Preparações de espalhamento de cromatina para a análise da progressão de oócitos de camundongo da prófase para a metáfase II

Resumo

Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.

Resumo

Técnicas de propagação de cromatina foram amplamente utilizadas para avaliar a localização dinâmica de várias proteínas durante a gametogênese, particularmente para a espermatogênese. Essas técnicas permitem para visualização dos padrões de localização de DNA e proteína durante eventos meióticos como cromossomos homólogos emparelhamento, synapsis e DNA de reparação. Enquanto alguns protocolos têm sido descritos na literatura, técnicas de propagação de cromatina geral usando oócitos mamíferos prófase são limitadas e difícil devido a hora de início da meiose em ovários fetais. Em comparação, espermatócitos prófase podem ser coletados de ratos machos juvenis com rendimentos mais elevados, sem a necessidade de microdissection. No entanto, é difícil obter uma população sincronizada pura de células em estágios específicos devido à heterogeneidade das populações meiótica e pós meiótica de células germinativas do testículo de jovens e adulto. Para fases posteriores da meiose, é vantajoso para avaliar oócitos passando por meiose I (MI) ou meiose II (MII), porque grupos de oócitos maduros podem ser colhidos em ratos fêmeas adultos e estimulados a retomar a meiose em cultura. Aqui, métodos para preparações de cromatina meiótica espalhar usando oócitos dissecado de fetal, neonatal e adultos ovários são descritos com demonstrações em vídeo de acompanhamento. Eventos de missegregation cromossomo em oócitos mamíferos são frequentes, particularmente durante MI. Estas técnicas podem ser usadas para avaliar e caracterizar os efeitos de mutações diferentes ou exposições ambientais durante várias fases da oogénese. Como existem diferenças distintas entre a ovogênese e espermatogênese, as técnicas descritas dentro são de valor inestimáveis para aumentar nossa compreensão da oogénese mamíferos e as características sexualmente dimórficas de cromossomo e proteína dinâmica durante a meiose .

Introdução

Durante a espermatogênese, grandes ondas semisíncronas de meiose células germinativas são uma reposta rápida e continuamente, no testículo no início da puberdade e ao longo da vida adulta¹. Em contraste com os machos, meiose em fêmeas é iniciada somente durante o desenvolvimento fetal. Após o nascimento, oócitos permanecem presos em um estágio de Dictióteno prolongada da prófase I com uma intacta vesícula germinal (GV; envelope nuclear) até a puberdade. No início da puberdade, um subconjunto de ovócitos ciclicamente são selecionados para sofrer o crescimento e maturação, marcando o início da retomada meiótica. Meiótica retomada em oócitos já crescidos manifesta-se pelo desaparecimento do GV em um processo conhecido como vesícula germinal avaria (GVBD). O oócito então sofre condensação cromossomo e segregação, seguido por extrusão de corpo polar. Oócitos tornar-se preso em cima de progressão para MII e são estimulados para completar a segunda e última divisão meiótica somente após a fertilização.

Fertilidade feminina é altamente dependente do sucesso da prófase meiótica eu progressão. Chave para isso é a formação de uma ligação física entre cromossomos homólogos, conhecido como o chiasmata, que é mediada pela reparação de quebras da cadeia dupla induzidas DNA (DSBs) através de de recombinação de cruzamento². Este processo ocorre dentro do contexto de um andaime ricos em proteínas dinâmico, conhecido como o complexo de synaptonemáticos (SC) que se forma entre os cromossomos homólogos para facilitar sua sinapse³. A SC é uma estrutura tripartida do zipper-como que consiste de dois elementos laterais paralelos conectados por proteínas da região central que detém homologs juntos ao longo de reparo de ADN em curso. Antes da sinapse, precursores dos elementos laterais, chamados de elementos de axiais, formam-se entre irmã cromátides irmãs. Synaptonemáticos complexo proteínas tais como SYCP2 e SYCP3 formam elementos axiais que colocalize para os eixos de coesão cromátide-irmã durante a prófase inicial. Estes mais tarde serve como ligação locais para a proteína de filamento transversal, SYCP1, o que facilita a montagem do elemento central e sinapse entre homologs alinhado⁴. Em oócitos de rato, synapsis completa é indicado pela presença de 20 completamente sobreposição de trechos de SYCP3 e SYCP1, que podem ser visualizados usando cromatina espalhar os preparativos. Sinapse é concluído com a entrada no subestágio paquíteno, segundo o qual os crossovers maduros que estão destinados a chiasmata forma entre homologs estão decorados com mutL dímeros de homólogo (MLH1/3) para promover sua transformação precisos^{5,6 , 7}. a manutenção estrutural dos complexos de cromossomos (SMC), incluindo cohesin, nà e o SMC5/6 complexos, são importantes para a regulação da dinâmica do cromossomo e estrutura em toda a meiose^{8,9, 10,11,12}. Coletivamente, esses eventos garantir bi-orientação correta dos cromossomos homólogos para opostas polos do eixo após a desmontagem do SC.

O ciclo celular meiótico é um poderoso modelo para examinar os papéis de várias proteínas na manutenção do genoma devido a indução programada e subsequente reparação de DNA DSBs. Além disso, a meiose mamíferos é também um modelo relevante para o estudo das alterações epigenéticas e imprinting genômico¹³. No entanto, é tecnicamente difícil de avaliar esses eventos durante a meiose feminina, que terá lugar nos ovários fetais e Neonatais em mamíferos (Figura 1). Prófase, que pode ser dividida em 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema e Dictióteno. Aqui, descrevemos como isolar e distinguir entre fetais e Neonatais ovários e testículos (Figura 2). Adaptado de métodos anteriormente descritos, este manuscrito também descreve um protocolo (etapa 1), com vídeo de demonstração para a preparação da prófase meiótica feminino eu cromatina espalha^14,15,16,17 . Quando acoplado com encontrava, como descrito nos passos 6-7, este protocolo permite análise microscópica detalhada da prófase eu eventos em oócitos.

A ovogênese é propenso a erros e eventos de missegregation do cromossomo durante a primeira divisão meiótica representam a fonte mais comum de doença genética na descendência^18,19. Este manuscrito (etapa 2 do protocolo), descrevemos um protocolo no qual oócitos maduros GV-encenado são extraídos aprontados ovários de camundongos fêmeas adultos. Sob condições de apoia, já crescidos oócitos submeter-se independente de hormônio luteinizante retomada da meiose após isolamento e cultura²⁰. Após retomada meiótica, oócitos progridem através da meiose, em seguida, prendam na metáfase II. Oócitos permanecem presos em metáfase II, a não ser fertilizado. Nas etapas 2 a 5, adaptamo-nos protocolos anteriormente relatados com vídeo de demonstração para descrever como coletar, cultura e preparar MI e MII oócitos por cromatina espalhar preparações²¹. Esta cromatina espalhando técnica permite encontrava clara de proteínas associadas com cromossomos. Além disso, esse protocolo também pode ser usado para distinguir entre cromossomos bivalentes e univalentes e ainda mais pode resolver a única irmã cromátides irmãs para facilitar a avaliação da ploidia de ovócitos. Portanto, além de revelar os padrões de localização de proteínas meióticas, esse protocolo também pode servir como uma ferramenta inestimável para elucidar as causas potenciais de missegregation do cromossomo durante MI e MII.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Johns Hopkins. Experimentos foram realizados em camundongos C57BL/6J de tipo selvagem.

1. colheita de ovários Fetal ou Neonatal e preparação da prófase cromatina se espalha

1. Para extrair os embriões em 14,5 – 19,5 dias post-coitum (dpc) sacrificar as fêmeas grávidas através do deslocamento cervical ou CO₂ asfixia, de acordo com as diretrizes IACUC.
   Nota: Para os ovários de 1 – 5 dia pós-natal, pule para a etapa 1.3. A Figura 1 resume as fases de prófase meiótica enriquecidas em diferentes idades embrionárias e pós-natal.
2. Abra a cavidade abdominopelvic usando uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Dissecar para fora o corno uterino materno, separar os embriões da placenta e transferir os embriões em 35mm placas de Petri contendo 3 mL de pré-aquecido 1x salino de tampão fosfato (PBS) a 37 ° C.
   Nota: Uma incubadora fliptop definir a 37 ° C pode ser usada para manter a temperatura. Além disso, um estágio de vidro temperatura regulada também pode ser usado para manter a temperatura durante a manipulação do ovário.
3. Com uma tesoura cirúrgica de 3,5 polegadas, sacrifica embriões ou filhotes através de decapitação de acordo com as diretrizes IACUC. Coloque embriões decapitados ou filhotes em PBS pré-aquecido antes da dissecação mais.
4. Dissecar um embrião ou filhote de cada vez em um prato de petri 35mm separado contendo 3 mL de PBS pré-aquecido a 37 ° C. Prossiga por corte ao longo da linha mediana ventral da parte posterior do embrião, ao longo da metade anterior abaixo os membros dianteiros e diretamente acima do-patas e cauda, conforme descrito na Figura 2A–B.
5. Abra o abdômen com uma tesoura cirúrgica de 3,5 polegadas. Usando pinças de ponta fina deslocar ou remover o fígado e loops de intestino, expondo os ovários em um prato de petri 35mm nova contendo 3 mL de PBS pré-aquecido a 37 ° C (consulte guia Figura 2B). Os ovários estão localizados imediatamente abaixo e atrás do rim em direção à parede posterior da cavidade peritoneal (Fig. 2B-C). Um guia para a diferenciação entre machos e fêmeas gônadas é fornecido na Figura 2D.
   Nota: Para condições ideais, rapidamente disse para fora dos ovários após a fêmea grávida é sacrificada.
6. Remover os dois ovários de cada feto feminino usando um par de pinças de ponta fina sob um escopo de dissecação e coloque em vidros de um relógio ou poços separados de um poço multi placa contendo 0,5 a 1,0 mL de PBS pré-aquecido e mantêm a 37 ° C.
7. Coloque cada par de ovários em 0,5 mL hipo-solução tampão (17mm citrato trissódico dihidratado, sacarose 50 mM, 5 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, inibidor de protease, pH 8,2) em um vidro de relógio limpo ou um pequeno poço de uma placa de 9-bem, certificando-se de imergir o comp de ovários activaçã. Incube durante pelo menos 15 minutos, mas não mais de 30 min.
   Nota: Fazer hipo-solução tampão fresco e usar até 2 horas após a adição de TDT.
8. Durante a incubação, usando uma barreira hidrofóbica PAP caneta, desenhe dois quadrados de² 22 x 22 mm em um vidro limpo 25 x 75 mm², 1mm espessura de microscópio como mostrado na Figura 3A.
   Nota: Os Slides podem ser preparados antes do tempo.
9. Pipetar 45 a 50 µ l de sacarose 100 mM numa lâmina limpa e um par de ovários de transferência para a gota.
10. Usando as extremidades afiadas de duas agulhas 27 G, arreliar os ovários separados para liberar as células para a solução de sacarose. Com a pinça, Retire pedaços grandes de ovário e pipetar cuidadosamente a solução de sacarose para dispersar as células.
11. Lugar de 40 µ l de solução fixador (1% paraformaldeído (PFA), 0,2% de detergente (veja Tabela de materiais), pH 9,2) em cada quadrado do slide preparado. Com uma ponta de pipeta 200 µ l, espalhe a solução fixador uniformemente sobre a superfície do slide.
12. Pipete 20 µ l da mistura de sacarose para cada Praça do slide contendo o fixador.
    Observação: Isso equivale a usar um par de ovários por slide.
13. Incube os slides em uma câmara fechada e úmido durante a noite em temperatura ambiente.
    Nota: A incubação durante a noite pode variar em torno de (12-15 hrs) à temperatura ambiente.
14. Abra a tampa da câmara e permitir que os slides secar completamente.
15. Lave os slides em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de solução de PBS agente umectante 0,4% (ver Tabela de materiais) por 2 min, secar ao ar e proceder ao protocolo encontrava (etapa 6).
    Nota: Pode ser possível armazenar as lâminas a-80 ° C para uso posterior, mas isso varia dependendo da proteína de interesse. Para obter melhores resultados imediatamente no protocolo encontrava (etapa 6).

2. metáfase eu oócito coleção

1. Para maximizar o número de folículos antrais isoladas de cada mouse, intraperitonealmente injete camundongos fêmeas virgens sexualmente maduros com 5 UI de gonadotrofina de soro de égua grávida (PMSG, também conhecido como equinos gonadotrofina coriônica (eCG)).
   Nota: Para o rendimento ideal do oócito, ratos devem ser 1 a 3 meses de idade, como o número de oócitos colhidos irá diminuir com a idade. Para preparar a PMSG, dissolver garrafa de 5.000 UI em 100 mL de PBS estéril (5ml de U/0.1) loja alíquotas de uso único de 600 µ l a-20 ° C.
2. Depois de 44 – 48 h, prepare o suporte de coleção, mínimo essencial médio alfa (MEMα) suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS) e 3 mg/mL albumina de soro bovino (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Esterilize a mídia através de um filtro de poro de 0,2 µm. Decante a 2,5 mL de MEMα/BSA/FBS médio em um prato de vidro por rato e aquecido a 37 ° C numa incubadora 5% CO₂ .
   Nota: Outros coleção e meios de cultura que estão comercialmente disponíveis (M2 e M16) também são comumente usados.
   Atenção: Recomendamos retirar pratos de cultura 5% CO₂ incubadora uma em uma hora de duração limitada minimizar a exposição de ar ambiente durante as etapas de manipulação.
3. Sacrifica os ratos através do deslocamento cervical ou CO₂ asfixia, de acordo com as diretrizes IACUC.
4. Abra a cavidade abdominopelvic com uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Usando fórceps, deslocar os intestinos na direcção da cabeça do rato. Localize cada corno uterino; os ovários são apresentar proximal para a caixa torácica. Segure o oviduto com pinça fina e cortar a gordura superior para o ovário usando tesouras de dissecação (Figura 4). Continue a segurar o oviduto e com outro conjunto de pinças bem libertar o ovário da bursa e coloque no prato de coleção contendo meio de MEMα/BSA/FBS.
   Nota: Como na etapa 1, é imperativo a manter os ovários a 37 ° C e em 5% CO₂. Uma incubadora de fliptop ligada a 5% CO₂ mistura pode ser usada para permitir a manutenção ideal de temperatura e os níveis de CO₂ . Além disso, um estágio de vidro temperatura regulada também deve ser usado para manter a temperatura durante a manipulação do oócito.
5. Utilizando uma seringa de 1 mL com agulha de calibre 27 (ou tamanho similar), liberar complexos de cumulus oócito por punção manualmente os grandes folículos antrais.
6. Observando-se através de um microscópio de dissecação, recolha ovócitos GV-encenado utilizando uma pipeta de vidro boca-operado ou capilar ou uma manual micrômetro-seringa (Figura 5). Apenas recolha ovócitos que são liberados de folículos antrais. Ovócitos GV tem um diâmetro de aproximadamente 90 µm. ovócitos GV pode ser rodeados por 2-3 camadas de células da granulosa e ter um diâmetro total de cerca de 200 µm.
7. Cultura de oócitos em um vidro de relógio limpo ou uma placa de 9 contendo meio de FBS/MEMα/BSA para 6 h chegar a metáfase eu a 37 ° C numa incubadora 5% CO₂ .
8. Prossiga para a etapa 4.

3. metáfase II (MII) oócito coleção

1. Para maximizar os oócitos isolados de cada mouse, intraperitonealmente injete camundongos fêmeas virgens sexualmente maduros com 5 IU de PMSG. Depois de 44 – 48 h, injete intraperitonealmente com 5 UI de gonadotrofina coriônica humana (hCG).
   Nota: Para o rendimento ideal do oócito, ratos devem ser 1 a 3 meses de idade, como o número de oócitos colhidos irá diminuir com a idade. Para preparar o hCG, dissolver uma garrafa de 10.000 U em 200 mL de PBS (5ml de U/0.1). Armazenar em alíquotas de uso único de 600 µ l a-20 ° C.
2. Após 12-14 hrs, prepare o suporte de coleção de MEMα/BSA/FBS, conforme descrito no passo 2.2, acima.
3. Sacrifica os ratos através do deslocamento cervical ou CO₂ asfixia, de acordo com as diretrizes IACUC.
4. Abra a cavidade abdominopelvic com uma tesoura esterilizada, fazendo uma abertura em forma de V. Usando fórceps, deslocar os intestinos na direcção da cabeça do rato. Localize cada corno uterino, os ovários estão presentes proximal para a caixa torácica. Segure o oviduto com pinça fina e cortar a gordura superior para o ovário usando tesouras de dissecação (Figura 4). Em seguida, remover o ovário e o oviduto e coloque no prato de coleção contendo meio de MEMα/BSA/FBS.
   Nota: Como nas etapas 1 e 2, é imperativo a manter os ovários a 37 ° C e em 5% CO₂. Uma incubadora de fliptop ligada a 5% CO₂ mistura pode ser usada para permitir a manutenção ideal de temperatura e os níveis de CO₂ . Além disso, um estágio de vidro temperatura regulada também deve ser usado para manter a temperatura durante a manipulação do oócito.
5. Usando uma seringa de 1 mL com um 27 G (ou tamanho similar) ou fórceps em ponto, abrir um buraco da ampola do oviduto para liberar os oócitos MII.
   Nota: Tenha cuidado para não danificar os oócitos na ampola. A ampola aparecerá inchadas e translúcido, tal que os oócitos são visíveis (Figura 4).
6. Colheita MII oócitos da ampola do oviduto para uma nova placa com meio de coleção usando uma pipeta de vidro boca-operado ou capilar ou uma manual micrômetro-seringa (Figura 5).
7. Prossiga para a etapa 4.

4. oócito desnudamento e remoção da Zona pelúcida

1. Prepare 300 UI/mL de hialuronidase em meio MEMα suplementado com 3 mg/mL BSA para DDE oócitos de em torno de células do cumulus (2.5 mL/mouse) em um vidro de relógio e manter a 37 ° C, 5% de CO₂.
   Nota: Eficácia de hialuronidase diminui acentuadamente após 1h de preparação. Para oócitos MII, hialuronidase tratamento não é necessário.
2. Expor a complexos de célula cumulus-oócito a 300 UI/mL de hialuronidase em MEMα/BSA para 3 min para DDE oócitos de em torno de células do cumulus.
   Cuidado: Não exceda 3 min exposição a hialuronidase, que danificará os ovócitos.
3. Para lavar os oócitos, transferência de oócitos para um fresco aquecido prato médio MEMα/BSA. Usando uma pipeta de vidro pequena boca-operado ou capilar (um pouco maior que o diâmetro do ovócito, que é aproximadamente 90 µm), pipetar os complexos acima e para baixo para separar completamente as células do cumulus. Permitir que os oócitos recuperar na incubadora, enquanto se prepara para a próxima etapa.
4. Aquecer a solução do ácido Tyrode, MEMα/BSA e mídia do Waymouth a 37 ° C (500 µ l/mouse). Lugar de 300 µ l em cada poço de placas de vidro 9-bem pequeno.
5. Para remover a zona pelúcida (ZP) transferi oócitos de 5 – 10 para solução de Tyrode. Expor os oócitos para apenas 30-45 s para a solução.
   Nota: Muito pouca exposição à solução não irá remover o ZP completamente, que impedirá os oócitos estourando e cromossomos de espalhar. Demasiada exposição irá danificar e matar o oócito. Assistindo o dissolver ZP sob o microscópio de dissecação pode auxiliar na otimização do tempo de exposição.
   Cuidado: Usando a solução de Tyrode fresco é fundamental, como sua função declina com a idade. Uso um bem fresco de solução de Tyrode para cada grupo de oócitos tratados para garantir a digestão uniforme da ZP.
6. Imediatamente após a remoção de ZP, lave os oócitos pela transferência para aquecido médio MEMα/BSA/FBS. Repita essa etapa de lavagem.
   Nota: Tenha cuidado ao transferir, como oócitos facilmente vão ficar juntos e a pipeta de vidro ou remoção seguinte capilar da ZP. Pre-molhando a pipeta de vidro ou capilar em meio do Waymouth minimizará oócitos coladas.
7. Transferência e permitir que os oócitos recuperar durante 30 minutos no meio do Waymouth a 37 ° C numa incubadora 5% CO₂ .
8. Prossiga para a etapa 5.

5. MI e MII oócito cromatina Spreads

1. Usando uma caneta PAP, desenhe um retângulo de² de 11 x 44 mm sobre a lâmina de vidro, como mostrado na figura 6A.
2. Revestir o slide com uma fina camada de fixador (1% paraformaldeído, 0,2% Triton-X100 em H₂O, pH 9,2) por Pipetar 100 µ l de fixador para o slide e balançando o slide e para trás. Toque o slide para se livrar do excesso fixador.
3. Buscar entre 5-10 ovócitos com uma agulha de pipeta de boca pequena com como pouco mídia quanto possível e arraste a agulha em linha através do slide fixador-revestido enquanto depositando os oócitos de 1 cm acima do slide na solução de fixador. Execute esta etapa usando um microscópio de dissecação para garantir que os oócitos foram depositados e que eles tem estourado.
   Nota: Os oócitos devem estourar imediatamente no slide. A altura em que os oócitos são depositados impacto o grau da cromatina se espalhando. Ver resultados representativos na Figura 6 para mais detalhes.
4. Incube à temperatura ambiente em uma câmara fechada umidificada durante a noite para permitir que a cromatina aderir.
5. Permitir que os slides secar completamente e enxágue slides em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de 0,4% agente umectante-H₂O, pH 8.0.
6. Prossiga para a etapa 6.

6. encontrava

1. Prepare o tampão de diluição de anticorpo (ADB) descrito na tabela 1.
2. Preparar duas Coplin frascos contendo 50 mL de solução-tampão (WB) lavagem (10% ADB diluído em PBS) e uma jarra de Coplin contendo solução de detergente WB e 0,05% 50 mL (por exemplo, adicionar 250 µ l de 10% de detergente para 50ml WB).
3. Lave os slides que foram preparados em seção 1 e 5 do presente protocolo por 10 min em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de WB.
   Atenção: Não seque os slides em qualquer ponto durante a encontrava.
4. Lave os slides para 10 min no Coplin frasco contendo 50 mL WB e 0,05% de solução de detergente. Em seguida, lave os slides no restante Coplin frasco contendo 50 mL de solução de WB por 10 min.
5. Toque fora slide excesso de líquido e a tampa com 100 µ l de anticorpos primários selecionados diluído em ADB. Incube a 4 ° C durante a noite em uma câmara fechada e úmida.
   Nota: A incubação pode ser encurtada para 2 a 3 horas a 37 ° C. Utilize volumes menores de anticorpo (por exemplo, 50 µ l), cobrindo o slide com uma lamela ou parafilm.
6. Lave os slides em uma jarra de Coplin contendo 50 mL de solução de 0,2% agente umectante-PBS, pH 8.0.
7. Repita as etapas de 6,2 a 6,5.
8. Toque fora slide excesso de líquido e a tampa com 100 µ l de anticorpos secundários selecionados diluído em ADB. Incubar 1 a 2 horas a 37 ° C em uma câmara fechada e úmida.
9. Lave slides 2 vezes por 10 min em Coplin frascos contendo 50 mL de solução de 0,2% agente umectante-PBS, pH 8.0.
10. Lave slides 2 vezes por 5 min em Coplin frascos contendo 50 mL de solução de 0,2% agente umectante-H₂O, pH 8.0.

7. montagem slides

1. Para prófase cromatina se espalha preparada no passo 2, adicionar 100 µ l de meio de montagem, contendo 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Para MI e MII cromatina se espalha preparado no passo 5, adicionar 50 µ l de meio de montagem contendo DAPI (1.5µg / mL). Delicadamente borre fora excesso de líquido.
2. Coloque uma lamela de 22 x 60 mm na parte superior e selar com esmaltes claros. Armazenar em uma caixa de slides em 4 ° C ou a-20 ° C até avaliação através de microscopia de fluorescência.
   Nota: Toque levemente no deslizamento da tampa para livrar-se de meio de montagem em excesso antes de vedação com esmalte.

Resultados

Descrevemos duas técnicas para visualizar e avaliar os cromossomos meióticos em oócitos. A primeira técnica é servida para avaliar a progressão da prófase em ovários embrionários e Neonatais. Prófase cromatina propagação preparações são incrivelmente valiosas para a visualização de numerosos processos dinâmicos durante a meiose, incluindo cromossomo emparelhamento, synapsis e desynapsis, recombinação homóloga e epigenético cromossomo remodelação. Aqui, temos demonstrado a utilidade desse ...

Discussão

Preparações de propagação de cromatina permitem aos pesquisadores estudar cronologicamente fêmea mamífera meiose e a localização dinâmica das proteínas envolvidas. Os spreads de cromatina embrionário e neonatal permitem a análise detalhada dos eventos durante a prófase meiótica. Metáfase I e metáfase II propagações de cromatina podem ser usadas para distinguir a única irmã cromátides irmãs de emparelhado irmãs e cromossomos homólogos emparelhados, bem como avaliar a ploidia. Em comparação, o protocolo descrito aqui pode ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10X Phosphate tamponed salina (PBS) pH 7.4	Qualidade Biológica	119-069-161
60 mm x 15 mm placas de Petri	Denville	T1106
35mm x 12mm		Pinças finas VWR
		300-050
Tesoura de micro dissecação	Ted Pella	1340
Dissecando  tesoura, ponta afiada, 41/2"	VWR	82027-578
Vidro de relógio quadrado 1 5/8	Carolina Biological Supply Company	742300	Autoclave antes de cada uso
Sacarose	Sigma	S8501
Citrato Trissódico Di-hidratado	Sigma	S1804
EDTA	Sigma	E6758
Base Trizma	Sigma	T1503
1,4-Ditiotreitol (DTT)	Sigma	646563	Adicionar ao tampão hipotônico imediatamente antes do uso
50x Inibidor de Protease	Roche	11873580001	Adicionar ao tampão hipotônico imediatamente antes do uso
Seringa de turberculina com agulha (1cc, 27 G x 1/2 pol)	Becton, Dickinson (BD)	309623
Corrediças de vidro ultra frost com selo dourado (25X75mm, 1mm de espessura)	Thermo	3063-002
Caneta Super PAP, grande (bloqueador de líquidos)	Microscopia Eletrônica Ciências (EMS)	71310
16% Paraformaldeído aquoso	Microscopia Eletrônica Ciências (EMS)	15710
Triton X-100	Sigma	T8787	Detergente no manuscrito
Câmara de umidade de manchas imunológicas	Evergreen	240-9020-Z10
Frascos Coplin	Fisher	08-815
Photo-flo 200	Electron Microscopy Sciences (EMS)	74257	Agente umectante em manuscrito
Gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG)	Sigma	G4877	Armazenar alíquotas a -20C
Gonadotrofina coriônica humana (HCG)	Sigma	C0434	Armazenar alíquotas a -20C
Placas de ponto PYREX com nove cavidades côncavas	Fisher	13-748B	Autoclave antes de cada uso
Capilar de vidro	Fisher	22260943	Para fazer agulhas de coleta de oócitos
Marca Parafilm M	Sigma	BR701501	Para fazer agulhas de coleta de oócitos
Tubo de borracha de látex (3,2 mm de diâmetro interno x 6,4 mm de diâmetro externo)	Fisher	14-178-5B	Para fazer agulhas
de coleta de oócitosTubo de borracha de látex (6,4 mm de diâmetro interno x 11,1 mm de diâmetro externo)	Fisher	14-178-5D	Para fazer agulhas de coleta de oócitos
Porta-objetivas de borracha de silicone flexível, bocal de plástico rígido e 15 polegadas de tubo de látex	Sigma	A5177-5EA	Para fazer agulhas de coleta de oócitos
Cabeça micrométrica Mitutoyo	Mituoyo	150-208	Para fazer agulhas de coleta de oócitos
Seringa 5 mL	BD Biosciences	309646	Para fazer agulhas de coleta de oócitos
Filtro de seringa 0.45 μ m filtro	Corning	431220	Para fazer agulhas de coleta de oócitos
Pipeta Pasteur de vidro 5 3/4 "	Fisher	13-678-6A	Para fazer agulhas de coleta de oócitos
83 x 0,5 mm ponta de pipeta	Denville	P3080	Para fazer agulhas de coleta de oócitos
α-MEM	Invitrogen	11415049
mídia de Waymouth	Technologies
Soro bovino fetal	Fisher	A3160602
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma	A3311	Para meios de cultura de oócitos
500ml unidades de filtro 0.22um	Denville	F5227
Hialuronidase	Sigma	H3506
Tyrode ' s solução	Sigma	T1788	Armazene alíquotas a -20C
Soro de cavalo	Sigma	H-1270	Para ADB/tampão de lavagem
Albumina de soro bovino (BSA)	Sigma	A1470	Para ADB/tampão de lavagem
Meio de montagem anti-desbotamento VECTASHIELD com DAPI	Lâminas de cobertura de microscópio Vector Labs	H-1200
(22mmx60mm)	Fisher	12-544-G
Esmalte transparente	Amazon	N/A
Nome	Empresa	Número do Catálogo	Comentários
Microscópios
SteREO Discovery.V8	Zeiss	495015-0001-000
Observer Z1	Zeiss
Nome	Empresa<	strong>Número de catálogo	Comentários
Anticorpos Primários
Mouse anti-MLH1	Life Technologies	MA5-15431	Fator de diluição- 1:100
Coelho anti-SYCP1	Life Technologies	PA1-16763	Fator de diluição - 1:1000
Cabra anti-SCP3	Santa Cruz	sc-20845	Fator de diluição - 1:50
Proteína anticentrômero humana	Anticorpos incorporados	15-235	Fator de diluição - 1:100
Coelho anti- TOPOII	Abcam	ab109524	Fator de diluição - 1:100
Camundongo anti-histona H4 (di metil K20, tri metil K20)	Abcam	ab78517	Fator de diluição - 1:500
Coelho anti-Rec8	Cortesia da Dra. Karen Schindler	N/A	Fator de diluição - 1:10.000
Nome	Company	Número de catálogo	Comentários
Anticorpos secundários
Burro anti-cabra IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugado	Thermo-Fisher Scientific	A-11057	Fator de diluição - 1:500
Burro anti-rato IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugado	Thermo-Fisher Scientific	A-21202	Fator de diluição - 1:500
Burro anti-coelho IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugado	Thermo-Fisher Scientific	A-31573	Fator de diluição - 1:500
IgG anti-rato de cabra (H + L) Alexa Fluor 568 conjugado	Thermo-Fisher Scientific	A-11004	Fator de diluição - 1:500
IgG anti-humano de cabra (H + L) Anticorpo secundário de adsorção cruzada, Alexa Fluor 488	Thermo-Fisher Scientific	A-11013	Fator de diluição - 1:500
IgG anti-coelho de cabra (H + L) Alexa Fluor 568 conjugado	Thermo-Fisher Scientific	A-11011	Fator de diluição - 1:500