Um método melhorado para coleta de líquido cefalorraquidiano de ratos anestesiados

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica melhorada para a coleção abundante de líquido cerebrospinal (CSF), sem contaminação de sangue. Com a maior coleção de amostra e pureza, mais análises podem ser executadas usando o CSF para aprofundar nossa compreensão das doenças que afetam o cérebro e a medula espinhal.

Resumo

O líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido corporal valioso para análise na pesquisa da neurociência. É um dos fluidos em contato mais próximo com o sistema nervoso central e assim, pode ser usado para analisar o estado doente do cérebro ou da medula espinhal sem acessar diretamente esses tecidos. No entanto, em ratos, é difícil de obter da cisterna magna devido a sua proximidade de vasos sanguíneos, que muitas vezes contaminar amostras. A área para a coleção do CSF em ratos também é difícil de dissecar a e muitas vezes apenas pequenas amostras são obtidas (máximo de 5 a 7 µ l ou menos). Este protocolo descreve, em detalhes, uma técnica que melhora na atuais métodos de coleção para minimizar a contaminação do sangue e permitir a coleção abundante de LCR (em média que 10-15 µ l podem ser coletados). Esta técnica pode ser usada com outros métodos de dissecação na recolha de tecidos de ratos, como isso não afeta quaisquer tecidos durante a extração do CSF. Assim, o cérebro e a medula espinhal não são afetados com esta técnica e permanecem intactos. Com a maior coleção de amostra do CSF e pureza, mais análises podem ser usadas com esta pesquisa de neurociência do fluido para mais ajuda e entendem melhor as doenças que afetam o cérebro e a medula espinhal.

Introdução

O CSF é um fluido corporal valioso para análise na pesquisa da neurociência. O CSF é feito principalmente do plasma sanguíneo, que contém poucas células (sem células vermelhas do sangue e apenas algumas células brancas do sangue) e é quase livre de proteína. É um dos fluidos em contato próximo com o sistema nervoso central (SNC) e pode passar muitos eletrólitos para fora do cérebro e da medula espinhal para o sistema periférico. Em humanos, CSF amostras podem ser coletadas para auxiliar no diagnóstico de doenças ou para fins de pesquisa em ensaios clínicos, como uma punção (ou punção lombar) é um procedimento invasivo, menor: o fluido CSF pode refletir as alterações no SNC sem ter que acessar diretamente estas tecidos. Assim, nos últimos anos, para fins de pesquisa, na clínica, amostras de CSF foram obtidas de pacientes de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer e outras demências^1,2,3. Existem muitos ensaios de biomarcador que foram desenvolvidos usando amostras do CSF para potencialmente auxiliar no diagnóstico de doenças na clínica^2,3. No entanto, existe muito debate sobre a fiabilidade destes ensaios para produzir resultados consistentes, sensíveis para diagnosticar especificamente doença^4,5. Então, há uma grande necessidade para o desenvolvimento de melhores ensaios e alvos, que podem ser encontrados no CSF, para auxiliar na produção de uma norma técnica para diagnosticar doenças neurodegenerativas com maior sensibilidade e especificidade. Devido a importância potencial das amostras de CSF humanas na doença, a coleção de LCR de roedores em pesquisas de Neurociências também é de interesse.

Ratos são animais importantes em pesquisas biológicas e médicas e permitam o teste de potenciais compostos terapêuticos e estudos de prova de conceito antes de testes clínicos em humanos. No entanto, em camundongos é difícil obter amostras CSF devido a sua proximidade ao cérebro de um animal pequeno, como o método usual de coleção do CSF em camundongos é obtê-la através da cisterna magna, uma abertura entre o cerebelo e a superfície dorsal da medulla oblongata. Isso faz com que a dificuldade na coleta de amostras de CSF nesta área é difícil de dissecar a e na proximidade de vasos sanguíneos, aumentando o risco de contaminação das células do sangue. Devido a essas dificuldades, a maioria dos pesquisadores só podem obter uma pequena quantidade de LCR para análise (geralmente indicado como 5 a 7 µ l) e a contaminação das amostras do CSF por pilhas de sangue é uma preocupação primordial para análises^{6,7,8 , 9}. contaminação de sangue pode obscurecer os resultados e não realmente refletem o estado do SNC. Além disso, amostra limitada coletada pode afetar a pesquisa como a quantidade habitual coletada de ratos é suficiente para apenas uma medição (em duplicado ou triplicado) utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Assim, amostras de CSF são geralmente agrupadas de vários mouses para ter suficiente amostra para executar vários ensaios. Desenvolver um protocolo para a abundante, coleção incontaminada de LCR de ratos é muito desejada e será benéfica na melhoria da investigação neurociência usando roedores.

Neste protocolo, uma técnica para a abundante (uma média de 10-15 µ l) coleção de LCR de ratos anestesiados é descrita em detalhes e melhora em um método atualmente conhecido da coleção do CSF para minimizar a contaminação do sangue¹⁰. Um protocolo robusto para coleção CSF ajudarão no desenvolvimento dos ensaios baseados em CSF biomarcador, que poderia ser usado para auxiliar no diagnóstico de doenças, bem como melhorar a pesquisa para os mecanismos subjacentes a doenças que afectam o CNS.

Protocolo

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com as políticas da sociedade de neurociência (EUA) e comissões de ética de Fudan University (Shanghai, China). Este procedimento é para uma cirurgia não-sobrevivência.

1. instalação de aparelhos de coleção do CSF

1. Puxe o vidro capilar (diâmetro interno de 0,75 mm, diâmetro externo 1,0 mm) usando um extrator de micropipeta (conforme mostrado no Liu et al . ¹⁰; capilar afiada é mostrado na Figura 1).
2. Lugar um capilar no suporte do capilar de vidro afiado firmemente montado em um micromanipulador (figura 1A).
3. Quebrar a ponta do capilar afiado com pinça reta sob um microscópio de dissecação, para que o diâmetro interno da ponta quebrada é sobre 10-20 µm (Figura 1).
4. Anexar um tubo fino e uma seringa para a outra extremidade do titular do capilar e conectar a seringa e o tubo fino com uma válvula de três vias.
5. Deslocar a válvula de três vias para abrir e mergulhar a seringa para soprar ar da seringa através da tubulação para o capilar de expulsar todos os contaminadores e criar pressão positiva no tubo capilar de vidro.
6. Repita isso algumas vezes por dis-ligação e re-conectar a seringa para a válvula de três vias e elaborar a seringa ~ 100-200 µ l antes da última re-conexão da seringa com a válvula de três vias (figura 1B).
7. Mova o micromanipulador com o capilar de vidro para o lado para evitar danos durante a dissecção do mouse.

Figura 1. Microscópio, micromanipulador e instalação capilar. (A) microscópio e micromanipulador com capilar anexado setup, bem como uma imagem mais perto de (B) a seringa conectada e a válvula de três vias para abrir (mostrado aqui) ou fechar a tubulação e (C) uma ininterrupta (direita) e quebrado (à esquerda) ponta capilar pronta para coleta do CSF. Uma vez quebrado, a ponta do capilar deve ter um diâmetro interno de 0,75 mm, diâmetro externo de 1,0 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Mouse dissecação

1. Anestesia o mouse.
   Nota: para este protocolo, C57BL/6 e amiloide precursora da proteína/presenilina 1 (APP/PS1) transgénicos (modelo do rato da doença de Alzheimer) ratos foram utilizados e anestesiados com 4% hidrato de cloral (em dH₂0) em 10 µ l/g do peso do mouse via intraperitoneal injeção.
2. Quando totalmente anestesiados, certifique-se de que o mouse é adequadamente anestesiado. A resposta de retirada aos pés pitada, ligeiramente estendendo membros posteriores e beliscar os dedos e olhando para uma resposta de retirada, é executada para garantir a adequada anestesia. Verificar por beliscar todos os quatro membros; Se não houver nenhuma reação o mouse corretamente é anestesiado. Cortar e aparar o cabelo na parte de trás da cabeça do mouse acima dos olhos, entre os ouvidos para a parte inferior do pescoço com uma tesoura de dissecação (Figura 2A). Alternativamente, tosquiadeiras ou creme depilatório pode ser usado para ajudar na remoção de pelos.
3. Fixar a cabeça do rato usando um adaptador para mouse (parte de trás da cabeça virada para cima com o nariz apontado para baixo ~ 45 °, Figura 2A). Corrigir barras de orelha entre as orelhas e os olhos do mouse e aperte. Verifique se a cabeça não pode se mover e está segura firmemente o adaptador empurrando suavemente para baixo para a cabeça do rato.
4. Verifique novamente a resposta de retirada para toe pitada antes de fazer a incisão cirúrgica e regularmente posteriormente para garantir o plano cirúrgico da anestesia. Visualmente, observe qualquer alteração na taxa respiratória durante o procedimento para indicar alterações nos planos da anestesia. Uma técnica limpa, não assépticas, pode ser usada para esta cirurgia não-sobrevivência curta. Usando uma tesoura e pinça curvada, corte a pele e a primeira camada do músculo até a base do crânio é exposta com apenas uma fina camada de músculo.
   Nota: Corte através da pele de rato em toda a volta do pescoço e em seguida, corte a pele para baixo no meio do crânio entre as orelhas e os olhos do rato. Pele e tecido podem então ser puxados distante e fora da área a cisterna magna.
5. Enquanto a visualização através do microscópio de dissecação, cuidadosamente dissecar fora o último finas camadas de músculo sobre a base do crânio usando fórceps e mover estas camadas de músculo para o lado e fora da área de interesse. Se lá está sangrando, use cotonetes para remover e ajudar a parar o sangramento.
6. Uma vez que a dura-máter sobre a cisterna magna é exposta (forma triangular com geralmente 1-2 grandes vasos sanguíneos que atravessa a área; ambos os lados de ou entre os vasos sanguíneos é ideal para inserção capilar e coleção de CSF, Figura 2B), use um úmido cotonete para limpar a membrana e em seguida, use um cotonete seco para secar a área.

Figura 2. Configuração de mouse e dissecação com imagens representativas de inserção capilar para coleção CSF. Configuração do mouse pronta para extração de CSF com (A) raspou a cabeça presa no lugar para dissecção e (B) detalhadas imagem (vista de x 10) de um rato dissecado dura cobrindo a cisterna magna (seta tracejada mostra um vaso sanguíneo que atravessa a área e seta sólida mostra área ideal para inserção capilar). Imagens detalhadas (10 x modo de exibição) de (C) afiada ponta do capilar de vidro alinhada contra a dura-máter da cisterna magna, (D) o ponto em que o capilar puncturas quase a dura-máter, com alguma resistência de dura-máter e (E) a ponta capilar aproveitada através da dura-máter para coletar CSF. CSF deve ser um líquido coletado no vidro capilar (seta pontilhada). Todas as barras de escala na parte inferior direita de cada imagem de microscópio indicam 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. CSF coleção de Mouse anestesiado

1. Alinhe o capilar de vidro na parte de trás da cabeça do rato, de modo que o ponto afiado é apenas atrás da membrana em um ~ 30-45 ° ângulo (Figura 2).
2. Mergulhar a seringa uma vez ou algumas vezes e elaborar a seringa ~ 100-200 µ l (para certificar-se de que não há nenhum contaminante e existe pressão negativa no vidro capilar).
3. Usando o micromanipulador, mova o capilar dica mais perto da membrana até a resistência pode ser vista, mas não puncioná-la (Figura 2D).
4. Uma vez que a resistência é vista entre a ponta do capilar e a membrana, bata levemente o tubo capilar através da membrana por bater nos controles de micromanipulador. Use o microscópio para ver o ponto afiado da punção capilar para a cisterna magna. CSF automaticamente deve ser desenhado dentro do tubo capilar, uma vez que a abertura foi esvaziada (Figura 2E).
5. Sair do capilar para coletar lentamente CSF. Se o CSF parou de desenhar, desenhar a seringa uma pequena quantidade lentamente (~ 50 µ l) para criar pressão mais negativa no capilar para extrair para fora o CSF.
   Nota: Alternativamente, capilar pode ser suavemente e lentamente tirou o cérebro usando os controles bem micromanipulador para permitir CSF flua capilar novamente. Um montante total de ~ 10-15 µ l de LCR (~ 3-4 cm no capilar) leva ~ 10-30 min e ocasionalmente de 20 µ l ou mais podem ser coletados. Embora não seja absolutamente necessário, é recomendável usar uma almofada de calor durante a coleta do CSF. Coleção de CSF foi realizada à temperatura ambiente (~ 23 ° C).
6. Uma vez que a quantidade de LCR desejado é coletada, feche o tubo deslocando-se a válvula de três vias para fechar (para parar de desenhar fora o CSF).
7. Retire a seringa conectada para o tubo e abrir e fechar o tubo (para criar pressão equalizada no capilar, um tubo e a área fora do capilar). Reconectar a seringa com a válvula de três vias, mas não mergulhe a seringa.
8. Remova cuidadosamente o capilar de vidro do mouse usando o micromanipulador.
9. Coloque o tubo de coleta (microtubos de 1,5 mL com 1 µ l de 20 x inibidor da protease) sob o ponto afiado do vidro capilar.
10. Abra o tubo e mergulhar suavemente a seringa: o CSF deve fluir fora do capilar e o tubo de coleta.
11. Após a coleta, centrifugar rapidamente (pulso rotação por 5 s, a velocidade máxima, usando uma mini centrífuga) o CSF para misturar a amostra com o inibidor de protease na parte inferior do tubo da coleção.
    Nota: As amostras de CSF podem ser aliquotadas e então armazenados para posterior análise a-80 ° C. O resto do mouse pode ser dissecado para outros tecidos, tais como cérebro e medula espinhal. O mouse ainda está vivo nesta fase e, portanto, sangue pode também ser recolhido, se necessário.

Resultados

Usando o procedimento descrito aqui (Figura 1 e Figura 2), o CSF imediatamente recolhido no capilar deve ser clara (Figura 2E), não rosa ou vermelho. Se houver uma rosa para coloração avermelhada para o fluido coletado no capilar, depois houve contaminação com sangue.

Como um exemplo da aplicação da amostra do CSF coletados com esse método,...

Discussão

Este protocolo descreve, em detalhes, uma técnica que melhora na atual métodos¹⁰ da coleção do CSF para minimizar a contaminação do sangue e permitir a coleção abundante de LCR (em média ~ 10-15 µ l podem ser obtidos) dos ratos. Ao quebrar a ponta capilar, a ponta do capilar não deve ser muito pequena (como então o CSF será extraído muito lentamente) ou muito grande (vontade não ser fino o suficiente para recolher o CSF e tecido pode tornar-se alojou no capilar). Tenha cuidado quando dissecando a ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hidrato de cloral (usado como anestésico)	Sinopharm Chemicals Reagen Co., Ltd.	30037517	número CAS 302-17-0.
Tesoura de dissecação	66 tecnologia de visão	54002
Pinça de dissecação curva	66 tecnologia de visão	53072
Pinça de dissecação reta	66 tecnologia de visão	53070
Adaptador de mouse (com barras de ouvido)	Feito internamente.	N/A	Equipamento similar disponível na World Precision Instruments.
Microscópio de dissecação	Meiji Labax	Modelo 15381
Micromanipulador	World Precision Instruments	M3301
Base magnética para micromanipulador	Kanetec	MB-K
Capilares de vidro	World Precision Instruments	1B100-4
Extrator de micropipeta	Sutter	Instruments Modelo P-1000
Seringas (1ml)	Tansoole	02024692	Para 1ml.
Microtubos (1.5ml)	Axigen	MCT-150-C
Inibidor de protease Conjunto de coquetel III Calbioquímico sem EDTA		539134
A&beta Humano; 42 Kit ELISA	Invitrogen	KHB3441
Tubulação (tubo de teflon)	World Precision Instruments	MMP-KIT	Obtido a partir de um kit de microinjeção e acoplado ao suporte capilar e à seringa.
Mini centrífuga	Tiangen Biotech	OSE-MC8
Cotonetes	Obtido em qualquer loja / farmácia doméstica.	N/A