Este protocolo descreve o uso de um dispositivo personalizável microfluidic automatizado para visualizar a formação de biofilmes de Candida albicans sob condições fisiológicas do hospedeiro.
Artigo de método
Este protocolo descreve o uso de um dispositivo personalizável microfluidic automatizado para visualizar a formação de biofilmes de Candida albicans sob condições fisiológicas do hospedeiro.
Candida albicans é o patógeno mais comum fúngico dos seres humanos, causando cerca de 15% dos casos de infecção hospitalar. Um atributo de grande virulência de c. albicans é sua capacidade de forma de biofilmes, comunidades estruturadas de células anexadas às superfícies bióticas e abióticas. Biofilmes de c. albicans podem formar sobre os tecidos do hospedeiro, tais como camadas da mucosa e em dispositivos médicos, tais como cateteres, marcapassos, próteses e próteses conjuntas. Biofilmes representam desafios clínicos significativos porque eles são altamente resistentes a perturbações físicas e químicas e podem atuar como reservatórios para semente infecções disseminadas. Vários ensaios de em vitro têm sido utilizados para estudar a formação de biofilmes de c. albicans , tais como ensaios de placa de microtitulação, medições de peso seco, ensaios de viabilidade celular e microscopia confocal de varredura do laser. Todos estes ensaios são ensaios de único ponto de extremidade, onde a formação de biofilme é avaliada em um ponto específico de tempo. Aqui, descrevemos um protocolo para estudar a formação de biofilme em tempo real usando um dispositivo automatizado microfluidic sob condições de fluxo laminar. Este método permite a observação da formação de biofilmes como o biofilme se desenvolve ao longo do tempo, usando condições personalizáveis que imitam os do hospedeiro, tais como aqueles encontrados em cateteres vasculares. Este protocolo pode ser usado para avaliar os defeitos de biofilme de mutantes genéticos, bem como os efeitos inibitórios dos agentes antimicrobianos no desenvolvimento do biofilme em tempo real.
Candida albicans é um comensal membro a microbiota humana, no entanto, também é um patógeno oportunista, capaz de causar infecções fúngicas superficiais e graves1,2. Uma característica de maior virulência de c. albicans é sua habilidade de forma resiliente e biofilmes resistentes aos medicamentos, comunidades de células aderiram a uma superfície e colocados em uma matriz extracelular material1,3. Biofilmes de c. albicans são altamente estruturados, contendo várias camadas de vários tipos de células (rodada brotamento levedura....
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1. preparação da cultura de pilha fúngicas
Nota: Cultura de células de conduta trabalhar (ou seja, abertura criogênicos estoque tubos, tubos de cultura celular e frascos) dentro de uma armário de biossegurança. Ligue h de lâmpada germicida pelo menos 1 de ultravioleta (UV) do armário antes do trabalho e desligar a lâmpada UV enquanto trabalhando ativamente no armário. Use luvas, óculos de segurança e equipamento de protecção adequado e descontaminar a superfície da bancada e pipetas com etanol a 70% antes do início do experimento. Recomenda-se uso de dicas de filtro estéril e familiaridade com técnicas básicas de microbiológicas assépticas.
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Realizamos o ensaio biofilme microfluidic descrito aqui usando um selvagem-tipo tensão de c. albicans em condições dois media (mídia RPMI-1640 e aranha), a estirpe selvagem-tipo, na presença do conhecido antifúngico anfotericina B (16 µ g/mL) em RPMI, e duas cepas mutantes anteriormente relataram para ter defeitos na formação de biofilme (bcr1Δ/Δ e efg1 Δ/Δ) na mídia de aranha.
Vídeo 1 mostra o desenvo.......
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O ensaio de biofilme microfluidic personalizável descrito aqui permite a visualização da formação de biofilme em tempo real em um nível de célula única quando exposto a um fluxo laminar de taxa fixa e a temperatura constante. Ele fornece um meio poderoso para estudar o desenvolvimento de biofilmes em estirpes de tipo selvagem e mutantes, e observaram os efeitos de tratamentos de agente antimicrobiano em biofilmes nas condições que imitam condições fisiológicas em situações clínicas. Ao contrário da maioria em vitro
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Clarissa J. Nobile é dos fundadores da BioSynesis, Inc., uma empresa de desenvolvimento de inibidores e diagnósticos de biofilmes de c. albicans .
Agradecemos a todos os membros do laboratório Nobile para discussões úteis sobre ensaios de biofilme. Este estudo foi suportado pelos institutos nacionais de saúde (NIH) grant R21 AI125801 (C.J.N.). DLR foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da Universidade de California Institute para o México e os Estados Unidos (UC-MEXUS) e o Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BioFlux 1000z | Fluxion | Dispositivo microfluídico automatizado para análise de células vivas | |
| Placa de 48 poços 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Placa microfluídica |
| Software de montagem | Fluxion | Versão 7.8.4.0 | Software de análise de visualização |
| Software ImageJ NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| Extrato de levedura | Critério | C7341 | |
| Bacto Peptona | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glicose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Fosfato de Potássio Monobásico | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Critério de Caldo de Nutrientes | C6471 | ||
| Difco D-Manitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Critério de | Ágar | C5001 | |
| Anfotericina B | Corning | 30-003-CF | |
| Alças de Inoculação Estéril | VWR | 30002-094 | |
| Placas de Petri com Tampa Transparente | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Cuvetes descartáveis | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Papel para lentes | VWR | 52846-001 | |
| Microplaca e espectrofotômetro de cubeta | BioTek | Incubadora de agitação de EPOCH2TC | |
| Eppendorf | M12820004 |
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