Protocolo Experimental para Detecção de Função Mitocondrial em Hepatócitos Expostos a Pesticidas Organoclorine

Summary

Compreender a influência dos pesticidas organocloritos ambientais (OCPs) na função mitocondrial nos hepatócitos é importante na exploração do mecanismo de OCPs causando distúrbios metabólicos. Este artigo apresenta métodos detalhados na detecção da função mitôndrial hepática.

Abstract

Este artigo apresenta métodos detalhados na detecção da função mitôndrial hepática para uma melhor compreensão da causa de distúrbios metabólicos causados por pesticidas organocrono ambiental (OCPs) em hepatócitos. As células hepG2 foram expostas a β-hexacloocyclohexane (β-HCH) por 24 h em uma dose equivalente de exposição interna na população geral. A ultraestrutura nos hepatócitos foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para mostrar o dano das mitocôndrias. A função mitocondrial foi ainda avaliada pela intensidade da fluorescência mitocondrial, níveis de adenosina de 5'-triphosphate (ATP), taxa de consumo de oxigênio (OCR) e potencial de membrana mitocondrial (MMP) em células HepG2 incubadas com β-HCH. A intensidade da fluorescência mitocondria após manchada pela sonda fluorescente verde mitocondrial foi observada com uma microscopia de fluorescência. A reação luciferina-luciferase foi usada para determinar os níveis de ATP. O MMP foi detectado pelo corante cationic JC-1 e analisado sob citometria de fluxo. OCR foi medido com um analisador de fluxo extracelular. Em resumo, esses protocolos foram utilizados na detecção da função mitocondrial em hepatócitos para investigar danos mitocôndrias.

Introduction

Os efeitos dos pesticidas organocloritos (OCPs) na saúde, por exemplo, interferência reprodutiva, toxicidade imunológica, alterações metabólicas foram previamente estudados^1,,2,3. Os métodos para detectar o metabolismo celular e descobrir a disfunção mitocondrial permitiram que os cientistas entendessem o papel da função mitocondrial (ou seja., níveis mitocondrial STAT3, lactato, piruvato, razão lactato-piruvato, coenzima Q10, vazamento de prótons mitocondrial, bioenergetics, biogênese e dinâmica) em áreas como envelhecimento, obesidade, diabetes, função cardiovascular, câncer e toxicidade de segurança^4,,5,,6,7. Neste artigo, descrevemos os métodos de avaliação da disfunção mitocondrial causada pelos OCPs.

Expusemos células HepG2 a β-hexacloocyclohexane (β-HCH), um OCPs representativo, por 24 h em uma dose equivalente à exposição interna do ser humano. Em primeiro lugar, foi aplicado o TEM para observar a ultraestrutura de hepatócitos, como núcleos, mitocôndrias e regúlum⁸endoplasmáticos . Em comparação com microscópios comuns, o TEM permite explorar a ultraestrutura 2D e 3D de células e componentes celulares (linhas celulares ou tecidos), a morfologia, a composição química, bem como a função de materiais naturais ou artificiais que desempenham um papel fundamental na ciência e tecnologia modernas. A função mitocondrial foi ainda avaliada pela intensidade da fluorescência mitocondrial, níveis de adenosina de 5'-triphosphate (ATP), taxa de consumo de oxigênio (OCR) e potencial de membrana mitocondrial (MMP) em células HepG2 incubadas com β-HCH. Mito-tracker green é uma sonda fluorescente verde mitocôndria que pode ser usada para coloração fluorescente específica de células vivas. As mitocôndrias em hepatócitos foram manchadas pela solução verde mito-tracker e a intensidade, número e padrão mitocondrial foram observados com uma microscopia confocal⁹. Sonda fluorescente verde mitocondrial pode ser usada para manchar células vivas. Em comparação com a rhodamina 123 ou JC-1, a sonda fluorescente verde mitocondrial não depende do potencial de membrana mitocondrial para coloração mitocondrial. Os níveis de ATP foram determinados por um kit de luciferase-luciferina e normalizados pela concentração proteica. O kit de ensaios ATP pode ser usado para detectar níveis de ATP em soluções, células ou tecidos comuns. Este kit é baseado em luciferase de vagalume catalisada por fluoresceína para gerar fluorescência, quando a ATP é necessária para fornecer energia. Quando a luciferase de vagalume e fluoresceína são excessivas, em uma certa faixa de concentração, a geração de fluorescência é proporcional à concentração de ATP. Além disso, este kit foi especialmente projetado para otimizar a chemiluminescence da ATP. A ATP, como as moléculas de energia mais importantes, desempenha um papel importante nos diversos processos fisiológicos ou patológicos das células. Mudanças nos níveis de ATP podem refletir defeitos na função celular, especialmente na produção de energia mitocondrial. Normalmente sob apoptose, necrose ou em algum estado tóxico, os níveis de ATP celular reduziram ¹⁰. O kit de ensaio mmps com JC-1 é um kit que usa JC-1 como uma sonda fluorescente para detectar células, tecidos ou MMPs purificados de forma rápida e sensível. Pode ser usado para detecção precoce de apoptose. O corante cácional JC-1 é uma sonda fluorescente usada para detectar o MMP que pode ser analisado sob citometria de fluxo indicada por alterações na razão de fluorescência verde e vermelha. Quando o MMP é alto, o JC-1 é agregado na matriz das mitocôndrias para formar um polímero (J-agregados), que produz fluorescência vermelha. Quando o MMP é baixo, o JC-1 não consegue acumular e forma monômero que produz fluorescência verde¹¹. Assim, a razão de fluorescência vermelha e verde pode refletir o nível de MMP. O OCR das células é um indicador crucial da função celular normal¹². É considerado como um parâmetro para pesquisar a função mitocondrial. O kit de teste de estresse mito celular fornece um método estável para analisar parâmetros-chave da função mitocondrial. O kit fornece controle de qualidade e reagentes preditivos, bem como um método padrão para a realização de teste de estresse mitocondrial celular. Pode ser usado para detectar todos os tipos de células, incluindo células primárias, linhas celulares, células suspensas, e também para ilhotas, nematoides, leveduras e mitocôndrias isoladas.

A medição do OCR pode fornecer uma visão valiosa do estado fisiológico ou alterações das células. Foi determinado com um analisador de fluxo extracelular para detectar a linha de base respiratória, vazamento de prótons, respiratório máximo, rotatividade de ATP e capacidade de reserva. Em suma, após medições de linha de base do OCR, o OCR foi detectado após adicionar sequencialmente à oligomicina (ATP Coupler), FCCP (fosforilação oxidativa mitocondrial uncoupler) e antimicina A/rotenona (um inibidor do consumo de oxigênio)por poço.

Em um esforço para facilitar o desenvolvimento de protocolos mais específicos para a detecção da função mitocondrial em hepatócitos in vitro, apresentamos aqui experimentos de TEM, microscopia confocal, luminômetro, citometria de fluxo e analisador de fluxo extracelular com aplicação futura no estudo de desfechos adversos relacionados a danos mitocôndrias.

Protocol

Todos os experimentos e os protocolos de experimento foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes e aprovados pelo Comitê de Ética local da Universidade Médica de Nanjing.

1. Ultraestrutura mitocondrial por TEM

1. Coleta de células HepG2
   1. Células Seed HepG2 em pratos de 100 mm. Armazenar a 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Digestão de células com 0,25% EDTA em tubo de 1,5 mLEP.
   3. Centrifugar a 1000 x g por 3 min a temperatura ambiente (RT). Descarte o supernaspeso.
   4. Coletar células 4-6 x 10⁵ HepG2.
2. Adicione 1 mL de glutaraldeído de 5% (Solvente: água dupla destilada) com pipetas e incubar a 4°C por 2h.
3. Adicione e lave em 4 alterações de 1 mL de tampão fosfato (contendo Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl e KCl, pH 7.4), 15 min cada. Sugar tampão de fosfato com pipetas.
4. Adicione 200 μm de 1% de ósmio (Solvente: água dupla destilada) e incubar a 4 °C por 2h à amostra preta.
   Atenção: Osmium é uma substância altamente tóxica e volátil. Deve ser operado no armário de drogas cuidadosamente.
5. Adicione e lave em 2 trocas de 1 mL de tampão fosfato, 5 min cada. Sugar o tampão fosfato.
6. Manchar em solução de acetato de 2% de brântico (Solvente: água dupla destilada e ácido acético) em tubo EP de 1,5 mL por 2 h.
7. Desidratar e submergir através de 50% de acetona, 70% acetona, 90% acetona (Solvente: dupla água destilada), 2 mudanças de acetona absoluta, 15 min cada.
8. Penetrar em 2 gotas de acetona (100%)/agente de incorporação (1:1) por 1,5 h no RT. Agente de incorporação Epon812, a receita é a seguinte: A: Epon812, 62 mL e DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL e MNA 89 mL. A:B=2:8 (v:v, no inverno), A:B=1:9 (v:v, no verão). Incorporação em moldes de incorporação (placa de plástico macia com grade quadrimesca).
9. Incubar sequencialmente a 37 °C por 12h, 45 °C para 12 h e, em seguida, 60 °C para 48 h.
10. Preparar e observar seções ultrathinas (a maior área não pode exceder 0,5 mm × 0,3 mm) por máquina de seções ultrathinas e TEM (2 μm e 500 nm).

2. Detecção de intensidade de fluorescência mitocondrial

1. Sementes 2x 10⁴ células HepG2 em placas de 6 poços. Adicione β-HCH por 24 h.
2. Adicione DMSO anidro para formular uma concentração final de 1 mM sonda fluorescente verde mitocondrial.
3. Adicione 1 mL solução de sonda fluorescente verde mitocondrial (concentração final: 200 nM) a cada poço de placas de 6 poços, incubar a 37 °C por 45 min.
4. Remova a solução de sonda fluorescente verde mitocondrial e adicione o meio de cultura celular recém-preparado (DMEM) a 37 °C antes da imagem.
5. Observe fluorescência verde mitocondrial por um microscópio de fluorescência (10x). O comprimento máximo de onda de excitação na detecção é de 490 nm e o comprimento máximo de onda de emissão é de 516 nm.

3. Ensaio dos níveis de ATP celular

1. Células Seed HepG2 em placas de 6 poços. Adicione β-HCH por 24 h.
2. Adicione 200 μL de tampões de lise do kit de ensaio ATP luciferase-luciferina para cada poço de placas de 6 poços. Centrífuga a 12.000 x g por 5 min a 4 °C, colete o supernasal com pipetas em novos tubos.
3. Diluir o reagente de detecção de ATP com a diluição atp em uma proporção de 1: 5, como tampão de detecção DE ATP.
4. Prepare a determinação da curva padrão: diluir os 0,5 mM de solução padrão ATP para 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 μM por buffers de lise ATP.
5. Adicione 100 μL de tampão de detecção de ATP em uma placa de 96 poços por 5 min no RT, e adicione 100 μL de supernacante de célula, detecte por um luminômetro (detector de quimiluminescência). Calcule a concentração ATP (nmol/L) embora a curva padrão.
6. Detecte a concentração de proteínas por um Kit de Ensaio de Proteína BCA com leitor multimodo.
   1. Prepare-se para a determinação da curva padrão: diluir os 5 mg/mL de solução padrão proteica para 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/mL por água dupla destilada.
   2. Adicione 1 μL de supernasce de célula em uma placa de 96 poços e adicione 19 μL de água dupla destilada.
   3. Adicione 200 μL de soluções de detecção de BCA para cada poço. Incubar a 37 °C por 30 min. Detecte o valor de OD (densidade óptica) por um leitor multimodo com 562 nm. Calcule a concentração proteica (mg/mL) embora a curva padrão.
7. Corrija o teor atp por mg de concentração de proteína (unidade: concentração ATP/concentração de proteína, nmol/mg).

4. Avaliação do potencial da membrana mitocondrial (MMP) pelo JC-1

1. Coletar células HepG2 semeadas em placas de 6 poços. Digestão de células com 0,25% EDTA em tubo de EP de 1,5 mL, centrífuga a 1000 x g por 3 min, descarte o supernasce e colete células.
2. Adicione 50 μL de JC-1 (200X) a 8 mL de água destilada ao vórtice e misture. Adicione 2 mL de tampão de coloração JC-1 (5X) como solução de detecção JC-1.
3. Incubar células com uma mistura de 0,5 mL de cultura celular média e 0,5 mL de solução de detecção JC-1 para 20 min a 37 °C.
4. Centrifugar a 600 x g por 3 min a 4 °C. Descarte o supernaspeso.
5. Enxágüe em 2 alterações de 1 mL de tampão de tingimento JC-1 (1X), centrífuga a 600 x g por 3 min a 4 °C. E descarte o supernatante.
6. Suspender células em 0,5 mL de tampão de tingimento JC-1 (1X), analisar via citometria de fluxo para detectar fluorescência verde e vermelha. Quando o polímero JC-1 for detectado, defina a luz de excitação para 490 nm e a luz de emissão para 530 nm. Quando o polímero JC-1 for detectado, defina a luz de excitação para 525 nm e a luz de emissão para 590 nm.

5. Medições de taxas de consumo de oxigênio (OCR)

1. Células seed HepG2 em microplacões de cultura celular de 96-well a uma densidade de 4500 células /100 μL por poço. Certifique-se de células cobertas com cada poço após 24 horas.
2. Adicione o volume adequado dos reagentes preparados na porta de injeção apropriada, de acordo com a literatura anterior¹³. Porta A: 25 μL 1 μM de oligomicina (ATP Coupler); Porta B: 25 μL 0,75 μM de FCCP (Controle Eletrônico do Acelerador do Acelerador, ETC); Porta C: 25 μL 0,5 de μM antimicina A/rotenona (inibidor mitocondrial A e inibidor mitocondrial B).
3. Armazene cartucho em uma incubadora de 37 °C sem CO₂ até estar pronto para uso.
4. Faça uma mudança média da placa celular removendo o meio de funcionamento de cada poço e adicionando ao novo DMEM. O volume final para cada poço é de 180 μL.
5. Armazene a placa da célula em uma incubadora de 37 °C sem CO₂ por 1h antes do ensaio.
6. Grave o OCR automaticamente por software.
   1. Abra o software OCR.
   2. Escolha o Kit de Teste de Estresse Mito celular no menu suspenso aplicativos.
   3. Clique no botão Iniciar aplicativo.
   4. Clique no botão Teste de Estresse executar. A tela de configuração do teste de estresse celular é exibida.
   5. Faça as seguintes etapas:
      1. Digite o número de células semeadas por poço na caixa #de semeadura celular.
      2. Digite o OCR médio na caixa média de OCR basal.
      3. Digite a concentração final de trabalho para cada reagente e injete os reagentes.
         NOTA: O valor médio do OCR basal para a célula deveria ter sido detectado antes de executar o ensaio de otimização ao otimizar para concentração de semeadura celular.
      4. Clique no botão Seguinte. A tela de informações do grupo aparece.
      5. Atribua um grupo aos poços não atribuídos através da escolha de uma cor e da dando um nome e, em seguida, clique nos poços apropriados.
         NOTA: Os diferentes grupos são definidos como diferentes tratamentos antes da execução do Teste de Estresse Mito Celular. Todos os poços de microplacões receberão as mesmas injeções de reagente quando o teste de estresse for executado.
      6. Clique no botão Seguinte. A tela de layout de injeção de teste de estresse é exibida.
      7. Clique em Iniciar. O teste de estresse agora é executado no Analisador. Quando a corrida acabar, siga o ponto do software, remova e descarte o cartucho e a placa da célula.

Results

As mitocôndrias cristae de células HepG2 expostas a β-HCH foram marcadamente danificadas. Mitocôndrias dispersas foram levemente expandidas, de forma irregular e cume mitocondrial desaparecido com arquitetura mitocondrial relativamente anormal(Figura 1).

A intensidade média da fluorescência verde mitocondrial, que representa as mitocôndrias, diminuiu nas células HepG2 expostas ao β-HCH

Discussion

Fundamental para o sucesso do protocolo de detecção é o uso de uma variedade de métodos experimentais que foram cobertos do estudo do fenótipo ao mecanismo. Neste estudo, as células HepG2 foram cultivadas em DMEM com penicilina e estreptomicina e 10% de soro bovino fetal. Quando as células atingiram 40-50% de confluência, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) foram adicionadas e incubadas por 24 h. Em primeiro lugar, utilizamos o TEM que mostrou as alterações ultraestruturais no hepatocito causados pelos OCPs representativos, β-HCH, ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscópio eletrônico de transmissão	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	Imagens de alto contraste e alta resolução, Observação e imagens de baixa dose, Observação a baixa temperatura, Excelente desempenho analítico, Automação para conveniência e desempenho
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green é uma sonda fluorescente verde mitocondrial que pode ser usada para coloração fluorescente específica para mitocôndrias de células vivas.
Microscópio confocal de varredura a laser	Zeiss	700B	O design é compacto, estável, o caminho da luz é o mais curto, alta precisão de luz, tecnologia criativa e sofisticada tecnologia de varredura juntas para produzir uma imagem de espécime tridimensional perfeita.
Kit de Ensaio de ATP Aprimorado	Beyotime	S0027	O Kit de Ensaio de ATP Aprimorado pode ser usado para detectar níveis de ATP (adenosina 5'-trifosfato) em soluções, células ou tecidos comuns. As amostras de células e tecidos podem ser divididas para completar a preparação da amostra, a sensibilidade de detecção de até 0,1 nmol / L, a quimioluminescência pode ser mantida por 30 minutos.
Luminômetro	Berthold	Centro LB 960	O luminômetro é um detector de quimioluminescência, a amostra de teste em si pode ser leve, não precisa estimular. O luminômetro é o instrumento que detecta a quimioluminescência.
Kit de ensaio de proteína BCA	Beyotime	P0012	O kit de ensaio de proteína BCA é um dos métodos mais comumente usados para detectar concentrações de proteínas.
Leitor multimodo	TECAN	InfiniteM200	leitor multimodo pode ser usado para detectar a consonência de proteínas.