Artigo de método

Imagem latente funcional das fábricas de transcrição Viral usando microscopia de fluorescência 3D

DOI:

10.3791/56832

⸱

18 de janeiro de 2018

 ,  , 
1Department of Dermatology, University of California Davis School of Medicine, University of California, Davis, 2Center for Biophotonics, Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis

Neste artigo

Resumo

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Fábricas de transcriptional virais são estruturas discretas que são enriquecidas com celular RNA polimerase II para aumentar a transcrição do gene viral durante a reativação. Aqui, um método para localizar sites de ativamente transcrevendo cromatina viral em 3D espaço nuclear por uma combinação de hibridação de RNA de coloração e em situ de imunofluorescência é descrito.

Resumo

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É sabido que o Regulamento espacial e temporal de genes é parte integrante que regulam a expressão genética adequada. Consequentemente, é inestimável para entender onde e quando a transcrição está ocorrendo dentro espaço nuclear e para visualizar a relação entre episomes infectado dentro do núcleo da célula da mesma. Aqui, tanto de imunofluorescência (IFA) e RNA-peixe tem sido usadopara identificar ativamente transcrevendo episomes herpesvirus associado sarcoma de Kaposi (KSHV). Manchando o antígeno nuclear KSHV associada a latência (LANA), é possível localizar onde episomes virais existem dentro do núcleo. Além disso, através da concepção de sondas de RNA-peixe para atingir a região intrão de um gene viral, que é expressa somente durante a infecção produtiva, transcritos de RNA nascentes podem ser localizados. Usando esta combinação de sondas moleculares, é possível visualizar a montagem de fábricas grandes transcrição viral e analisar o Regulamento espacial da expressão do gene viral durante a reativação KSHV. Incluindo a mancha do anticorpo anti-RNA polimerase II, se pode visualizar também a associação entre a agregação de RNA polimerase II (RNAPII) e transcrição de KSHV durante a reativação.

Introdução

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Tornou-se cada vez mais claro que a organização spatiotemporal do núcleo desempenha um papel importante em modular a expressão gênica afinada em eucariontes. A maioria dos genes específicos do tecido estão distribuídos em muitos cromossomos e precisam ser regulada de forma síncrona a fim de responder a estímulos específicos em uma maneira coordenada1. Células constroem cubos cromatina ativa (ACH), como uma forma de reunir os genes e seus componentes cis-regulatórios para um espaço nuclear específico1.

Também foi demonstrado por vários estudos que embora o núcleo parece muito denso e viscoso, moléculas biologicamente ativas podem atravessar o núcleo rapidamente através de de difusão2. Como consequência dessa propriedade efêmera, a maioria das proteínas de ligação de DNA 'salto' de ligação local para ligação local, sentindo o seu caminho em torno do espaço nuclear, que permite a um núcleo altamente adaptável e versátil2.

Apesar deste comportamento dinâmico de biomoléculas dentro do núcleo, nuclear corpos sem membranas tais como (mas não se limitando a) o nucléolo, corpos de Cajal e corpos nucleares do leucemia promielocítica (PML-NB) ainda existem. É através de uma variedade de mecanismos, tais como repetições de DNA em tandem (nucléolo), rRNA (nucléolo) e proteínas estruturais como coilina (corpos de Cajal) ou PML proteínas (PML-NB) que mantêm essas construções juntos3,4,5 . Estas estruturas e outras congregações como fábricas de transcrição servem como andaimes que não apenas aumentam a concentração local de componentes necessários, mas também regulam a composição de proteínas e ácidos nucleicos dentro deles para, finalmente, criar um site central para funções celulares eficiente6.

Visualizar onde e quando forma estruturas nucleares oferece uma riqueza de informação para pesquisadores estudando epigenética. De uma perspectiva de virologia, a reativação do vírus Latentemente infectadas, tais como KSHV, altera significativamente a paisagem do núcleo e distribuição das enzimas nucleares para shift transcrição principalmente a partir de genes celulares para genes virais, em última análise, para produzir progênie viral totalmente funcional7,8. Como KSHV manipular a maquinaria de expressão do gene celular para facilitar a expressão dos genes virais? Essas informações também poderiam lançar luz sobre mecanismos de regulação do gene celular temporal.

Como todos os outros herpesviruses, KSHV tem dois ciclos de vida chamados latência e replicação lítica. KSHV reside principalmente na fase de latência, em que a maioria de seu gene viral, expressão é silenciado, exceto latência associado genes9,10. Durante a latência que KSHV produz latência associado antígeno nuclear (LANA), que constitutivamente vincula os genomas virais e amarras viral da cromatina do cromossomo humano11. Por causa do relacionamento íntimo da LANA com o genoma viral, é possível usar o IFA e DAPI para manchar e localizar onde os episomes virais foram em relação a cromatina de anfitrião.

Para estudar a reativação de KSHV no nível do episome único e a associação com outros episomes virais em uma célula infectada, foi estabelecida uma estratégia para localizar ativamente transcrevendo cromatina viral em situ . Por conseguinte, LANA e RNAPII IFA com intrão RNA-peixe foram combinadas, através da geração de sondas de RNA-peixe que se ligam à região intrão (sonda exata sequências podem ser encontradas em de publicação mais recente do laboratório Izumiya8) de KSHV K-Rta-a proteína viral-chave que é essenciais e suficientes para KSHV reativação foi possível identificar onde a transcrição na verdade estava tomando lugar8,11,12,13,14,15 . Este intrão técnica RNA-peixe permite que pesquisadores de Visualizar onde mRNA ser transcrito imediatamente antes de ser emendado e exportado para o citoplasma16,17.

KSHV pode ser reativado por vários estímulos químicos incluindo phorbol ésteres como 12-O-Tetradeconoyl-phorbol-13acetate (TPA) e inibidores de histona deacetilase como butirato de sódio, adicionalmente KSHV podem ser induzidos a reativar pela superexpressão de o fator de transcrição viral, K-Rta19. Pesquisadores com sucesso aumentaram a eficiência de reativação KSHV sincronizando ciclos da célula antes de induzir a reativação18. Assim, para estes estudos especiais, as células foram sincronizadas usando um bloco de timidina duplo (protocolo descrito abaixo) e incubadas com TPA e doxiciclina (Dox) durante um curto período de tempo. Doxicilina foi usada porque a linha de celular utilizada nestas experiências tem uma gaveta de doxiciclina-inducible K-Rta, que foi clonada do cDNA e não inclui a região de intron do K-Rta. Embora seja possível reativar KSHV usando apenas induzida expressão K-Rta, está comprovado por outros pesquisadores que, devido a uma variedade de diferentes fatores bioquímicos só expressão de K-Rta revela-se uma reativação fracos estímulos20. Através da combinação de todos estes e limitando-se a incubação do droga para um curto período de tempo, uma reativação de KSHV robusta mas não excessivamente artificial foi alcançada para a imagem latente.

Depois da rotulagem LANA, RNAPII, intrões K-Rta e DNA como descreveram neste artigo, imagem de fluorescência 3D foi realizada utilizando um microscópio de deconvolução widefield. Após o processamento com software de imagem, a distribuição espacial de episomes virais ativos pode ser avaliada corretamente. Usando esta técnica, as questões centrais sobre a natureza fundamental da formação da cromatina ativo hubs e outras estruturas nucleares podem ser estudadas. Ter episomes virais idênticos em uma única célula que processa os mesmos elementos normativos pode representar uma ferramenta de pesquisa exclusivo para aprofundar a compreensão dos mecanismos de regulação do gene spatiotemporal.

Uma limitação em termos de imagens várias espécimes de célula fixadas em pontos de tempo diferentes para caracterizar um processo inerentemente dinâmico molecular é que mudanças sutis ou em pequena escala na distribuição de fluorescência são detectadas ou considerado insignificantes. Isto é verdadeiro, a não ser no caso raro, cada célula observada exibe a mesma mudança sutil. Assim, a relação completa spatiotemporal de transcrição viral ativa e outras estruturas nucleares não pode ser criticamente avaliada utilizando imagens fixas. Para solucionar esses desafios técnicos, a melhor abordagem é a imagem ao vivo de células que têm marcado a episomes virais e a seguir a localização das principais enzimas celulares ao longo do tempo.

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Protocolo

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Cuidado: Linhas celulares usadas neste procedimento contêm vírus infecciosos, cuidado e só avançar na instalação de BSL de nível 2 ou superior.

1. preparação e manutenção de celular

  1. Cultura de células de TREx-K-RTA BCBL-1 (ou outra KSHV infectado linhas celulares PEL) em RPMI1640 suplementado com 15% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina estreptomicina solução de glutamina.
  2. Desenvolvem-se células a 37 ° C com 5% de dióxido de carbono (CO2), certificando-se de crescer continuamente e dividir as células em uma proporção de 1:4 em 2 – 4 dias.
  3. Monitorar as culturas de células com um microscópio de luz todos os dias para confirmar o crescimento de células boas e morfologia, caso contrário é recomendável para reiniciar a cultura de pilha ou para ajustar de acordo com as condições de cultura celular.

2. timidina sincronização e indução lítica

  1. Em um prato de Petri de 10 cm, células de TREx-K-Rta BCBL-1 placa em preparadas de mídia (1 x 106 células/2 mL de mídia)
  2. Adicionar timidina 200mm (concentração final: 2 mM) ao prato, misturar e incubar por 18 h.
  3. Centrifugar as células durante 5 min à 500 x g. lavam as células com estéril 1x tampão fosfato salino (PBS), centrifugue novamente e ressuspender as células em meios preparados na hora. Repita para um total de 3 lavagens. Resuspenda em mídia recentemente preparada.
  4. Permitir que as células sair de fase S para 8 h.
  5. Adicionar timidina (concentração final: 2 mM), misturar e incubar durante 16 h.
  6. Centrifugar as células durante 5 min à 500 x g. lavam as células com estéril 1x tampão fosfato salino (PBS), centrifugue novamente e ressuspender as células em meios preparados na hora. Repita para um total de 3 lavagens. Resuspenda em mídia recentemente preparada.
  7. Para induzir a reativação viral, adicionar 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, concentração final 20 ng/mL) e doxiciclina (DOX, concentração final 100 ng/mL) para a cultura de células, misturar e incubar durante 4 h. Para linhas de células sem uma gaveta inducible K-Rta, estimule a reativação usando TPA (concentração final 20 ng/mL e sódio butirato (1 mM)).
  8. Centrifugar as células durante 5 min à 500 x g. lavam as células com estéril 1x tampão fosfato salino (PBS), centrifugue novamente e ressuspender as células em meios de cultura completa. Repita para um total de 3 lavagens. Resuspenda em meios de cultura completo.
  9. Permitir que as células a crescer durante 24 h.

3. fixação e permeabilização

Nota: Antes de prosseguir, certifique-se de fixação solução (3,7% de formaldeído em PBS tratada com DEPC), dietil tratada pyrocarbonate fosfato salino (DEPC-PBS), glicina DEPC PBS (concentração final de glicina: 100 mM) e solução de permeabilizating (50% acetona, metanol 50%) estão preparados. Normalmente, cada slide vai exigir pelo menos 0,5 milhões de células, multiplicar se necessário e incluem células extras para trás acima, especialmente se as células não são saudáveis.

  1. Colete as células em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
  2. Centrifugar as células por 2 min em 200 x. g. lavagem das células 3 vezes com 1 mL de PBS estéril DEPC. Resuspenda em 1,2 mL de PBS DEPC.
  3. Coloque o número apropriado de lamelas (determinados pela configuração do experimental) no fundo de uma placa de 6.
  4. Pipetar 200 µ l da célula mistura de DEPC PBS em cada lamela, que sejam pelo menos 0,5 milhões de células em cada slide. Permitir que as células que se contentar em 2 min e aspire o excesso DEPC PBS, deixando apenas uma fina camada de células. É normal para as células a serem removidos neste processo.
    Cuidado: PFA é tóxica, use proteção adequada.
  5. Cuidadosamente, adicione 1 mL de solução (3,7% de formaldeído em PBS DEPC) para cada lamela de fixação. Permitir que as células corrigir por 10 min.
  6. Lave as lamelas 3 vezes com PBS DEPC.
  7. Cuidadosamente, adicionar 1 mL de PBS DEPC a glicina (concentração final de glicina: 100 mM) para cada lamela. Permitir que as células saciar por 5 min.
  8. Adicione 1,5 mL de PBS DEPC e de qualquer lugar num agitador por 5 min ou apertar firme mas delicadamente na mão por 1 min. Aspire o excesso DEPC PBS. Tenha cuidado para não perturbar as células. Repita esta etapa para um total de 3 lavagens.
  9. Cuidadosamente, adicione 1 mL de solução (50% de acetona, metanol 50%) para cada lamela de permeabilizing. Permitir que as células para permeabilize por 15 min.
    Nota: Neste momento, as lamelas podem ser armazenadas em um freezer-20 ° C para não mais de uma semana. Congelamento de evitar ou minimizar o tempo gasto no congelador, como qualidade de imagem pode degradar rapidamente. Certifique-se que quando no congelador que as células permanecem molhados e coberto em acetona/metanol e para garantir que eles devidamente Re-hidratar com PBS DEPC após a retirada do freezer.
  10. Adicione 1,5 mL de PBS DEPC e de qualquer lugar num agitador por 5 min ou apertar firmemente mas delicadamente na mão por 1 min. Aspire o excesso DEPC PBS, tenha cuidado para não perturbar as células. Repita esta etapa para um total de 3 lavagens.

4. IFA e RNA-peixe

Nota: Em relação a sonda RNA peixe rotulagem e preparação: para o K-Rta intrão 959 pares de bases, 31 diferentes sondas foram gerados, que eram 20 pares de bases cada, contendo um GC conteúdos de cerca de 50%. Soluções de trabalho e estoque das sondas foram aliquotadas em 100 µM e concentrações de 2,5 µM, respectivamente.

  1. Corrediças do microscópio rótulo com as informações necessárias experimentais ou algum tipo de rótulo distinguível.
  2. Forre o fundo de um recipiente de plástico selável com uma toalha de papel úmida.
  3. Preparar a solução de anticorpo primário (1,5 µ l de anticorpo de LANA, 0,75 µ l de anticorpo de RNA Pol II, 3 µ l de padeiro fermento tRNA, DEPC PBS até 30 µ l) e multiplicar a receita para cada lamela presente. Lugar de 30 µ l de solução de anticorpo primário para cada slide de microscópio rotulada.
    1. Titula-se o anticorpo primário de interesse primeiro e usar a quantidade ideal. Certifique-se de usar a IgG purificada, como soro (líquido de ascite) pode conter grande quantidade de RNase.
  4. Coloque as lâminas de microscópio rotulada a lamela (virado para a solução de células) e mover os slides no recipiente com a toalha de papel úmida. Tenha cuidado para não introduzir bolhas. Cobrir o exterior do recipiente com filme plástico. Mova o recipiente em uma incubadora conjunto para 37 ° C, durante 1 h.
  5. Prepare um peixe o tampão de lavagem (2 x salina de sódio tampão citrato (CCD) (final), 10% formamida, 90% DEPC dH2O).
  6. Prepare 2 x tampão de hibridização (4 x SSC, 20% de sulfato de dextran).
  7. Preparar o peixe intrão sonda buffer e o anticorpo secundário (20 µ l de 2x do tampão de hibridização (final 1 x Buffer Hyb), 4 µ l de fermento de padeiro tRNA (final 10%), 4 µ l de formamida (final 10%), sonda intrão K-Rta (final 125 nM), 0,8 µ g do anticorpo secundário, DEPC dH2 O até 40 µ l). Multiplica a receita para cada slide necessário.
  8. Após a incubação, lave as células 3 vezes com PBS DEPC em um prato bem 6 por 5 min cada.
  9. Lavar com tampão de lavagem peixe 3 vezes por 5 min cada. Manter lamela em tampão de peixe-lavagem até terminar de preparar mistura de segundo anticorpo e intrão sonda (etapa 4.7).
  10. Corrediças de vidro limpo, utilizadas para a incubação do anticorpo primário para a hibridação.
  11. Coloque 40 µ l do anticorpo secundário e peixe intrão sonda contendo solução cada lâmina de vidro.
  12. Coloque as lamelas com as células para os slides com o lado da célula voltada para baixo em cima do tampão, ter cuidado para não introduzir bolhas.
  13. Coloque as lâminas em um recipiente de plástico com uma toalha de papel úmida na parte inferior. Envolva o recipiente de plástico no primeiro filme de plástico e, em seguida, a folha de alumínio.
  14. Incube o recipiente com os slides a 37 ° C por 16-24 h.
  15. Após a incubação, cuidadosamente deslize a lamela da borda da lâmina de vidro, volte a colocar no 6 placas bem virada para cima e lavar as células com tampão de peixe-lavagem 3 vezes em um prato bem 6 por 5 min cada.
  16. Lavar as células 2 vezes com 2 x SSC.
  17. Adicionar DAPI (1:1, 000) no 2 x SSC e deixe-a descansar por 5 min à temperatura ambiente.
  18. Lavar as células 2 vezes com 2 x SSC.
  19. Limpar as lâminas de vidro usadas para a hibridação e adicionar 10 µ l de solução para as lâminas de vidro de montagem.
  20. Coloque o rosto de lamelas para baixo para a solução de montagem. Tenha cuidado para não introduzir bolhas.
  21. Com um tecido de laboratório, retire com cuidado a solução de montagem em excesso, tomando cuidado para não esmagar as células.
  22. Usando o esmalte, aplique uma camada ampla em torno da borda das lamelas e deixe para secar.
  23. Proceda para realizar a microscopia de fluorescência.

5. microscopia de fluorescência 3D

Nota: Enquanto protocolos variará com o tipo de sistema de microscópio de fluorescência usado, as etapas a seguir ajudará a garantir a aquisição de dados de imagem ideal para análise quantitativa.

  1. Pré-tratamento de amostras fixas e montar na mídia antidesbotamento para atrasar a fluorescência fotobranqueamento durante a imagem latente.
  2. Use o campo de visão um objectivo de alta qualidade (como um 60 X 1,42 N.D. óleo-imersão da lente), que pode capturar uma célula inteira (ou o núcleo celular).
  3. Definir parâmetros de exposição (por exemplo, poder da excitação, tempo de exposição) para cada canal de cor de fluorescência, utilizando amostras de controlo de positivo e negativo. Adquira imagens de fluorescência.
    Nota: As amostras de controlo positivo que contêm apenas uma etiqueta fluorescente também devem ser usadas para determinar o nível do "crosstalk" entre os canais de cor. Para amostras de célula fixa de imagem, poder de excitação da fluorescência pode ser reduzida (com tempos de exposição ligeiramente mais longos) para minimizar o fotobranqueamento.
  4. Uma vez que o protocolo de imagem tiver sido estabelecido, manter os mesmos parâmetros de exposição consistente para todas as amostras em estudo — para que os dados de imagem podem ser analisados e comparados com precisão.
  5. Execute o processamento de imagem pós aquisição e reconstrução 3D. Identifica as transcrições de K-Rta por sinal de RNA-peixe (vermelho), moléculas de LANA por imunofluorescência (verde) e da cromatina nuclear (onde aplicável) corados com DAPI (azul).
    Nota: Regiões do núcleo celular, em que K-Rta e LANA são co em cluster, assim são acreditadas para ser associado com fábricas de transcrição viral e replicação complexa.

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Resultados

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Realizou-se um protocolo ligeiramente abreviado onde células BCBL-1 foram usadas e somente a LANA e a K-Rta RNA foram corados (Figura 1). Esta experiência permite-nos examinar onde estão ativamente transcreve episomes virais e a heterogeneidade da resposta aos estímulos de reativação KSHV em uma população de células. Na célula indicada pela seta na Figura 1, a fluorescência K-Rta distinta nas regiões que correspondem estreitament...

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Discussão

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Existem alguns aspectos do protocolo que pode ser alterada para acomodar circunstâncias incomuns. A escolha de fixação e permeabilização de buffers também pode ser alterada. Para os buffers de fixação, paraformaldeído também é eficaz e etanol pode ser usado para permeabilização.

Extingue o formaldeído com glicina que PBS é recomendado pois impede o formaldeído desabilitando os anticorpos na ausência de albumina de soro bovino (BSA), mas se as lamelas são lavadas completamente suficiente, a eta...

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Divulgações

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Os autores deste trabalho não têm laços financeiros ou concorrentes conflitos de interesses.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada pela concessão do National Institutes of Health (R01-DE025985) e por um americano câncer sociedade Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Este trabalho também foi apoiado por subsídios do departamento de agricultura dos EUA (2015-67015-23268 e 2014-67015-21787) e nova bolsa de iniciativa de investigação da Universidade da Califórnia, Davis.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
RPMI medium 1650 GlutaMAXGibco da Life Technologies61870-036Precisa ser aquecido a 37 ° C
Soro Bovino FetalOmega Scientific Inc.Caneta FB-11
Strep Glutamine (100x)Gibco da Life Technologies10378-016
Timidine Sigma AldrichT9250
Dulbecco' s Solução Tamponada com FosfatoGibco da Life Technologies14190-144
TPASigma AldrichP1585
Butirato de Sódio Sigma AldrichB5887
Sigma Aldrich252549Corrosivo, tóxico, perigoso para a saúde
Diethyl PyrocarbonateSigma AldrichD-5758Toxicidade aguda 
GlicinaSigma Aldrich410225
AcetonaSigma Aldrich179124Metanol Inflamável e tóxico
Fisher Chemical 67-56-1inflamável, tóxico e perigoso
para a saúde para KSHV / HHV-8 ORF73Advanced Biotechnologies13-210-100
Anti-RNA Polimerase II Anticorpo clone CTD4H8EMD Milipore05-623
Ácido ribonucleico, transferência de padeiro s levedura (S. cerevisiae) Sigma Aldrich9014-25-9
Tampão de citrato de sódio sadino salino 20x (SSC)Thermo Fisher Scientific 
formamida Sigma Aldrich295876
Omnipur Dextran Sulfato, solução de 50%EMD Milipore1916C093
DAPI (4',6-diamindino-2-fenilindol, Dicloridrato)Thermo Fisher Scientific D1306
reagente antifade ouro slowFade GoldLife TechnologiesS36936
Micro vidro de cobertura 22x22MatsunamiC022221
VoloCITYSoftware
Microscópio
Lâminas de microscópio Superfrost/PlusFisher Scientific12-550-15
Solução de Formaldeído Anticorpo monoclonal de rato 15557044de imagem 3DDeltaVision

Referências

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