Protocolo Experimental para Detecção de Função Mitocondrial em Hepatócitos Expostos a Pesticidas Organoclorine

Summary

Compreender a influência dos pesticidas organocloritos ambientais (OCPs) na função mitocondrial nos hepatócitos é importante na exploração do mecanismo de OCPs causando distúrbios metabólicos. Este artigo apresenta métodos detalhados na detecção da função mitôndrial hepática.

Abstract

Este artigo apresenta métodos detalhados na detecção da função mitôndrial hepática para uma melhor compreensão da causa de distúrbios metabólicos causados por pesticidas organocrono ambiental (OCPs) em hepatócitos. As células hepG2 foram expostas a β-hexacloocyclohexane (β-HCH) por 24 h em uma dose equivalente de exposição interna na população geral. A ultraestrutura nos hepatócitos foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para mostrar o dano das mitocôndrias. A função mitocondrial foi ainda avaliada pela intensidade da fluorescência mitocondrial, níveis de adenosina de 5'-triphosphate (ATP), taxa de consumo de oxigênio (OCR) e potencial de membrana mitocondrial (MMP) em células HepG2 incubadas com β-HCH. A intensidade da fluorescência mitocondria após manchada pela sonda fluorescente verde mitocondrial foi observada com uma microscopia de fluorescência. A reação luciferina-luciferase foi usada para determinar os níveis de ATP. O MMP foi detectado pelo corante cationic JC-1 e analisado sob citometria de fluxo. OCR foi medido com um analisador de fluxo extracelular. Em resumo, esses protocolos foram utilizados na detecção da função mitocondrial em hepatócitos para investigar danos mitocôndrias.

Introduction

Os efeitos dos pesticidas organocloritos (OCPs) na saúde, por exemplo, interferência reprodutiva, toxicidade imunológica, alterações metabólicas foram previamente estudados^1,,2,3. Os métodos para detectar o metabolismo celular e descobrir a disfunção mitocondrial permitiram que os cientistas entendessem o papel da função mitocondrial (ou seja., níveis mitocondrial STAT3, lactato, piruvato, razão lactato-piruvato, coenzima Q10, vazamento de prótons mitocondrial, bioenergetics, biogênese e dinâmica) em áreas como envelhecimento, obesidade, diabetes, função car....

Protocol

Todos os experimentos e os protocolos de experimento foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes e aprovados pelo Comitê de Ética local da Universidade Médica de Nanjing.

1. Ultraestrutura mitocondrial por TEM

1. Coleta de células HepG2
   1. Células Seed HepG2 em pratos de 100 mm. Armazenar a 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Digestão de células com 0,25% EDTA em tubo de 1,5 mLEP.
   3. Centrifugar a 1000 x g por 3 min a temperatura ambiente (RT). Descarte o supernaspeso.
   4. Coletar células 4-6 x 10⁵ HepG2.
2. Adicione 1 mL de glutaraldeído de 5....

Results

As mitocôndrias cristae de células HepG2 expostas a β-HCH foram marcadamente danificadas. Mitocôndrias dispersas foram levemente expandidas, de forma irregular e cume mitocondrial desaparecido com arquitetura mitocondrial relativamente anormal(Figura 1).

A intensidade média da fluorescência verde mitocondrial, que representa as mitocôndrias, diminuiu nas células HepG2 expostas ao β-HCH

Discussion

Fundamental para o sucesso do protocolo de detecção é o uso de uma variedade de métodos experimentais que foram cobertos do estudo do fenótipo ao mecanismo. Neste estudo, as células HepG2 foram cultivadas em DMEM com penicilina e estreptomicina e 10% de soro bovino fetal. Quando as células atingiram 40-50% de confluência, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) foram adicionadas e incubadas por 24 h. Em primeiro lugar, utilizamos o TEM que mostrou as alterações ultraestruturais no hepatocito causados pelos OCPs representativos, β-HCH, .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio eletrônico de transmissão	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	Imagens de alto contraste e alta resolução, Observação e imagens de baixa dose, Observação a baixa temperatura, Excelente desempenho analítico, Automação para conveniência e desempenho
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green é uma sonda fluorescente verde mitocondrial que pode ser usada para coloração fluorescente específica para mitocôndrias de células vivas.
Microscópio confocal de varredura a laser	Zeiss	700B	O design é compacto, estável, o caminho da luz é o mais curto, alta precisão de luz, tecnologia criativa e sofisticada tecnologia de varredura juntas para produzir uma imagem de espécime tridimensional perfeita.
Kit de Ensaio de ATP Aprimorado	Beyotime	S0027	O Kit de Ensaio de ATP Aprimorado pode ser usado para detectar níveis de ATP (adenosina 5'-trifosfato) em soluções, células ou tecidos comuns. As amostras de células e tecidos podem ser divididas para completar a preparação da amostra, a sensibilidade de detecção de até 0,1 nmol / L, a quimioluminescência pode ser mantida por 30 minutos.
Luminômetro	Berthold	Centro LB 960	O luminômetro é um detector de quimioluminescência, a amostra de teste em si pode ser leve, não precisa estimular. O luminômetro é o instrumento que detecta a quimioluminescência.
Kit de ensaio de proteína BCA	Beyotime	P0012	O kit de ensaio de proteína BCA é um dos métodos mais comumente usados para detectar concentrações de proteínas.
Leitor multimodo	TECAN	InfiniteM200	leitor multimodo pode ser usado para detectar a consonência de proteínas.