Dissecção e cultura de explante de murino alantoide para a análise In Vitro de fixação alantoico

Resumo

Descrevemos um ensaio em vitro de fixação corioalantoicas de modelo, o primeiro passo na formação da placenta. O protocolo demonstra a cultura de dissecção e explante de murino allantoides em imobilizado α4β1 integrina. Acessório de alantoide é avaliado microscopicamente em pontos de tempo pré-determinado.

Resumo

A placenta é essencial para o crescimento e o desenvolvimento de embriões de mamíferos. Por este motivo, inúmeras alterações genéticas e insultos ambientais também prováveis que perturbam o desenvolvimento da placenta ou função podem causar perda de gravidez precoce em ratos e seres humanos. No entanto, simples em vitro ensaios para a tela para potenciais efeitos sobre a formação da placenta são escassos. Aqui, focalizamos o primeiro e fundamental passo na formação da placenta, que consiste de penhora do alantoide com o cório de modelagem. Nós descrevemos um método para avaliar rapidamente o acessório de explantes alantoico na imobilizado α4β1 integrina, que serve como substrato cório-mimética. Esta abordagem in vitro permite uma avaliação qualitativa do acessório e espalhando o comportamento de vários explantes alantoide em pontos diferentes vez consecutiva. O protocolo pode ser usado para investigar o efeito de mutações específicas do mouse, drogas ou vários fatores ambientais que têm sido associados a complicações na gravidez ou perda fetal no alantoide acessório ex vivo.

Introdução

A placenta é indispensável para o crescimento embrionário e desenvolvimento no ambiente uterino. Constitui a interface para o oxigênio, metabólito e troca de nutrientes entre a circulação fetal e materna e também funções como órgão endócrino e imunológico. Qualquer insulto endógeno ou exógeno que prejudica o desenvolvimento da placenta pode levar a retardo de crescimento intra-uterino, perda fetal ou complicações na gravidez, tanto em ratos e em seres humanos¹. Enquanto o número de mutações específicas do mouse que causam fisiologia placentária anormal continua a aumentar², com 219 genótipos atualmente listados no site da informática do genoma do rato (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), muitos destes fenótipos não são bem compreendidos, do ponto de vista mecanicista. Além de alterações genéticas, drogas pequena molécula, anticorpos monoclonais, toxinas, agentes patogénicos, metabolitos em excesso ou vários agentes ambientais podem afetar desenvolvimento de placenta e função^{3,4,5 , 6 , 7}. ainda, simples em vitro ensaios que passos críticos do modelo em desenvolvimento de placenta são escassos.

Desenvolvimento placentário murino é iniciado no início midgestation, quando o alantoide (o precursor do desenvolvimento do cordão umbilical) emerge da extremidade posterior do embrião como um broto que cresce em direção do córion⁸. Chorioadhesive células na camada exterior do bud alantoico mediam o apego e a difusão do alantoide na superfície do cório (corioalantoicas "fusão"). O córion dobra-se posteriormente em vilosidades no qual vasculatura do alantoide cresce para formar o labirinto, a camada interna da placenta onde nutrientes e oxigênio são trocados entre o sangue materno intimamente justapostos sinusoides e vasos embrionários^{9 ,10}.

O anexo do alantoide para córion é o passo inicial e fundamental na formação do labirinto, e defeitos neste processo estão entre as causas mais comuns de letalidade embrionária em midgestation¹. Embora um número de mutantes de rato tem sido descrito onde corioalantoicas ceda a ocorrer¹⁰, e o banco de dados do MGI atualmente lista 108 mutantes de rato que caracterizam-se por fusão corioalantoicas anormal (http:// www.Informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), a interação intercelular entre as células vasculares adesão molécula-1 (VCAM-1, expressado na mesoderme alantoico) e α4β1 integrina (expressado no mesotélio gonadotrofina coriônica, que é derivado do mesoderma extraembryonic) parece ser indispensável para a ligação corioalantoicas e fusão^11,12,13. Coloração imuno-histoquímica de todo-monte selvagem-tipo embriões tem mostrado que o VCAM-1 é expresso dentro os dois terços distais do caule alantoico no dia aproximadamente embrionário (E) 7,5¹³ (palco do somite 1-4), e que sua expressão permanece elevada durante corioalantoicas anexo e - fusão^11,12. Falha de alantoico apego ao córion normalmente é detectada por análise histológica de botões do útero. No entanto, alantoide tamanhos são fisiologicamente altamente variáveis entre e mesmo dentro de ninhadas do mesmo grau de desenvolvimento¹⁴, e o alantoide só pode anexar o córion quando atingiu um tamanho suficiente para fazer contato físico. Reflectindo esta variabilidade natural, anexo corioalantoicas ocorre em algum momento entre ~ E 8.0 E 9.0 e no uteroe uma avaliação estatisticamente confiável deste processo pela histologia depende, portanto, a análise de um grande número de conceptuses para obter suficiente amostras na fase do desenvolvimento apropriado.

Aqui, descrevemos um método para avaliar fixação alantoico ex utero que é menos dependente do tamanho do alantoide. Demonstramos a dissecação de embriões do rato e seus allantoides desde o útero de ratos grávidas ~ 8 dias post coitum (dpc; dpc 0.5 designa a detecção de um tampão vaginal), e a cultura subsequente do alantoide explants na α4β1 imobilizado integrinas. Este método permite uma avaliação rápida, funcional de acessório e espalhando o comportamento de vários explantes alantoide em paralelo e em pontos diferentes de tempo sucessivos. O protocolo pode ser usado para tela para efeitos de diversos fatores ambientais, drogas ou mutações específicas no alantoide acessório ex vivo.

Protocolo

Reprodução de rato foi aprovada pelo Regierung Unterfranken, e todas as análises foram realizadas em estrita conformidade com todos os alemão e da União Europeia leis e regulamentos aplicáveis relativos ao uso de animais de laboratório e cuidados.

1. revestimento de microtitulação placas com α4β1 integrina para Ex Utero Allantois explante cultura

1. Reconstitua a liofilizado murino α4β1 integrina a 200 µ g/mL em salina tampão fosfato (PBS). Dilua para uma concentração final de 10 µ g/mL em pré-aquecido (37 ° C) PBS. Pipete 20 µ l/poço da solução diluída α4β1 integrina para o número necessário de poços de uma placa de microtitulação (1 alantoide/poço).
   Nota: Evite a formação de bolhas de ar quando o revestimento dos poços da placa de microtitulação.
2. Incube as placas de microtitulação para 60 min a 37 ° C, colocando-os em uma incubadora de cultura de tecidos umidificado.
3. Aspire cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta. Usar sucção suave e inclinar a placa para evitar tocar bem fundo com a ponta da pipeta. Lavar os poços duas vezes pela adição de 50 µ l de meio de cultura previamente aquecido (37 ° C) como de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) e remover o meio de lavagem por sucção suave.
4. Passo fundamental: bloco de ligação grátis sites pela adição de 50 µ l/poço de 0,1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) / DMEM e incube por ≥ 30 min a 37 ° C, colocando as placas de microtitulação numa incubadora umidificado cultura de tecidos.
   Nota: Explantes alantoide podem anexar várias superfícies na presença de soro. Portanto, é imperativo para bloquear sites de ligação não-específica, após o revestimento dos poços com integrina e antes de adicionar o alantoide dissecado por explantes cultura no soro contendo médio (consulte a etapa 4.4).
5. Manter os Poços revestidos na solução de bloqueio a 37 ° C, até que seja necessário na etapa 4.4.

2. o útero dissecação de um rato grávida na Dpc 8

Nota: Reduza taxas de falso-positivo de gravidez, de discriminação de ganho de peso¹⁵.

1. Sacrifica o mouse por deslocamento cervical. Desinfecte o casaco na região abdominal por pulverização com etanol a 70% (v/v).
   Nota: Utilize luvas quando manusear os ratos. Eutanásia por deslocamento cervical sem anestésicos impede a contaminação química do alantoide, que pode interferir com o acessório de alantoide.
2. Abra a pele abdominal, fazendo uma pequena incisão na linha com uma tesoura. Use os dedos com luvas para manter a pele acima e abaixo da incisão e separar a pele em direção ao peito e a cauda do rato.
3. Agarre o peritônio com fórceps. Com a outra mão, faça uma incisão em forma de V de anterior para posterior usando a tesoura e mover o tecido para expor na cavidade abdominal. Use a pinça para empurrar os intestinos de um lado para obter acesso ao útero.
4. Localize os dois cornos uterinos. Segure o colo do útero (o segmento caudal) com fórceps e corte os ligamentos com uma tesoura bem. Então retire ambos os cornos uterinos por separando os ovidutos com uma tesoura.
5. Usar fórceps para transferir o útero em um prato de 10cm estéril contendo estéril, temperatura (RT) PBS. Remova o tecido adiposo, vasos e nervos que cercam os cornos uterinos com pinça fina e/ou tesoura (figura 1A).

3. embrião dissecação

Nota: Execute as seguintes etapas sob um microscópio estereoscópico equipado com uma gama de zoom de 8:1.

1. Separe os embriões por corte entre os locais de implantação com uma tesoura. Segure o revestimento do útero muscular dos brotos útero com pinça e puxá-lo distante para expor a decídua (figura 1B).
2. Usando fórceps, transferi os gomos do útero para uma nova placa de 10 cm contendo estéril, RT PBS.
3. Corrigi a decidua em torno do embrião com as pontas da pinça.
4. Fazer uma incisão no lado anti-mesometrial da decidua com pinça fina (Figura 1) e descascar a decidua com fórceps para expor o embrião (Figura 1).
   Nota: O polo mesometrial da decidua é altamente vascularizado e pode ser mais largo na base que a parte de anti-mesometrial, que contém o embrião e aparece mais pálida.
5. Disse o embrião com pinça (Figura 1E, F).
6. Usando uma microcolher, transferi o embrião para uma gota de PBS estéril contido em um prato de estéril de 3,5 cm.
7. Transferir o embrião para uma gota fresca de PBS no mesmo prato 3,5 cm usando uma microcolher e dissecar o embrião do saco vitelino usando fórceps (Figura 1, H).
8. Opcionalmente, se necessário (por exemplo, para a genotipagem por reação em cadeia da polimerase), transferir o saco vitelino em um tubo estéril aspirando com ~ 5 µ l PBS em uma ponta da pipeta orifício grande 200 µ l. Loja a-20 ° C.
   Nota: Tecido materno (ou seja, o saco vitelino parietal, incluindo a membrana do Reichert e o cone de ectoplacental) que possam contaminar a preparação do saco vitelino pode levar a resultados errôneos de genotipagem. Remoção desses tecidos é mais fácil antes a dissecação do embrião do saco vitelino.

4. o alantoide dissecção e cultura Ex Utero no imobilizado α4β1 integrina

1. Corte o alantoide do seu local de inserção basal na extremidade posterior do embrião usando pinça fina (Figura 1 H).
2. Opcionalmente, se a plataforma do desenvolvimento é necessária, conta os pares somite do embrião por inspeção visual, usando um microscópio equipado com ótica de contraste de fase e um 5 × 10 × objetivo.
   Nota: O embrião pode ser estendido com fórceps para facilitar a contagem do somite. Fusão e apego corioalantoicas ocorrem entre E 8.0 e 9.0 E em embriões com pares de 6 somite ≥. Giro começa em embriões com 6-8 pares de somite.
3. Pipeta de 40 µ l/poço de DMEM suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino, L-glutamina e antibióticos no número necessário de poços de placa do microtiter pré-revestida (ver seção 1).
4. Recolher o alantoide flutuante aspirando com ~ 5 µ l PBS, em um grande orifício de uma ponta de pipeta de 200 µ l. Transferi 1 alantoide/bem.
5. Incubar as allantoides colocando as placas de microtitulação numa incubadora de cultura de tecidos umidificado (37 ° C, 5% CO₂) para , por exemplo, 6, 12 e 24 h. Para evitar interferência com o acessório de alantoide, não mova as placas de microtitulação entre esses pontos de tempo.
6. Em cada ponto do tempo, marcar acessório alantoide (por exemplo, nenhum acessório/flutuante alantoide alantoide parcialmente ou totalmente anexada; totalmente propagação alantoide) usando um microscópio equipado com ótica de contraste contraste ou diferencial do interferência fase e um × 5 ou 10 × objectivo (Figura 2).
   Nota: Exemplos representativos de allantoides recém isoladas e totalmente anexadas são mostrados na Figura 2. Ex utero, ponta distal do allantoides isolados de camundongos C57BL/6J de sua anexa dentro de 4-6 h (isto é referido como penhora parcial da alantoide), e acessório completo do alantoide inteira é alcançado dentro de ~ 12 h de cultura. Por 18-24 h, o explante tem aplainado e assumiu uma forma circular (referida para como totalmente espalhar alantoide) com um CD31 positivo do plexo vascular^9,16.

5. confirmação dos coloração o alantoide explantado para o CD31 marcador de células endoteliais

1. Aspire o meio de cultura de explantes de propagação totalmente e corrigir as células adicionando 40 µ l/poço de 4% (p/v) paraformaldeído/PBS.
   Nota: Paraformaldehyde é tóxico. Use luvas e óculos de segurança para evitar o contato de olho e pele.
2. Incubar durante 10 minutos a RT e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Lavar três vezes com a adição de 40 µ l/poço de PBS e remover o meio de lavagem por sucção suave.
3. Permeabilize as células e bloquear sites inespecificas adicionando 40 µ l/poço de 0,1% (v/v) de soro de cabra normal BSA/10% Triton X-100/0.1% (w/v) (v/v) em PBS por 30 min em RT. Wash duas vezes adicionando 40 µ l/poço de PBS e remover o meio de lavagem por sucção suave.
   Nota: O protocolo pode ser pausado a noite neste ponto.
4. Mancha de células, adicionando 20 µ l/poço de anticorpos anti-CD31 primário diluído 01:50 em 0,1% (p/v) BSA/PBS durante a noite a 4 ° C. Lavar três vezes com a adição de 40 µ l/poço de PBS e remover o meio de lavagem por sucção suave.
5. Detecta anticorpos primários ligados pela adição de 20 µ l/poço de cabra secundário fluorescente etiquetado anticorpos anti-rato diluído 1: 200 em 0,1% (p/v) BSA/PBS por 1h em placas de microtitulação RT. Protect da luz por envolvimento em papel de alumínio ou colocando em uma câmara escura. Lavar três vezes com a adição de 40 µ l/poço de PBS e remover o meio de lavagem por sucção suave.
6. Inserir células, adicionando 20 µ l/poço de meio de montagem. Encube por ~ 1h no RT até o meio de montagem tem solidificado. Armazenar placas de microtitulação no RT ou a 4 ° C, protegido da luz.
7. Imagem do plexo vascular do alantoide explants sob um microscópio de fluorescência, equipado com um × 5 ou 10 × objetivo e filtros de fluorescência apropriado.
   Nota: Imagens representativas do plexo vascular CD31 positivo de uma totalmente propagação alantoide são mostradas na Figura 3. Outros marcadores para o plexo vascular, tais como anticorpos dirigidos contra Flk-1, Flt, gravata-1 ou Tie-2 pode ser usado como bem¹⁶.

Resultados

Este protocolo descreve um método para isolar e explantes murino allantoides ex vivoe detalha a avaliação qualitativa do alantoide penhora a α4β1 integrina, um processo crítico durante na vivo corioalantoicas fusão. Os representante resultados mostrados na figura 1A–H demonstram as etapas sucessivas de isolamento alantoide a partir do útero gestante. Tecidos maternos que cercam os cornos uterinos, tais como ...

Discussão

Na presença de soro, que é uma fonte rica de moléculas pro-adesivo da matriz extracelular como a fibronectina, explantes alantoide prontamente irão anexar vários plástico, vidro ou superfícies de filtro^9,16. Assim, se o objectivo do ensaio realizado é especificamente investigar o efeito de uma modificação genética ou qualquer outro tratamento no acessório alantoide para imobilizado α4β1, é fundamental para bloquear sites de ligação não-específica (por exemplo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos selvagens C57BL/6J	The Jackson Laboratory	Stock No:
70 % (v/v) Etanol	VWR International	930031006
Pinça padrão	padrão Fine Science Tools	11000-12	Pinça utilizada para abrir a cavidade abdominal.
Pinça de micro dissecação	Ferramentas de Ciência Fina	11254-20	Dumont # 5 forceptos de biologia médica com ponta fina e afiada.
Tesoura fina	Ferramentas Fine Science	14094-11	Lâminas retas.
Tesoura de mola	Ferramentas Fine Science	15012-12	Tesoura de mola Noyes com lâminas de 14 mm para a dissecção de brotos uterinos.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Diâmetro da colher.
Placas de microtitulação	ibidi	81501	Usamos lâminas de angiogênese não revestidas e estéreis (volume interno 50 µ L) com uma superfície hidrofóbica que não é tratada com cultura de tecidos para reduzir não-&# 945; 4β Ligação mediada por 1 ao plástico.
Placa de 10 cm	Nunc	150350	Placas de cultura de tecidos estéreis.
Placa de 3,5 cm	Nunc	150288	Placas de cultura de tecidos estéreis.
Ponteiras de pipeta de orifício grande	Biozym	VT0140X	Pontas de pipeta de baixa ligação, 200 µL.
α 4β 1 integrina	R& D Systems	6054-A4	Murine α 4β 1 integrina expressa recombinantemente e purificada a partir de uma linhagem celular de ovário de hamster chinês.
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	sem Ca2+ e Mg2+.
Dulbecco' s Meio de Águia Modificado (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	A formulação contém 4,5 g/L de glicose, 110 mg/L de piruvato de sódio e 3,7 g/L de NaHCO3 mas nenhuma L-glutamina, que é adicionada separadamente.
Penicilina/Estreptomicina	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicilina e 10,000 µ g/mL de estreptomicina). Preparar e armazenar alíquotas a -20 °; C para evitar congelamento/descongelamento.
L-Glutamina	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Solução estoque. Preparar e armazenar alíquotas a -20 °; C para evitar congelamento/descongelamento.
Soro fetal bovino	Biochrom	S 0115	Usamos FBS inativado por calor (aquecido a 56 &graus; C por 30 min com mistura para inativar o complemento).
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	Usamos albumina livre de protease e ácidos graxos. Preparar uma solução a 0,1 % (p/v) em DMEM. Filtrar a solução através de um filtro de cultura celular descartável com um 0,22 µ m tamanho dos poros e membrana de baixa ligação às proteínas, e armazenar alíquotas a -20 °C.
para-formaldeído	Carl	Roth 0335.2	Para fazer uma solução de formaldeído em PBS, pesar para-formaldeído em pó em um exaustor ventilado e adicioná-lo ao PBS pré-aquecido a cerca de 60 &graus; C em um béquer em uma placa de agitação. Adicione 1 N NaOH gota a gota até que a solução desapareça. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente e filtre através de uma seringa de filtro de 0,22 mm. Ajuste o pH com HCl diluído para cerca de 6,9 e ajuste para o volume final com PBS. Nós alíquotas e congelamos a solução, mas ela também pode ser armazenada a 4 & C por aproximadamente quatro semanas.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use pontas de pipeta de orifício largo para manusear o Triton X-100 não diluído.
Soro de cabra normal	Sigma Aldrich	G9023	Para bloquear a ligação inespecífica de anticorpos em análises de imunofluorescência.
α-CD31 Anticorpos	BD Biosciences	550274	Anticorpos monoclonais de rato purificados contra camundongos, clone MEC 13.3.
Anticorpos secundários anti-rato de cabra	Thermo Fisher	A-11006	IgG anti-rato de cabra (cadeias pesadas e leves), adsorvidos cruzados, marcados com fluorescência com Alexa Fluor 488. Outras etiquetas fluorescentes também são possíveis.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Meio de montagem para citoquímica. MW ~ 31.000
Labovert	Leitz	Labovert	Microscópio de contraste de fase invertida equipado com uma objetiva de 4 x e 10 x para contagem de pares de somitos. Outros microscópios de contraste de fase (como os que são usados rotineiramente na cultura de tecidos) também são adequados.
M80	Estereomicroscópio M80 da Leica Microsystems		com faixa de zoom de 8 : 1 (produzindo uma ampliação entre 7,5 x e 60 x) para dissecção de embriões e alantóides.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	sistema de microscópio para histologia com iluminação LED. Usamos objetivas HCX PL FLUOTAR 5 x/0,15 e HC PL FLUOTAR 10 x/0,30. Outros microscópios equipados com contraste de fase e óptica de fluorescência podem ser usados para pontuar a fixação do alantóide.
Câmera digital	JVC	KY-F75U	3-CCD câmera de captura digital anexada ao microscópio LED DM4000B. Usamos o software Diskus (Hilgers) para operar o microscópio e a câmera.
Microscópio confocal	Leica Microsystems	SP5	Microscópio confocal para imagens de alta resolução do endotélio no plexo vascular de explantes alantóides. As imagens de imunofluorescência foram obtidas com uma objetiva de 40 x.

000664