecido pode ser rejuvenescida quando o animal envelhecido é anastomosado a um animal jovem. Esta inversão de idade estava enraizada na enxertia das células hematopoiéticas no local da fratura. Curiosamente, tal rejuvenescimento também poderia ser alcançado através do transplante de medula jovem em ratos envelhecidos. A este respeito, transplante de medula óssea pode ser considerada uma abordagem alternativa mais direta e mais simples para parabiosis. No entanto, parabiosis é um modelo mais robusto para investigar a função de células e fatores de circulação. Esperamos que uma combinação de parabiosis e modelos de cirurgia ortopédica desempenhará um papel importante em responder perguntas críticas no cuidado perioperatório e biologia do envelhecimento.

Em resumo, apresentamos um protocolo passo a passo para um modelo do rato da fratura da tíbia para estudar os mecanismos responsáveis pela neuroinflammation pós-operatória e comprometimento cognitivo após procedimentos cirúrgicos ortopédicos. Este modelo pode ser combinado com um procedimento parabiosis para estudar interações neuro-imune, regeneração de tecidos e outros caminhos. Definir esses mecanismos fornecerá alvos estratégicos para minimizar os riscos de complicações pós-operatórias e otimizar os resultados.

Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos a Kathy Gage, BS (departamento de Anestesiologia, centro médico da Universidade Duke, Durham, NC) pela assistência editorial. NT reconhece apoio de uma bolsa de inovação do sonho de Anestesiologia Duke e NIH/NIA R01 AG057525-01.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
IsofluranoPiramal HealthcareNDC 66794-017-25Outros agentes voláteis ou anestesia injetável também podem ser usados
BuprenorfinaReckitt-Benckiser PharmaceuticalsNDC 12496-6757-1Opcional e dependendo das recomendações individuais do Comitê de Cuidados e Uso de Animais
Institucionais EtanolFisher Scientific04-355-451Solução a 70% para tratamento anti-séptico de pele e limpeza
10% povidona IodoDynarexPara tratamento antisséptico da pele
SomnoSuiteKent ScientificSS-01Low Flow  Sistema de anestesia
MouseSTATKent ScientificPS1161Oxímetro de pulso & Monitor de Frequência
CardíacaShaver Wahl9854L
EstereomicroscópioLeicaMZ6
Cabo de BisturiFerramentas de ciência fina10003-12
Lâminas de bisturi - #11Ferramentas de ciência fina10011-00
Pinça AdsonFerramentas de ciência fina11006-12Necessário para descascar o periósteo
Íris FórcepsFerramentas de ciência fina11066-07Útil (dentes 1x2) para causar trauma muscular localizado/tecido mole
Tesoura Bonn (Reta)Ferramentas de ciência fina14084-08Bom para osteotomia, note para mudar regularmente conforme se torna rombudo
Tesoura finaFerramentas de ciência fina14058-09Tesoura afiada para cortar suturas
22G x 3.5 In Quincke  Agulha EspinhalBD405181Use haste interna para fixação
Porta-agulhasFerramentas de ciência fina12001-13
SutureLook1079B
C57BL6/JJackson Laboratory  estoque nº 000664
eGFP+ (expressando proteína fluorescente verde aprimorada de forma onipresente)Jackson Laboratory  Nº de estoque 003291

Referências

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