Artigo de método

Medida quantitativa da proteína precursora amiloide γ-Secretase-mediada e clivagem de entalhe em plataformas de ensaio baseada em célula Luciferase Reporter

6.4K vistas

⸱

DOI:

10.3791/56795

⸱

25 de janeiro de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Neurobiology, Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Estamos com sucesso geraram dois ensaios de substrato específico γ-secretase. Ambos os ensaios cell-based aqui apresentados destinam-se para quantificar o γ-secretase actividades enzimáticas através da saída de repórteres de luciferase de vaga-lume.

Resumo

Nós desenvolvemos um par de ensaios de gene repórter baseada em célula para medir quantitativamente a clivagem de γ-secretase de substratos distintos. Este manuscrito descreve procedimentos que podem ser usados para monitorar a clivagem γ-secretase-mediada de APP-C99 ou entalhe, utilizando um sistema de repórter Gal4 vagalume orientada por promotor do luciferase. Estes ensaios foram estabelecidos por estàvel co transfecting células HEK293 com o gene do repórter do luciferase orientado a Gal4 e o fragmento de Gal4/VP16-marcados C-terminal da APP (APP-C99; Células CG), ou a Gal4/VP16-tag entalhe-ΔE (NΔE; Células de NG). Usando estes ensaios de repórter em paralelo, temos demonstrado que um inibidor ErbB2, CL-387.785, preferencialmente pode suprimir a clivagem de γ-secretase de APP-C99 em células CG, mas não NΔE em células de NG. As diferenciais respostas exibidas pelas células CG e NG, quando tratados com CL-387.785, representam uma característica preferencial para moduladores de γ-secretase, e essas respostas estão em contraste com a pan-inibição de γ-secretase induzido por DAPT. Nossos estudos fornecem a evidência direta que γ-secretase atividades em direção a diferentes substratos podem ser diferenciadas em um contexto celular. Estes novos ensaios, podem ser ferramentas úteis na descoberta da droga melhorada das terapias AD.

Introdução

Oligoméricas formas de amiloide-β (Aβ) são acreditadas para ser a causa primária de neurodegeneração nos cérebros de pacientes que sofrem de doença de Alzheimer (AD)1. Peptídeos aβ são produzidos pela gradual clivagem da proteína precursora amiloide (APP), primeiro por β-secretase e depois por γ-secretase2. Na década passada, abordagens terapêuticas para o tratamento da AD têm-se centrado na prevenção da produção de Aβ3. A maioria dos estudos focaram-se também o aumento da atividade de α-secretase, que pode impede a clivagem de γ-secretase de APP e, assim, diminuir a produção de Aβ, ou a inibição da β-e/ou γ-secretase atividades4. Infelizmente, não-seletivo da inibição da β ou γ-secretases resultados em inevitáveis efeitos colaterais que são devido à interferência com o funcionamento de outros substratos fisiológicos de β e γ-secretase5,6. No que se refere a inibidores de γ-secretase, estudos recentes relataram a descoberta de um número de moduladores químicos e genéticos que podem regular a produção de Aβ enquanto exercer efeitos insignificantes sobre o tratamento de γ-secretase-mediada essencial de entalhe7 ,8,9,10,11,12, no entanto, terapêutica bem sucedida ainda não foram desenvolvidas. Assim, ainda mais sistemáticas telas são garantidas para descobrir novos modificadores de genéticas e químicas que podem seletivamente modular γ-secretase-mediada processamento de APP.

Γ-Secretase é conhecido para cravar mais de 90 diferentes proteínas de membrana-ancorado. Entre estes substratos é entalhe, cuja actividade é fundamental para a determinação do destino de célula e diferenciação durante desenvolvimento13. Seletivamente a modular γ-secretase-catalisada APP processamento na ausência de afectar o entalhe processamento será essencial para minimizar efeitos colaterais relacionados com entalhe de γ-secretase-inibidores, e esta seletividade é pensada para ser um fator principal que será dite a eficácia biológica de moduladores de γ-secretase potenciais para o tratamento crônico da AD. Tem havido um número de derivados de arylsulfonamide, tais como o GSI-953 (begacestat) e BMS-708163 (avagacestat), que foram encontrados para exibem inibição potente e seletiva de γ-secretase14,15. Um estudo anterior demonstrou que a inibição diferencial de γ-secretase clivagem da APP e entalhe pode ser observada usando um ensaio quantitativo ELISA-baseado em combinação com validação no vivo usando zebrafish16. Além disso, foram estabelecidas paradigmas baseada em célula de ensaio para abordar a potencial seletividade de substrato de γ-secretase em direção a APP e o entalhe de17,18. Usando protocolos semelhantes as descritas neste documento, nós descobrimos recentemente uma nova classe de (D)-leucinamides que potente modular γ-secretase clivagem da APP com entalhe poupadores seletividade19. Juntos, esta coleção de estudos fornece um prova de conceito a noção de que a seletividade/disponibilidade de substrato de γ-secretase podem estar sujeitas a modulação química e verificação experimental de apoio. No entanto, essas plataformas de ensaio muitas vezes dependem de relativamente baixa produtividade leituras e abordagens de trabalho intensivos que não podem cumprir padrões industriais para programas de descoberta de drogas.

Nós recentemente geraram ensaios de gene do repórter do luciferase baseada em célula que quantitativamente podem determinar a atividade catalítica de γ-secretase em direção a dois substratos distintos, 99-amino ácido fragmento C-terminal da APP (APP-C99) e o extracelular domínio-excluído peptídeo Notch (NΔE). Tanto APP-C99 e NΔE foram amplamente utilizados como substratos diretos de γ-secretase em vários ensaios. Para gerar ensaios de gene repórter do luciferase homogênea e consistente para a clivagem de γ-secretase de APP-C99 ou NΔE, geramos uma linha de HEK-derivado de célula estável (CG) que constitutivamente expressa um Gal4 vagalume orientada por promotor do luciferase repórter ( Gal4-Luc) e a proteína de fusão Gal4/VP16-com a tag APP-C99 (C99-GV). Além disso, geramos uma outra linha de HEK-derivado de célula estável (NG) que constitutivamente expressa Gal4-Luc e NΔE Gal4/VP16-marcados (NΔE-GV). Usando estes ensaios romance substrato específico γ-secretase, agora oferecemos um método para quantificar e distinguir a atividade catalítica de γ-secretase em direção a diferentes substratos (APP-C99 em células CG), ou NΔE em células de NG. Além disso, os substrato específico γ-secretase ensaios foram projetados para ser propício para plataformas de triagem de alto teor. Estes ensaios γ-secretase recém-gerado poderiam pavimentar o caminho para a descoberta de moduladores de γ-secretase romance que poderia melhorar a função cognitiva, suprimindo a produção de Aβ sem suscitar indesejável inibição de entalhe para o tratamento de última geração do anúncio.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. medição de sinais de repórter de Luciferase, que correspondem a clivagem de γ-Secretase de APP-C99 ou NΔE

Nota: Consulte as publicações anteriores para obter descrições detalhadas da geração de CG e NG células20,21.

  1. Semente de células NG ou CG (20, 000 células/poço) para microplacas de 96 poços em um volume final de 200 μL/poço no meio de crescimento que é composto modificado águia médio (DMEM) acrescido de 10% bovina soro fetal de Dulbecco (FBS), 5 μg/mL blasticidin, 250 antibiótico μg/mL (por exemplo, zeocin) e 200 μg/mL hptII B.
    1. Contar as células com um hemocytometer.
    2. Transferir as microplacas para uma incubadora de2 CO umidificada e incubar a 37 ° C durante a noite.
  2. Remova 100 μL de média de crescimento de cada poço.
  3. Adicionar 100 μL/poço do crescimento médio contendo 2 tetraciclina μg/mL com ou 0,2% dimetilsulfóxido (DMSO), 2 μM CL-387.785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-aguarráz (DAPT) ou outros relacionados ErbB1/ErbB2 inibidores.
  4. Incube células tratadas CG ou NG em microplacas a 37 ° C por 24 h.
  5. Remova o meio de crescimento μL/poço de 150 de microplacas.
  6. Adicionar 50 μL/poço do luciferase ensaio reagente (veja Tabela de materiais).
  7. Transferi as microplacas para um leitor de microplacas de luminescência.
    1. Manter as microplacas à temperatura ambiente por 5 min com agitação suave.
  8. Determinar o luciferase de vaga-lume (FL)-emitida usando um programa pré-definido armazenado no leitor de microplacas de luminescência de luminescência.
    1. Abra o software de controle de instrumento (ver Tabela de materiais para obter detalhes do instrumento).
    2. No menu 'Ferramentas', selecione 'Luminometry'.
      1. Sob as configurações de 'Parâmetros', não escolha 'Nenhum filtro' para emissão de filtro, carrapato 'Normal' para abertura de emissão, digite '1' para contagem de tempo e clique em 'Okey' para configurar a leitura de luminescência.
    3. Na guia 'Instrumento de controle', percorra a lista de protocolos de ativos e selecione o protocolo previamente armazenado para a leitura de luminescência.
    4. Sob a aba "Exibição de viver", definir a dimensão da lista suspensa e selecione 'Logaritmo' ou 'Linear' para o tipo.
    5. Na guia 'Temperatura', selecione 'Off' para o aquecimento da placa.
    6. Clique no botão 'Iniciar' para executar a leitura de luminescência.
    7. Conforme necessário, exporte os resultados em um formato de planilha usando o 'Explorer' incorporado dentro do software de controle.

2. a quantificação da atividade de γ-Secretase

  1. Defina um sinal de luminescência emitida pelo CG ou células NG tratadas com 0,1% DMSO em meio de cultura contendo 1 tetraciclina μg/mL como 100% relativo γ-secretase atividade sozinha.
    1. Estimar a luminescência de fundo de células CG ou NG, tratando as células com o meio de crescimento que não inclui tetraciclina.
  2. Normalizar os sinais do luciferase de CG ou NG células que são cultivadas com meio de cultura contendo 1 tetraciclina μg/mL e qualquer 1 μM CL-387.785 ou 1 μM de DAPT com o sinal do luciferase emitido por CG tratados com DMSO ou NG células (atividade de γ-secretase relativa de 100%, como definido em 2.1).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Inibição de ErbB2 pelo CL-387.785 diferencialmente pode promover o processamento de APP-C99 por Γ -secretase sem afetar a clivagem do entalhe
Para estabelecer um ensaio baseados em células que quantitativamente pode medir a clivagem proteolítica de um substrato específico γ-secretase, geramos a linhagem de células HEK293-derivado CG por transfection co estável de uma tetraciclina-inducible C-terminal Gal4/VP16-tag APP-C99 e um gene rep...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Os resultados promissores de um fase 1b ensaio de aducanumab imunoterapia para AD estabeleceram firmemente o papel crítico de Aβ na patogênese da AD22 e sugerem que abordagens anti-Aβ ainda são uma estratégia viável para o desenvolvimento de drogas antianúncios. Aqui, descrevemos ensaios cell-based, para quantificar a proteólise γ-secretase-catalisada de APP-C99 e NΔE usando sistemas de repórter de luciferase de vaga-lume. APP-C99 e NΔE são os dois substratos de γ-secretase mais bem estudados e ju...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores graças a facilidade do núcleo do Instituto de celular e biologia organísmica, Academia Sinica, apoio técnico. Este estudo foi suportado pelo Ministério da ciência e tecnologia, Taiwan (mais-103-2320-B-001-016-MY3 para Y.-F. L.), o programa de inovação translacional de Biofarmacêutica desenvolvimento – tecnologia de apoio a plataforma eixo regime (NP7 para Y.-F.L.) e Academia Sinica (para Y.-F.L.).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Leitor de placas de luminescência VictorLightPerkinElmer2030-0010
Classe II, Tipo 2 Gabinete de Segurança BiológicaThermo Scientific1300 Série A2
CL-387,785EMD Calbiochem233100-1MG
DAPTMerck565770
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher12100046principal componente do meio de crescimento
Soro fetal bovino (FBS)Thermo Fisher16000044
BlasticidinaThermo FisherA1113903
ZeocinThermo FisherR25005
Hygromycin BGibco10687010
HemocytomerSigma-AldrichMicroplaca de 96 poços BR717805 Aldrich
Nunc156545
TetraciclinaSigmaT7660
Dimetilsulfóxido (DMSO)SigmaD2650
Reagente de ensaio de luciferase Steady-GloPromegaE2510
Incubadora de CO2RevcoUltima II
Linha celular T-REx293InvitrogenR71007
Wallac 1420 software versão 3.0PerkinElmersoftware de controle de instrumento do leitor de microplacas de luminescência

Referências

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
  3. Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
  4. Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
  5. Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
  6. Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
  7. Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
  8. Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
  9. Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
  10. Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
  11. Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
  12. He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
  13. Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
  14. Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
  15. Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
  16. Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15(2008).
  17. McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
  18. Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36(2010).
  19. Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
  20. Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
  21. Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
  22. Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
  23. Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
  24. Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
  25. Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
  26. Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Ensaio de Gamma SecretaseMedi o da Clivagem de APPAn lise da Clivagem de NotchSistema de Rep rter de LuciferaseCultura de C lulas HEK293Tratamento com CL 387 785Estudo de Inibi o por DAPTAn lise de Seletividade de SubstratoPesquisa da Doen a de AlzheimerPlataforma de Descoberta de F rmacos

Artigos relacionados