Method Article

Criando um modelo geométrico de elementos finitos estruturalmente realista de um casos para estudar o papel da arquitetura celular em casos de biologia de sistemas

DOI:

10.3791/56817

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April 18th, 2018

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1Cell Structure and Mechanobiology Group, University of Melbourne, 2Systems Biology Laboratory, Melbourne School of Engineering, University of Melbourne, 3Department of Biomedical Engineering, University of Melbourne, 4School of Mathematics and Statistics, Faculty of Science, University of Melbourne, 5Department of Engineering Science, University of Auckland, 6Advanced Microscopy Facility, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 7ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of Melbourne, 8School of Medicine, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 9Living Systems Institute, University of Exeter

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um método novo para criar um modelo de elementos finitos espacialmente detalhada da arquitetura intracelular do cardiomyocytes de imagens de microscopia confocal e microscopia eletrônica. O poder deste modelo espacialmente detalhada é demonstrado usando estudos de caso em sinalização de cálcio e Bioenergética.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Com o advento das tecnologias de imagem tridimensionais (3D) como a tomografia computadorizada do elétron, serial-bloco-rosto varredura, microscopia eletrônica e microscopia confocal, a comunidade científica tem acesso sem precedentes aos grandes conjuntos de dados no sub-micrônicas resolução que caracterizam a remodelação arquitectónica que acompanha as alterações em função de casos na saúde e na doença. No entanto, esses conjuntos de dados tem sido subutilizado para investigar o papel da arquitetura celular remodelação em função de casos. O propósito do presente protocolo é delinear como criar um modelo de elementos finitos precisos de um casos usando imagens de microscopia confocal e microscopia eletrônica de alta resolução. Um modelo detalhado e preciso de arquitetura celular tem um potencial significativo para fornecer novos insights sobre biologia de casos, mais do que podem reunir experiências sozinhos. O poder deste método reside na sua capacidade de fundir computacionalmente informações de duas modalidades de imagens díspares da ultraestrutura de casos para desenvolver um modelo unificado e detalhado dos casos. Este protocolo descreve etapas para integrar o tomography do elétron e imagens de microscopia confocal de cardiomyocytes masculino adulto do rato Wistar (nome de uma raça específica de rato albino) para desenvolver um modelo de elementos finitos de metade-sarcômero dos casos. O procedimento gera um modelo de elementos finitos 3D que contém uma representação exata, de alta resolução (da ordem de ~ 35 nm) da distribuição das mitocôndrias, miofibrilas e clusters de receptor de ryanodine que liberam o cálcio necessário para casos contração da rede reticular sarcoplasmic (SR) no compartimento citosólico e Miofibrilha. O modelo gerado aqui como uma ilustração não incorporar detalhes da arquitetura do túbulo transverso- ou a rede reticular sarcoplasmic e, portanto, é um modelo mínimo dos casos. No entanto, o modelo já pode ser aplicado em investigações baseada em simulações sobre o papel da estrutura celular em bioenergética mitocondrial e sinalização cálcio, que é ilustrada e discutido usando dois estudos de caso apresentados a seguir o Protocolo detalhado.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Acoplamento excitação-contração (ECC) no coração refere-se a importante e intrincada de acoplamento entre a excitação elétrica da membrana casos e a subsequente contração mecânica da célula durante cada batimento cardíaco. Modelos matemáticos têm desempenhado um papel chave no desenvolvimento de uma compreensão quantitativa dos processos bioquímicos interligados que regulam o potencial de ação1, cálcio citosólico sinalização2, bioenergética,3e subsequente geração de força contrátil. Tais modelos previram também com êxito as alterações para o batimento cardíaco quando um ou vários destes processos bioquímicos sofrem alterações4,5. A ultraestrutura altamente organizado dos casos cada vez mais tem sido reconhecida a desempenhar um papel crítico na função contrátil normal da célula e de todo o coração. Com efeito, alterações da morfologia e organização dos componentes da ultraestrutura cardíaca ocorrem em paralelo com as alterações bioquímicas em condições de doença como hipertrofia6, insuficiência cardíaca7e cardiomiopatia diabética8. Se essas mudanças estruturais são menores, adaptáveis ou patológicas respostas à mudança da condições bioquímicas ainda é em grande parte desconhecido9. O acoplamento inerentemente apertado entre forma e função em biologia significa que estudos experimentais sozinhos não podem fornecer percepções mais profundas do que as correlações entre remodelação estrutural e função de casos. Uma nova geração de modelos matemáticos que pode incorporar a montagem estrutural dos componentes sub celulares, juntamente com os processos bioquímicos bem estudados, são necessários para desenvolver uma compreensão abrangente da relação quantitativa entre estrutura, bioquímica e força contrátil em cardiomyocytes. Este protocolo descreve métodos que podem ser usados para gerar modelos de elementos finitos estruturalmente precisos dos cardiomyocytes que pode ser usado para tais investigações.

A última década viu avanços significativos em microscopia 3D10confocal11e de microscopia de super-resolução12 que fornecem insights sem precedentes, de alta resolução em Assembleia nano-escala e micro escala do componentes sub celulares dos casos. Recentemente, esses conjuntos de dados têm sido utilizados para gerar modelos computacionais de casos ultraestrutura13,14,15,16. Estes modelos de usam um método de simulação engenharia bem estabelecida, chamado o método de elementos finitos17, para criar elementos finitos malhas computacionais sobre quais processos bioquímicos e casos contrações podem ser simuladas. No entanto, estes modelos são limitados pela resolução e detalhe que um método de microscopia pode fornecer um conjunto de dados de imagem. Por exemplo, microscopia eletrônica pode gerar nanômetros-nível detalhe de estrutura celular, mas é difícil identificar proteínas específicas dentro da imagem do que seria necessário para criar um modelo. Por outro lado, a microscopia óptica de super-resolução pode fornecer imagens de alto contraste em resoluções da ordem de 50 nm de somente um seleto poucos molecular componentes da célula. Somente integrando informações complementares a partir dessas modalidades de imagem um pode realisticamente explorar a sensibilidade da função de mudanças na estrutura. Correlativo luz e microscopia eletrônica ainda, não é um procedimento de rotina, e ele ainda iria sofrer a limitação que apenas um número limitado de componentes pode ser manchado na exibição de imunofluorescência e correlacionado com a exibição de microscopia eletrônica.

Este protocolo apresenta uma nova abordagem18 que usa métodos estatísticos19 para analisar e computacionalmente fusível fotomicroscopia informações sobre a distribuição espacial dos canais iônicos com microscopia eletrônica informações sobre outro cardíaco componentes de ultraestrutura, como miofibrilas e mitocôndrias. Isso produz um modelo de elementos finitos que pode ser usado com modelos biofísicos de processos bioquímicos para estudar o papel da organização sub celular de casos sobre os processos bioquímicos que regulam a contração de casos. Por exemplo, este protocolo pode ser usado para criar modelos de saudável e induzido por estreptozotocina diabéticos miócitos para estudar o efeito da remodelação estrutural em função de célula cardíaca que é observada em animais diabéticos modelos8. Uma vantagem adicional da natureza estatística do método apresentado também é ilustrada no protocolo: o método pode gerar várias instâncias de geometrias de elementos finitos que imitam de perto as variações observadas experimentalmente na estrutura celular.

Como uma visão geral, as etapas do protocolo incluem: (i) preparação do tecido cardíaco por microscopia eletrônica de varredura gerar imagens 3D com suficiente resolução e contraste; (ii) reconstrução e segmentação de pilhas 3D imagem de microscopia eletrônica de dados usando uma reconstrução 3D de microscopia eletrônica e software de análise de imagem chamaram IMOD20; (iii) usando iso2mesh21 para gerar uma malha de elementos finitos usando os dados segmentados como entrada; (iv) usando o algoritmo de romance e códigos para mapear a distribuição de canais de íon para a malha de elementos finitos.

A premissa da abordagem de cada passo é descrita dentro do protocolo, e resultados representativos são fornecidos nas figuras que acompanha. Uma visão geral é descrita especificando como os modelos espacialmente detalhados gerados podem ser usados para estudar a dinâmica espacial de cálcio durante o ECC, bem como a bioenergética mitocondrial. Algumas das limitações atuais do protocolo são discutidas, bem como novos desenvolvimentos que estão em andamento para superá-los e avançar ainda mais uma compreensão quantitativa do papel da estrutura celular para a biologia de sistemas cardíaco. Como esses métodos podem ser generalizados para criar modelos de elementos finitos de outros tipos de célula também é abordado.

Usuários do presente protocolo podem ignorar a etapa 1 e a parte da reconstrução da etapa 2 se eles têm acesso a uma pilha de imagem de microscopia eletrônica pre-existente. Usuários que pretendem adquirir seus dados em colaboração com os mais experientes microscopistas elétron podem desejar discutir e comparar a fixação e coloração procedimentos na etapa 1, com o perito para determinar um protocolo ideal para aquisição.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela Universidade de Auckland Comitê de ética Animal e o Comité de uso, onde o protocolo de tecido foi originalmente desenvolvido e Universidade da Califórnia em San Diego cuidados institucionais do Animal.

1. preparação experimental

  1. Prepare soluções estoque de 0,15 M e 0,3 M de sódio buffers de cacodylate em pH 7,4, de acordo com a tabela 1.
  2. Preparar o fixador de glutaraldeído (2% paraformaldeído (PFA) + glutaraldeído 2,5% + 0,2% ácido tânico no buffer de cacodylate de sódio 0,15 M pH 7,4) usar componentes listados na tabela 1.
    1. Dissolva 2 g de pó PFA em 20 mL de água destilada a 60 ° C em uma placa de aquecimento com agitação constante.
    2. Adicione solução de NaOH 1 M até que a solução é clara.
    3. Espere até que a temperatura da solução está abaixo de 40 ° C e, em seguida, adicionar 10 mL de glutaraldeído e 20 mL de cacodylate de sódio 0,3 M.
    4. Adicionar 0,2 g de ácido tânico e dissolvê-lo na solução.
    5. Adicione 50 mL de cacodylate de sódio 0,15 M.
    6. Loja três ou quatro frascos de cintilação de 20 mL de fixador na geladeira a 4 ° C, ou no gelo, se usado no mesmo dia.
  3. Prepare a solução de Tyrode com 20mm 2,3-butanodiona monoxime (BDM), de acordo com a receita na tabela 1.
  4. Construa um aparelho de Langendorff dentro de uma hotte.
    1. Prenda dois tubos de seringa plástica de 100 mL a dois stands diferentes retorta, cerca de 70 cm de altura desde a base do carrinho.
    2. Conecte os tubos de seringa de plástico e um tubo conector usando 3 mm-diâmetro interno de tubos e uma torneira de três vias, conforme mostrado na Figura 1.
    3. Cabe uma cânula de diâmetro externo de 3 mm para o fundo do conector do tubo, onde o coração vai ser amarrado para fixação de perfusão.
  5. Encher os tubos de seringa com solução de Tyrode e soluções fixador a 37 ° C.
    1. Remova as bolhas de ar dentro da tubulação passando as soluções da seringa através deles.

2. adquirir dados de microscopia eletrônica da ultraestrutura de casos

  1. Prepare o animal para excisão e fixação química do coração.
    Nota: Este protocolo detalha os passos para processar adultos machos Wistar (nome de uma raça específica de rato albino) rato tecido cardíaco. O protocolo pode exigir modificações quando o tecido cardíaco é originária de outras espécies.
    1. Anestesia o animal, tratando o rato (200-250 g de peso corporal) com 0,5 mL de heparina de U/mL 250 através da injeção intraperitoneal. Aguardar 10 min e, em seguida, tratar o rato com injeção intraperitoneal de pentobarbital (210 mg/kg de peso corporal).
    2. Confirme um grau adequado de anestesia por testar o reflexo de pitada de dedo do pé.
    3. Eutanásia do animal por deslocamento cervical.
    4. Colheita do coração usando dissecação procedimentos semelhantes a artigos previamente publicados de JoVE22,23, coloque-o em solução salina gelada.
    5. Isolar a aorta ascendente e Canule. Certifique-se de que a ponta da cânula senta-se logo acima da válvula semi lunar, onde se ramificam das artérias coronárias. Amarre um fio firmemente em torno da aorta ascendente.
    6. Ligar a cânula ao aparelho movido a gravidade Langendorff operado a ~ 70 cm acima da base do sistema (Figura 1).
    7. Gire a torneira no sistema Langendorff para perfundir o coração com solução de Tyrode, incluindo 20 mM BDM (um inibidor de miosina) por 2-3 min.
    8. Gire a torneira para iniciar a perfusão com fixador de 2% paraformaldeído, glutaraldeído 2,5% e 0,2% ácido tânico em cacodylate de sódio 0,15 M a 37 ° C por 10 min. Se for bem-sucedido, o coração girará marrom pálido e tornar-se duro e emborrachada.
    9. Usando uma lâmina de barbear, dissecar blocos de tecido da parede ventricular esquerda (lateral) livre e obter tecido bloqueia cerca de 1 mm3 no tamanho.
    10. Armazenar as amostras em frascos de 20ml pre-cooled cintilação do mesmo fixador no gelo por 2 h. armazenam tantas amostras quanto possível, os frascos e assegurar que as amostras estão submersos na solução.
      Atenção: É importante manter amostras frio até após a etapa de desidratação 100% abaixo.
  2. Mais fixação e coloração de amostras para microscopia eletrônica.
    1. Despeje 100 mL de tampão de cacodylate de sódio 0,15 M num copo de vidro e resfriá-lo no gelo.
    2. Prepare-se volumes iguais de cacodylate de sódio tetróxido de ósmio e 0,3 M 4%, seguido pela adição de 0,08 g de ferrocianeto de potássio para fazer uma heavy metal mancha solução de ferrocianeto de potássio 2% em 2% tetróxido de ósmio e 0,15 M de sódio cacodylate. Legal a solução no gelo.
    3. Pipetar o fixador para fora e substituí-lo com bastante frio 0,15 M de sódio cacodylate o buffer para submergir as amostras em frascos. Coloca os frascos no gelo por 5 min.
    4. Repita a etapa 2.2.3 quatro vezes mais com cacodylate de sódio 0,15 M para remover o excesso fixador.
      Atenção: Não utilize pipetas de vidro porque pequenos pedaços podem entrar a amostra e podem arruinar bisturis de diamante durante o corte de bloco de tecido. É importante arrefecer pre-todas as soluções no gelo antes de adicioná-los à amostra. Também é importante que a amostra permanece coberta pela solução de todos os tempos (muito breves períodos de cobertura parcial, durando não mais que alguns segundos podem ser brevemente tolerados durante as trocas de solução). Quando lavar ou substituição de soluções, adicione a nova solução rapidamente após a remoção da solução anterior. Manter os frascos de cintilação no gelo entre lavagens. Note que este passo não é tempo sensível, os blocos de tecido podem ser lavados ligeiramente mais longos, se necessário.
    5. Substituir o buffer de cacodylate de sódio com solução de mancha gelada de heavy metal e armazená-lo no gelo durante a noite. Certifique-se de que o ferrocianeto é bem misturado, agitando o frasco com a mão; a solução deve ficar preta.
      Cuidado: Trabalho na coifa ao realizar essa etapa porque o ósmio é tóxico.
    6. Dilua 4% solução aquosa de uranilo acetato (UA) (tabela 1) para 2% usando volumes iguais de estoque solução UA e água bidestilada e esfriá-lo no gelo.
    7. Substituir a mancha de heavy metal com buffer de cacodylate de sódio 0,15 M resfriado e deixar a amostra incubar durante 5 min no gelo.
    8. Repita a etapa 2.2.7 quatro vezes mais no gelo para enxaguar qualquer solução de mancha de excesso de heavy metal.
    9. Lavar as amostras quatro vezes, com um período de espera de 2 min entre em água purificada (bidestilada é suficiente).
    10. Substituir a água purificada com gelada 2% UA e deixar a amostra incubam por 60-120 min no gelo.
    11. Arrefecer cinco frascos de cintilação de 20 mL de etanol (o suficiente para submergir amostras) no gelo que será usado na etapa de desidratação. Os seis frascos têm percentagens crescentes de etanol em água destilada: 20%, 50%, 70%, 90% e 100%.
    12. Despeje acetona pura outro frasco de 20 mL cintilação e cool no gelo junto com os frascos de etanol.
    13. Lave as amostras em água purificada quatro vezes com períodos de espera de 2 min no gelo para lavar o excesso UA.
  3. Desidrata-se amostras em etanol.
    1. Desidratar em série de álcool etílico frio substituindo sucessivamente solução dentro do frasco de amostra da seguinte forma, no gelo: etanol 20% por 10 min; etanol a 50% por 10 min; etanol a 70% por 10 min; etanol a 90% por 10 min; em seguida, duas vezes em 100% de etanol por 10 min.
    2. Amostra à temperatura de transição, substituindo o final 100% de etanol com refrigeração acetona pura e coloque o frasco da amostra em uma bancada de laboratório de temperatura por 10 min.
    3. Realize uma lavagem mais de 10 min em acetona pura à temperatura ambiente para remover a condensação que é observável dentro os frascos. Durante a incubação, compõem as soluções acetona/resina.
    4. Substitua a acetona pura em frascos com 50: 50 pura acetona e resina epóxi (com proporções de componentes da resina epóxi conforme indicado pelo fabricante). Use todos os componentes do mesmo lote. Deixe os frascos de amostra cheio de resina durante a noite em um rotor.
  4. Incorpore amostras em resina.
    1. Substituir a resina de 50: 50 com 75% de resina (25% de acetona) e incube por 3 h, seguido de incubação adicional/infiltração em 100% resina para 4 h à temperatura ambiente.
    2. Substitua a resina 100% fresco 100% de resina e deixar os frascos de amostra durante a noite para uma penetração mais profunda da resina para as amostras de tecido.
    3. Tirar amostras os frascos e colocá-los em recipientes que são forno-amigáveis e tem uma superfície plana; alumínio ou folha de prata copos de cozimento pode ser usada para essa finalidade, por exemplo.
    4. Despeje delicadamente (para evitar o deslocamento das amostras) fresco resina sobre as amostras (assim, a incorporação de amostras em resina) e polimerizar a resina e amostras em estufa a 60 ° C por 48 h.
  5. Reoriente os blocos de resina para células de imagem em corte transversal.
    1. Obter 1 µm teste espessas seções de blocos de resina usando um ultramicrotome com uma faca de vidro para avaliar célula orientação24.
    2. Manchar as seções do teste de espessura por 20 s com 1% de tolueno azul e 1% de bórax.
    3. Examine a orientação de célula muscular sob um microscópio de campo claro.
    4. Com base na orientação inferida a partir das imagens das seções manchadas de teste, re-orientar longitudinalmente ou obliquamente orientada (semelhante a Figura 2A) blocos para garantir que as células são expostas a faca o vidro para que eles serão cortados em corte transversal (de resina semelhante a Figura 2B).
  6. Secções de tecido imagem usando tomografia de elétrons.
    1. Obter cortes semifinos (~ 300 nm) do tecido reorientado blocos usando um diamante de faca e transferir as seções em grelhas de cobre25.
    2. Manche as seções espessas com 2% UA e Sato chumbo25.
    3. Aplicam-se as partículas de ouro coloidais em ambos os lados das seções25.
    4. Obter conjuntos de série único ou duplo eixo de inclinação de imagens projetadas de-70 ° a + 70 °25.
  7. Usar o IMOD20 para reconstruir a pilha de imagem 3D (uma série de imagens em 2D que fornecem as informações 3D da seção de tomografia computadorizada por um único elétron) da célula. Esta pilha reconstruída vai ser segmentada na próxima etapa.

3. segmento de miofibrilas e mitocôndrias regiões do conjunto de dados EM imagem 3D

  1. Execute o programa IMOD "3dmod".
  2. Dentro da interface do usuário gráfica 3dmod, digite o endereço do "REC" ou ".mrc" arquivo que contém o 3D reconstruída imagem dataset da célula (gerada na etapa 2.7) na caixa de entrada rotulada "arquivo (s) da imagem:", em seguida, pressione "Okey".
  3. No menu "File", selecione o novo modelo e, em seguida, salve o arquivo com um nome apropriado, usando o modelo como "salvar"... item do menu "Arquivo".
    Nota: Um objeto em IMOD pode conter uma coleção de componentes segmentados que compõem o "objeto". Por padrão, um novo modelo contém um novo objeto com o id "#1".
  4. Sob o menu "Especial", selecione "Ferramentas de desenho". Isto irá abrir uma nova barra de ferramenta semelhante ao mostrado na Figura 3A.
    Nota: Existem várias ferramentas que podem ser usadas para criar contornos em torno dos limites de organela diferente. Mais ajuda sobre maneiras de usar estas ferramentas encontram-se na documentação do20 IMOD.
  5. Escolha a opção "Sculpt" no menu "Ferramentas de desenho" e mova o mouse sobre a janela de imagem; um contorno circular centrado sobre o ponteiro do mouse aparecerá.
  6. Pressionando o botão do meio do mouse sobre uma mitocôndria (as regiões mais escuras dos arquivos de imagem, como ilustrado por demarcações com linhas de contorno verdes na Figura 3A), arraste o perímetro do contorno do círculo para a forma do seu limite.
  7. Concluído o contorno do limite da mitocôndria, solte o botão do meio e repita as etapas de 3.6 para cada mitocôndria nos dados. Cada contorno será automaticamente reconhecido pelo IMOD como um novo contorno dentro do mesmo objeto.
  8. Sob o "Editar | Objeto "no menu, selecione"Novo"para criar um novo objeto. Isto irá automaticamente incrementar o número total de objetos por um e atribuir este número para o novo objeto.
  9. Repita as etapas de 3.6 e 3.7 para segmentar e salvar Miofibrilha contornos.
  10. Repita a etapa 3,8, seguida pelo passo 3.6, segmentar o limite da célula também.
  11. Salve o arquivo de modelo no menu "File".
  12. Execute os seguintes comandos em uma janela de linha de comando para converter cada objeto de agrupamento em uma máscara binária, conforme ilustrado na Figura 4A C.
    1. Extrair um objeto específico a partir do modelo "imodextract objeto modelfile outputmodelfile" onde o "objeto" é o número do objeto a ser extraído.
    2. Criar uma máscara para esse objeto: imodmop-máscara 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
    3. Converter o arquivo em uma pilha de tif: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif

4. criar uma malha de elementos finitos de componentes segmentados

  1. Iso2mesh é um programa MATLAB livremente disponível para converter pilhas de imagem TIFF em malhas de elementos finitos tetraédrica volumétrico. Faça o download e adicionar iso2mesh para o caminho do MATLAB de iso2mesh.sourceforge.net.
  2. Baixe os códigos-fonte e dados para simular RyR aglomerados na malha do github site https://github.com/CellSMB/RyR-simulator.
  3. Inicie o aplicativo CardiacCellMeshGenerator MATLAB (Figura 5).
  4. Carrega as máscaras de componente de organela diferente em MATLAB usando os três botões no lado superior esquerdo do GUI.
  5. Crie uma outra pilha de imagem binária que demarca as lacunas entre as miofibrilas e mitocôndrias, como mostrado na figura 6A.
    1. Abra o ImageJ.
    2. Usando o arquivo | Abrir caixa de diálogo, carregar as pilhas de tiff miofibrilas e mitocôndrias para o programa.
    3. Iniciar o plugin de adição de imagem selecionando "processo | Calculadora mais ".
    4. Selecione a pilha de imagem Miofibrilha como i1, as mitocôndrias pilha como i2 de imagem e escolha o operador de "Adicionar". Clique em "Okey".
    5. Depois de uma nova pilha de imagem que representa o resultado de 4.5.4 aparece, selecione "Editar | Inverta"para produzir uma pilha de imagem semelhante à figura 6A.
  6. Carrega o arquivo que contém a pilha de imagem binária das lacunas entre miofibrilas e mitocôndrias pressionando o botão de "RyRGapsFile" sobre o programa de CardiacCellMeshGenerator.
  7. Pressione "Gerar malha" o GUI. Isto irá disparar o iso2mesh v2m de comando com a opção 'cgalmesh' para gerar uma malha tetraédrica similar a Figura 4E. Três arquivos será saída no final desta etapa: um arquivo de .ele, um arquivo de face e um arquivo de .node que irá conter a listagem de nós que compõem os elementos, os nós que compõem as faces e as coordenadas de nós , respectivamente.

5. matematicamente mapear espacialmente diferentes densidade de canais iônicos de interesse para a malha de elementos finitos.

  1. Gere os insumos necessários para o simulador RyR pressionando o botão rotulado entradas de gerar RyR-simulador na GUI.
    Nota: O botão irá acionar uma função generateRyRsimulatorInputs.m, que usa as seguintes informações da etapa 4 para gerar as entradas:
    (1) outDir: a localização de arquivos de saída que são necessárias para a simulação de cluster RyR.
    (2) imres: a resolução do pixel nas três direções de pilhas de imagem.
    (3) myofibril_file: o arquivo que contém a pilha de imagem binária como o mostrado na Figura 4B.
    (4) sarcolemma_file: o arquivo que contém a pilha de imagem binária como o mostrado na Figura 4A.
    (5) ryrgaps_file: o arquivo que contém a pilha de imagem binária como o mostrado na Figura 5A.
    1. Após esta função executa, verificar que foram criados os seguintes arquivos dentro do diretório especificado como o caminho outDir:
    • d_axial_micron.txt, que representa a distância axial entre a posição do disco-z e o restante dos pixels na pilha de imagem.
    • d_radial_micron.txt, que representa a distância euclidiana (excluindo a componente axial) de cada pixel no conjunto de possíveis locais de cluster RyR para os pixels no avião z-disco.
    • W_micron.txt, que representa a lista de coordenadas espaciais de todas as posições disponíveis para clusters de RyR para estar presente.
    • Os restantes 3 arquivos na pasta contêm o sufixo "_pixel" ao invés de "_micron" para indicar que os valores dentro desses arquivos foram escritos para fora em forma de coordenadas de pixel.
  2. Simule distribuições de cluster RyR na pilha de imagem binária de miofibrilas.
    1. Aperte o botão rotulado "Open RyR-simulador em R" para iniciar o programa de R.
    2. Sobre o R-gui, selecione "arquivo | Open"e localize o arquivo"configurações. R"dentro do pacote de RyR-simulador (RyR-simulador/fonte/configurações. R).
    3. Também Abra o arquivo ryr-simulador-paralelo. R (localizado em RyR-simulador/fonte/ryr-simulador-paralelo. R). ambientes como Rstudio (https://www.rstudio.com) ou uma simples interface de linha de comando pode ser usado, por exemplo, usando o comando R64 em uma janela de comando ou casca.
    4. Altere os parâmetros nas configurações. R arquivo conforme detalhado abaixo:
      1. Como o endereço da pasta que contém arquivos listados em 5.1.2 para uma pilha de imagem confocal experimentalmente adquirida de RyR clusters e miofibrilas, Path2.
        Nota: O github repositório pasta entrada arquivos/mestre-células já contém arquivos que foram gerados para uma pilha de imagem previamente coletados.
      2. Conjunto Path4 para um endereço da pasta onde os arquivos que foram gerados na etapa 5.1.2 são armazenados.
      3. Defina ponto de Path3 para uma pasta onde o usuário quer os locais de cluster RyR simulados para ser salvo.
      4. Conjunto de N para o número de clusters RyR para ser simulado no modelo (tipicamente na faixa de 200 a 300).
      5. Definir etol, uma tolerância que fixa, para a diferença entre a distribuição espacial experimentalmente medida de RyR clusters e a distribuição espacial do modelo simulado de clusters RyR.
      6. Conjunto numIter para limitar o número de tentativas que o simulador RyR deve tomar para encontrar um padrão de cluster RyR simulado que satisfaz o valor etol.
        Nota: Valores para etol e numIter tem sido definidos como valores típicos dentro as configurações. Arquivo R.
      7. Conjunto de numPatterns para o número de diferentes padrões de cluster RyR que o usuário deseja simular (normalmente, é útil prática simulando 99 padrões para confiança estatística).
      8. Conjunto numCores para habilitar o uso de vários segmentos de CPU (núcleos) para processamento com R para simular os padrões de ponto de paralelo mais rápido.
    5. Verifique se os seguintes pacotes estão instalados usando o instalador do pacote gui na neve, doSNOW, doparallel, foreach, iteradores e rgl r:.
    6. Executar o simulador, digitando o seguinte comando na janela de comando R: fonte (' caminho para ryr-simulador-paralelo. R', chdir = TRUE)
      Nota: A saída do programa RyR-simulador é uma lista de arquivos. txt (um arquivo de numPatterns será gerado) que contêm listas de coordenadas em linhas de N e 3 colunas, que representam o x, y e z coordenadas do N simularam RyR aglomerados.
  3. Mapa de pontos como densidades espaciais em um modelo computacional usando o CardiacCellMeshGenerator.
    1. Selecionando o botão rotulado "Selecione RyR pontos arquivo", escolha um arquivo de texto de distribuição de cluster simulado RyR daqueles que estavam de saída pelo RyR-simulador.
    2. Execute "RyR densidade Mapper" o GUI em MATLAB. Isto irá mapear a localização espacial dos clusters RyR simulados no arquivo. txt no passo 5.3.1 para a malha de elementos finitos que foi gerado na etapa 4.8 usando um método chamado um núcleo esférico intensidade estimador método26.
      Nota: A saída desta etapa é um arquivo com extensão. txt que contém uma lista de valores para a densidade numérica do canal iônico por unidade de volume esférico em cada um de nós da malha computacional.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figura 2 a Figura 7 fornecem resultados representativos de várias etapas-chave neste protocolo: (i) Visualizar e reorientando blocos de tecido para exibições de microscopia eletrônica de varredura transversal; (ii) gerando uma pilha de imagem 3D microscopia eletrônica; (iii) segmentação ultraestrutura celular sub para organelas de interesse; (iv) a geração de uma malha de elementos finitos usando iso2mesh; (v) simulando uma distr...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo acima descreve etapas chaves para gerar um modelo geométrico de romance de elementos finitos de casos ultraestrutura. O método permite que as modalidades de fusão computacional de microscopia diferente (ou, em princípio, outros dados) desenvolver um modelo computacional mais abrangente da dinâmica de casos que inclui detalhes da arquitetura espacial cell. Não há atualmente nenhum outro protocolo disponível para criar um modelo de um casos.

Etapa 1 descreve um protocolo para fixação...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Royal Society de Nova Zelândia Marsden rápido começar Grant 11-UOA-184, a concessão de pesquisa de programa de ciência humana fronteiras RGP0027/2013 e o australiano pesquisa Conselho Discovery Project Grant DP170101358.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MateriaisCloreto de
sódioSigma-Aldrich746398
Cloreto de cálcioSigma-AldrichC8106
Cloreto de magnésioSigma-AldrichM2393
Bicarbonato de sódioSigma-AldrichS5761
Cloretode potássioSigma-AldrichP5405
DextroseSigma-AldrichD9434
Hidróxido de sódioSigma-AldrichS8045
ProbenecidaSigma-AldrichP8761
Monóxido de 2,3-butanodionaSigma-AldrichB0753
25% Glutaraldeído EM Grau (frasco de 500 ml)Merck354400-500ML
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148
Ácido tânicoSigma-Aldrich403040-500G100g EM grau
Cacodilato de sódioSigma-AldrichC0250
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Sigma-AldrichP4593
Tetróxido de ósmioSigma-Aldrich75632-10ML4% em água, frasco de 5 ml (ou frasco de 10 ml também disponível)
Acetato de uranilaEM Sciences22400Frasco de 25g
Ferrocianeto de potássioMerck Millipore104973
Azul de toluenoSigma-AldrichT3260
BóraxSigma-AldrichS9640também denominado borato de sódio
EtanolSigma-Aldrich792780Diluído em diferentes porcentagens com água pura
AcetonaEM SciencesRT10017
Kit de resinaEM Sciences14040ACM Durcupan funciona bem
Ácido clorídricoSigma-AldrichH98921Solução normal
Equipamento
UltramicrótomoLeicaEM UC7
Transmissão de elétrons microscópioThermoFisher ScientificTecnai F30http://www.leica-microsystems.com/
Suporte de retortaProscitechT752
TubingBioStrategy75831-346para aparelho de perfusão langendorff, 3 mm de diâmetro é recomendado, mas não essencial
TorneirasSDRQP13813para tubos langendorff; o produto é apenas um exemplo, o usuário pode selecionar qualquer
grampos de suporte de retortaProscitechT715
Seringas de plásticoSDRQPC1108para soluções em aparelhos de langendorff
Sutura de seda de canulação, 7-0TeleFlex15B051000para amarrar o coração em aparelhos de langedorff
CânulaFeita de agulha de aço de 3 mm de diâmetro externo
Tapete de borracha para placa de PetriProscitechH068para uso como tábua de corte durante a dissecção de coração fixo
Lâminas de barbearProscitechL056para cortar coração fixo em pequenos blocos para processamento EM
Frascos de vidroBioStrategy89000-236para armazenar soluções durante a fixação e processamento de tecidos para
béqueresBioStrategy213-0477para armazenar soluções temporariamente e durante a perfusão
Frascos de cintilaçãoBioStrategy548-2170para amostras de tecido durante o processamento EM
Kit de dissecaçãoProscitechT161para dissecação de animais
Filtros de seringaProscitechWS3-02225Spara purificação de acetato de uranila
Coposde prata De qualquer loja de produtos de panificação
FacaDupont DiamondA versão de ângulo de102680-780produz as melhores seções.
Soluções BBI deouro coloidalEM. GC1515 nm grades de malha EM de ouro coloidal
ProscitechGCU150uma variedade de tamanhos pode ser testada: GCU150h, GCU200h por exemplo
Pipetas de descarte de plásticoProscitechLCH20melhor usar descartáveis de plástico, especialmente quando se trabalha com resina
Software
SerialEMUniversity of Boulderaquisição de tomografia
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMODAlinhamento e segmentação de imagemUniversidade de Boulder
iso2meshdisponível em
http://iso2mesh.sourceforge.net Fiji ou software de processamento de imagem semelhanteImageJFiji é apenas Image Jdisponível em https://fiji.sc para manipulação de imagem binária pilhas
RyR-Simulator códigos/dadosCellSMBdisponível em https://github.com/CellSMB/RyR-simulator
CardiacCellMeshGeneratorO grupovem com o RyR-Simulator na pasta "gui-version"
R-statistics softwareR-projectBaixe do https://www.r-project.org
spatstatR-projectinstalar via programa R
rglR-projectinstalar via programa R
doparallelR-projectinstalar via programa R
para cadaprojetoinstalar via programa R
doSNOWR-projectinstalar via
iteradoresde programa R R-projectinstalar via programa R
EM de alumínio/folha 35 graus BioStrategy da Grupo CellSMB R

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