Neste protocolo, descrevemos uma técnica para descobrir Zika vírus específico diagnósticos peptides usando um microarray de peptídeo de alta densidade. Este protocolo especialidade pode ser adaptado para outras doenças infecciosas emergentes.
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Artigo de método
Zika vírus específico diagnóstico Epitope Discovery
Neste artigo
Resumo
Resumo
High-density do peptide microarrays permitir rastreio de peptídeos de mais de seis mil em um slide de microscopia simples padrão. Esse método pode ser aplicado para a descoberta de medicamentos, identificação do alvo terapêutico e desenvolvimento de diagnósticos. Aqui, apresentamos um protocolo para descobrir específico Zika vírus (ZIKV) diagnósticos peptides usando um microarray de peptídeo de alta densidade. Uma amostra de soro humano validada para infecção ZIKV foi incubada com um microarray de peptídeo de alta densidade contendo a proteína inteira de ZIKV traduzida em 3.423 exclusivo 15 resíduos linear de aminoácidos (aa) com uma sobreposição de resíduo 14-aa impresso em duplicado. Coloração com anticorpos secundários diferentes dentro do mesmo conjunto, detectamos peptídeos que ligam a imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG) anticorpos presentes no soro. Estes peptídeos foram selecionados para mais experiências de validação. Neste protocolo, descrevemos a estratégia adoptada para projetar, processar e analisar um microarray de peptídeo de alta densidade.
Introdução
Zika diagnóstico de vírus (ZIKV) com base nos sintomas clínicos é um desafio porque compartilha vetores, distribuição geográfica e sintomas de infecção de vírus Dengue e Chikungunya1. Dado o risco de resultados adversos da gravidez em mulheres infectadas com ZIKV durante a gravidez, é importante distinguir entre os 3 vírus. Embora os testes de diagnóstico moleculares atuais são específicos, eles são úteis apenas no sangue ou saliva durante o período relativamente curto de infecção aguda2,3. Ensaios sorológicos são essenciais para o diagnóstico fora deste período inicial de infecção
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Protocolo
Esses dados fazem parte de um estudo de investigação em curso realizado na New York University College of Dentistry e foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Amostras clínicas utilizadas neste estudo foram identificadas de amostras anteriormente utilizadas para o diagnóstico e com a permissão de Wadsworth Center de Nova York Secretaria de estado da saúde, Albany, NY.
1. instalar o ZIKV de alta densidade de peptídeo Microarray deslize em uma bandeja de incubação específica
- Lidar com a lâmina de vidro pelas bordas usando luvas sem pó. As dimensões do slide de....
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Resultados
Os resultados obtidos utilizando o protocolo descrito são mostrados na Figura 2 e Figura 3. Não há interações de fundo foram observadas quando pre-manchando o microarray com anti-humano secundário IgM (dados não mostrados). Coloração com um anti-humano IgM conjugado resultou em diversas áreas acima as intensidades de fluorescência verde de fundo, indicando a ligação destes peptídeos com IgM na amostra de soro de.......
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Discussão
Nós projetamos um protocolo utilizando um microarray de peptídeo de alta densidade contendo a toda sequência de proteína vírus Zika (estirpe da Polinésia francesa). O microarray foi fabricado pela impressão 3.423 diferentes sobreposição peptídeos lineares. Cada peptídeo foi 15 aminoácidos e variados por apenas um resíduo de seu vizinho mais próximo na sequência (ou seja, sobreposição de resíduo 14). Embora sobreposições mais curtas podem ser impressos, mapeamento de epítopo é mais preciso com sobreposições mais .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Suporte atual é fornecido por uma concessão de suplemento administrativo SBIR (pequenos negócios inovação pesquisa) do NIDCRR44 DE024456. Concessão de NIDCR HIV que evoluiu fora NIDCR conceder U01 DE017855 para o desenvolvimento de um confirmação diagnóstico point-of-care para HIV. Reconhecemos com gratidão Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) para a assistência técnica e apoio gentil. Agradecemos também a NYU Langone Medical Center para o LI-COR Odyssey Imaging System.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Personalizado peptídeo micarray: nosso microarray contém toda a sequência de proteína do vírus Zika |
| Bandeja de incubação PEPperCHIP 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, rotulagem DyLight) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | Licença gratuita de 14 dias para Windows |
| Rockland Buffer de bloqueio | Rockland | MB-070 | |
| IgM anti-humano (cadeia mu) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| IgG anti-humano Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Dispositivo agitador orbital | IKA | MTS 2/4 microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
Referências
- Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al.
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Reimpressões e permissões
