É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Avaliação de terapias de células-tronco em um modelo de lesão do tendão patelar Bilateral em ratos

10.7K visualizações

DOI:

10.3791/56810

30 de março de 2018

 ,  ,  ,  , 

Autores correspondentes: Dominique J. Griffon <dgriffon@westernu.edu>

Neste artigo

Resumo

Este paper descreve a preparação e avaliação do cordão umbilical células-tronco mesenquimais derivadas de matriz de esferoides com um modelo de defeito bilateral do tendão patelar em um rato. Este modelo foi associado com uma morbilidade aceitável e foi encontrado para detectar diferenças entre tendões tratados e não tratados e entre os dois tratamentos testado.

Resumo

Medicina regenerativa fornece novas alternativas às condições que desafiam os tratamentos tradicionais. A prevalência e morbidade de tendinopatia em toda a espécie, combinada com as propriedades curativas limitadas deste tecido, ter solicitado a busca de terapias celulares e impulsionou o desenvolvimento de modelos experimentais para estudar a sua eficácia. Cordão umbilical matriz-derivados mesenquimais células-tronco (UCM-MSC) são candidatos atraentes porque eles são abundantes, fácil de coletar, contornar as preocupações éticas e o risco de formação de teratoma, ainda assemelham-se a células-tronco embrionárias primitivas mais pròxima do que adulto derivado de tecido MSCs. significativo interesse centrou-se na quitosana como uma estratégia para melhorar as propriedades do MSCs através da formação de esferoide. Este papel detalhes técnicas para isolar a UCM-MSCs, preparar esferoides no filme de quitosana e analisar o efeito da formação de esferoide na expressão do marcador de superfície. Consequentemente, a criação de um modelo de lesão do tendão patelar bilateral em ratos é descrita para implantação na vivo de esferoides UCM-MSC formada-se em filme de quitosana. Nenhuma complicação foi observada no estudo em relação a morbidade, estresse crescentes efeitos, ou infecção do tecido. O escore funcional total dos ratos operados em 7 dias foi menor do que ratos normais, mas retornou ao normal dentro de 28 dias após a cirurgia. Golo de histológico da cicatrização tecidual confirmou a presença de um coágulo em defeitos tratados avaliada em 7 dias, ausência de reação de corpo estranho e progredindo cura em 28 dias. Este modelo de defeito do tendão patelar bilateral controla variação inter-individual, através da criação de um controle interno em cada rato, foi associado com morbidade aceitável e permitiu a deteção das diferenças entre os tendões não tratados e tratamentos.

Introdução

Lesão no tendão é uma das causas mais comuns de significativa atrofia muscular e dor em toda a espécie1. Em medicina veterinária, lesões de tendões e ligamentos são de especial interesse em cavalos, 82% de todas as lesões em cavalos de corrida envolvem o sistema músculo-esquelético, e 46% daqueles afetam os tendões e ligamentos2,3. Formação de tecido cicatricial afeta as propriedades biomecânicas dos tendões cicatrizadas e explica o prognóstico guardado para retorno ao Atlético uso após lesões dos tendões flexores; re-ferimento ocorre dentro de 2 anos em até 67% de cavalos tratados cons....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) de Western University of Health Sciences e institucional Cuidado Animal.

1. isolamento e expansão de MSCs da matriz equina do Cordão Umbilical

  1. Obter a placenta de uma égua adulta (grávida), depois observou parto e isolar assepticamente o cordão umbilical da placenta. Mantenha o cordão umbilical em solução salina tamponada fosfato (PBS) com 1% penicilina-estreptomicina (P/S) a 4 ° C durante a transferência até o processamento.
  2. Lavar o cordão umbilical duas vezes com temperatura PBS com 1% P/S em um tubo de 50 mL. Secção do cordão umbilical em fragm....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

No estudo atual, os resultados são apresentados como média ± DP (desvio padrão). As células foram isoladas a partir do cordão umbilical de 6 mares e porcentagem de linhas de células isoladas expressando cada marcador de superfície celular sob condicionamento standard ou quitosana foram comparados com um teste de Friedman, como uma análise de variância não-paramétrica com repetidas medidas. Para a criação de modelo de defeito do tendão, 8 ratos foram utilizados para avaliação de pós-operat.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Células de equinos foram Selecionadodas para este projeto porque pretendemos eventualmente testar abordagens de candidato na gestão de tendinopatias naturais em cavalos. De fato, lesões dos tendões em cavalos são atraentes como modelos naturais de tendinopatia no homem por causa da similaridade biológica entre os equino flexor digital superficial e tendão de Aquiles em seres humanos41. Marcadores superfície celular CD44, CD90, CD105, CD34 e MHC II foram selecionados para immunophenotyping das célu.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de reconhecer o Dr. Su, PhD, a análise estatística dos dados. Os autores também agradecer Dr. McClure, DVM, PhD DACLAM, seus conselhos sobre a anestesia e dor gestão protocolos usados no estudo. Este projecto foi apoiado por concessões do Western University of Health Sciences escritório do Vice-Presidente de pesquisa (12678v) e USDA seção 1433 fundos (2090).

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PBS 10xHycloneSH30258.01Consumível
Colgenase tipo IAWorthingtonLS004197Consumível
DMEM baixa glicoseHycloneSH30021. Soro
bovino fetalFS HycloneSH30910.03
Penicilina/estreptomicina consumível 100xHycloneSV30010Tripsina
consumível 0,25%HycloneSH30042,01Consumível
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104Consumível
Trypan azulHycloneSV30084.01Consumível
Dimetil SulfóxidoSigmaD2650
QuitosanaConsumível SigmaC3646
Hidróxido de SódioSigmaS8045Consumível
Albumina de Soro BovinoConsumível HycloneSH30574.01Consumível
Tubo de poliestireno de fundo redondoCorning149591AConsumível
Rato anti-cavalo CD44 (FITC)AbD serotecMCA1082FConsumível
Rato anti-rato CD90 (FITC)AbD serotecMCA47FTConsumível
Rato anti-cavalo MHC-II (FITC)AbDserotecMCA1085F
Consumível Rato IgG1 (FITC) - Controle de IsotipoAbD serotecMCA928F
Consumível Rato monoclonal [SN6] a CD105 (FITC)abcamab11415Consumível
Mouse IgG1 (FITC) - Controle de Isotipoabcamab91356
Consumível Mouse anti-humano CD34 (FITC)BDBDB560942
Consumível Mouse IdG1 kappa (FITC)BDBDB555748Consumível
7-AADBDBDB559925Consumível
BD Accuri C6 Citômetro de FluxoBDEquipamento
Vacutainer 5 mLMed Vet InternationalRED5.0Consumível
Ácido-citrato-dextroseSigmaC3821Consumível
Cloreto de CálcioSigmaC5670Consumível
SevofluranoJD Medical60307-320-25Consumíveis
RatosCharles RiverCódigo de cepa: 400Animal experimental
Kit cirúrgico de ratoAparelho de Harvard728942
Equipamento Lâmina Cirúrgica #15MEDLINEMDS15115Consumível
Rat MD's Baytril (2 mg/Comprimido),
Rimadyl (2 mg/Tablet)
Bio ServF06801Consumível
Polyglactin 910, 5-0EthiconJ436GConsumível
Eosin alchol shandonThermo Consumível científicode 6766007
Harris HematoxilinaThermo143907consumível
consumível Consumível científico

Referências

  1. Rossdale, P. D., Hopes, R., Digby, N. J., offord, K. Epidemiological study of wastage among racehorses 1982 and 1983. Vet Rec. 116 (3), 66-69 (1982).
  2. Black, D. A., Tucci, M., Puckett, A., Lawyer, T., Benghuzzi, H. Strength of a new method of achilles tendon repair in the rat - ....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Terapia com C lulas TroncoModelo de RatoMSCs do Cord o UmbilicalFilme de QuitosanaForma o de EsferoidesIsolamento CelularProcedimento Cir rgicoAn lise Histol gicaRecupera o Funcional