Este manuscrito apresenta um método detalhado para a geração X-cromossomo braço sondas e realizando fluorescência situ hibridação in (peixe) para examinar o estado da irmã coesão cromátide em prometafase e metáfase prendi Drosófila ovócitos. Este protocolo é apropriado para determinar se a coesão de braço meiótica é intacta ou interrompidos em diferentes genótipos.
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Artigo de método
Uso de hibridização in situ de fluorescência (FISH) para monitorar o estado da coesão do braço em oócitos de Drosophila na prometáfase e na metáfase I
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em humanos, erros de segregação do cromossomo em oócitos são responsáveis para a maioria dos abortos espontâneos e malformações congénitas. Além disso, como as mulheres envelhecem, o risco de conceber que um feto aneuploid aumenta dramaticamente e este fenómeno é conhecido como o efeito da idade materna. Um requisito para a segregação do cromossomo precisos durante as divisões meióticas é manutenção da irmã coesão de cromátides irmãs durante o período de prófase estendida que a experiência de oócitos. Citológicas em seres humanos e organismos modelo sugerem que a coesão meiótica deteriora-se durante o processo de envelhecimento. Além disso, erros de segregação em oócitos humanos são mais prevalentes durante a meiose I, consistente com a perda prematura da coesão do braço. O uso de organismos modelo é fundamental para desvendar os mecanismos subjacentes a idade-dependente perda de coesão. Drosophila melanogaster oferece diversas vantagens para estudar o Regulamento de coesão meiótica em oócitos. No entanto, até recentemente, apenas testes genéticos estavam disponíveis a ensaiar para a perda de coesão de braço em oócitos de genótipos diferentes ou em diferentes condições experimentais. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido usando fluorescência em situ hibridação (peixe) para visualizar diretamente os defeitos na coesão de braço em prometafase I e metáfase prendi Drosophila oócitos. Gerando uma sonda de peixe que se para o braço distal do cromossomo X e coletando pilhas de Z confocal, um pesquisador pode visualizar o número de sinais individuais de peixes em três dimensões e determinar se irmã cromátide braços são separados. O procedimento descrito torna possível quantificar defeitos de coesão braço em centenas de oócitos de Drosophila . Como tal, este método oferece uma importante ferramenta para investigar os mecanismos que contribuem para a manutenção da coesão, bem como os fatores que levam à sua extinção durante o processo de envelhecimento.
Introdução
Adequada segregação dos cromossomos durante a mitose e meiose exige que a irmã cromátide coesão ser estabelecido, mantido e lançado em uma coordenada1,2. Coesão é estabelecida durante a fase S e é mediada pelo cohesin complexo, que forma ligações físicas que segure a irmã cromátides irmãs juntos. Na meiose, coesão distal de um crossover também funções para armazenar recombinantes homologs juntos e esta associação física ajuda a garantir a adequada orientação do forma bivalente na metáfase eu do eixo (Figura 1)3,4,
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Protocolo
1. preparações
-
Prepare soluções para fluorescência em situ da hibridação (peixe). Prepare todas as soluções usando água ultrapura.
- Prepare-se 5 x tampão do Robb modificado: acetato de potássio 275mm acetato de sódio 200 mM, sacarose 500mm, glicose de 50 mM, 6 mM de cloreto de magnésio, cloreto de cálcio de 5 mM, pH de 500 mM HEPES = 7,4. Trazer o pH para 7,4 usando 10 N NaOH. Filtro de esterilizar e armazenar a-20 ° C. Descongelar e diluir a 1 x, conforme necessário e armazenar 1 alíquotas x a-20 ° C.
- Prepare a solução salina tamponada fosfato (PBS) usando 1.3 M NaCl, 70mm Na2HPO4, 30mm Na....
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Resultados
A Figura 5 apresenta imagens obtidas com uma sonda de braço que se a região citológica 6E-7B no cromossomo X . Este resulta da sonda em um sinal de que co localiza com o de DAPI, é facilmente distinguível do fundo e tem sido usada com sucesso para quantificar defeitos de coesão braço em diferentes genótipos de19. Quantificação de defeitos de coesão se restringia a prometafase I e metáfase eu estágios; oócitos antes da desagreg.......
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Discussão
O uso de peixes sondas para avaliar o estado da coesão de braço em prometafase I e metáfase eu Drosophila oócitos é um avanço significativo no campo da drosófila meiose. Historicamente, a drosófila pesquisadores foram limitados ao testes genéticos para inferir a perda prematura da coesão de braço em oócitos maduros11,18,19. Agora, com os métodos apresentados aqui, o estado da coesão do braço pode ser a.......
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Divulgações
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH Grant GM59354 atribuído a Sharon E. Bickel. Agradecemos Huy p. Nguyen assistência no desenvolvimento do protocolo para a geração de sondas fluorescentes braço, Ann Lavanway para ajuda com microscopia confocal e J. Emiliano Reed para assistência técnica. Agradecemos também a numerosos colegas na Comunidade da drosófila para discussões úteis e conselhos.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| < kits > fortes< / strong> | |||
| kit de preparação | Midi Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Kit completo de amplificação do genoma completo (WGA) | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 kit de rotulagem de DNA | Invitrogen | A21676 | Rótulo BAC clone DNA |
| PCR kit de purificação | Qiagen | 28104 | Remova o corante não conjugado após a rotulagem do DNA do clone BAC |
| strong>Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Chemicals & Soluções | |||
| Nota: Todas as soluções são preparadas com água ultrapura estéril e devem ser esterilizadas por autoclave ou esterilização por filtro. | |||
| Albumina de soro bovino (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Congelar alíquotas |
| Cloreto de cálcio | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4', 6-Diamidino-2-Fenilidol, dicloridrato) | Invitrogen | D1306 | Tóxico: use proteção adequada. Prepare 100µ g/ml de estoque em etanol 100%, armazenar em alíquotas a -20 °C. Preparar 1 ° C. g/ml em 2X SSCT antes da utilização. |
| Sulfato de Dextrano | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM estoque |
| dTTP (10 µ mol, 100 µ l) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Preparar estoque de 1 mM |
| EDTA (ácido etilenodiamina tetracético dissódico) | Fisher Scientific | S311-500 | Preparar estoque de 250 mM |
| 100% etanol (grau molecular, 200 provas) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Puro) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ácido etilenobis(oxietilenoenitrilo)tetracético) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldeído | Ted Pella, Inc. | 18505 | Tóxico: use proteção adequada |
| Formamida | Invitrogen | AM9342 | Tóxico: proteção adequada |
| Glicose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glicogênio | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptano | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: usa proteção adequada. |
| Ácido clorídrico | Millipore | HX0603-4 | Tóxico: use proteção adequada. |
| Hidroxilamina | Sigma | 438227 | Prepare 3 M estoque |
| 4.9 M Cloreto de magnésio | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poli-L-lisina (0,1 mg / ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Acetato de potássio | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Acetato de sódio | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare o estoque 3M |
| Cacodilato de sódio | Polysciences, Inc. | 1131 | Tóxico: use proteção adequada. Prepare o estoque de 400mM |
| Citrato de sódio | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Cloreto de sódio | Fisher Scientific | S271-3 | Cloreto de sódio |
| Sacarose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Soluções | |||
| Nota: Todas as soluções são preparadas com água ultrapura estéril e devem ser esterilizadas por esterilização em autoclave ou filtro. | |||
| Tampão | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8,0 | ||
| 20X SSC (Citrato de Sódio Salino) | 3 M NaCl, 300 mM de citrato de sódio | ||
| 2X solução | Tóxico: proteção adequada contra o desgaste. 200 mM de cacodilato de sódio, 200 mM de sacarose, 80 mM de acetato de sódio, 20 mM EGTA | ||
| 1,1X Tampão | de hibridização3.3X SSC, 55% formamida, 11% sulfato de dextrano | ||
| Solução | fixaTóxico: use proteção adequada. 4% formaldeído, 1X solução fixa de cacodilato | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Buffer de extração (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 & Micro; g/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0,1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamida | Toxic: usam proteção adequada. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 20% formamida | ||
| 2X SSCT + 40% formamida | Toxic: usam proteção adequada. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 40% formamida | ||
| 2X SSCT + 50% formamida | Tóxico: use proteção adequada. 2X SSC, 0,1% Tween 20, 50% formamida | ||
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Enzimas | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Vem com enzimas NEB | |
| 10X tampão NEB #2 | New England Biolabs | Tampão de digestão enzimática de restrição. Vem com enzimas NEB | |
| Terminal desoxinucleotidil transferase (TdT) 400 U/µ l | Roche / Sigma | 3333566001 | |
| TdT tampão | Roche / Sigma | Vem com enzima TdT | |
| Cloreto de cobalto Roche | / Sigma | < forte > Tóxico: < / forte proteção adequada > desgaste. Vem com enzima TdT | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Ferramentas de citologia etc. | |||
| Fórceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9" Pipetas de vidro descartáveis Pasteur | Fisher | 13-678-20C | Autoclave para esterilizar |
| dissecação de vidro raso | Feito sob medida | ||
| Prato de poço profundo (3 poços) | Pyrex | 7223-34 | |
| Lâminas de microscópio Fisherfinest Premium | Fisher Scientific | 22-038-104 | Usado para cobrir pratos de poços |
| profundos Lâminas de vidro fosco, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Corrediças de vidro, 3 x 1 pol, 1 mm de espessura | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Lamínulas, 10 x 10 mm, nº 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| de | tungstênio | ||
| Prolongar mídia de montagem GOLD | Sondas Moleculares | P36930 | |
| Ar comprimido em lata | Vários | ||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento | |||
| PCR | Vários | ||
| Nanodrop 2000, espectrofotômetro Espectrofotômetro | Thermo-Scientific | ||
| Vortexer | Várias | ||
| microcentrífugas de mesa à temperatura ambiente | Várias | ||
| microcentrífugas de mesa a 4 ° C | Vários | ||
| Bloco de calor | Vários | ||
| Forno de hibridização ou incubadora com rotador | Vários | ||
| Nutator | Vários | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Óleo Nikon | 40X Plano Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Consumíveis etc. | |||
| 50 mL | Vários | ||
| tubos cônicos de 15 mL | Vários | ||
| tubos de microfuga de 1,5 mL | Vários | ||
| 500 µ l tubos de microfuga | Vários | ||
| 200 µ l Tubos de PCR | Vários | ||
| recipientes de plástico com tampa apertada | Vários | Para segurar Drierite | |
| Kimwipes | Vários | lenços descartáveis | |
| Parafilm | Vários | filmes de parafina | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Outros | |||
| HPLC purificados com oligonucleotídeos marcados com 5' | Sondas integradas marcadas com Cy3 da DNA Technologies que reconhecem a repetição satélite de 359 pb do cromossomo X | ||
Referências
- Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Buonomo, S. B., et al.
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Reimpressões e permissões
