Artigo de método

Desenvolvimento de um ensaio In Vitro para dosar o Progenitor e Hematopoietic Stem Cells (HSPCs) no desenvolvimento de embriões de peixe-zebra

DOI:

10.3791/56836

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30 de novembro de 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um método simples para dosar o tronco e progenitoras células hematopoiéticas (HSPCs) no zebrafish embrionária. HSPCs de zebrafish dissociado são banhados em metilcelulose com fatores de apoio, diferenciando-se em sangue maduro. Isto permite a detecção de sangue defeitos e permite para ser facilmente conduzida de despistagem de drogas.

Resumo

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Hematopoiese é um processo essencial de celular no qual células estaminais e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) diferenciarem-se na multiplicidade de linhagens diferentes de células que compõem o sangue maduro. Isolamento e identificação destes HSPCs é difícil, porque eles são definidos ex post facto; Eles só podem ser definidos após sua diferenciação em linhagens de células específicas. Ao longo das últimas décadas, o peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um organismo modelo para estudar a hematopoiese. Embriões de zebrafish desenvolvem ex uteroe pela pós-fertilização de 48 h (hpf) geraram definitivo HSPCs. ensaios para avaliar a diferenciação HSPC e capacidades de proliferação foram desenvolvidas, utilizando o transplante e subsequente reconstituição do sistema hematopoiético além de Visualizar linhas transgénicas especializadas com microscopia confocal. No entanto, estes ensaios são custo proibitivo, tecnicamente difícil e demorado para muitos laboratórios. Desenvolvimento de um modelo in vitro para avaliar HSPCs seria custo-eficaz, mais rápido, e presentes menos dificuldades em relação ao anteriormente descritos métodos, permitindo que os laboratórios avaliar rapidamente telas mutagênese e drogas que afetam a biologia HSPC. Este romance em vitro ensaio para avaliar a HSPCs é realizado pelo chapeamento dissociado do zebrafish toda embriões e adicionando fatores exógenos que promovem a proliferação e diferenciação de HSPC. Os embriões são dissociados em células únicas e chapeados com HSPC-apoio fatores de estimulante de colônia que levá-los a gerar colônia formando unidades (CFUs) que surgem a partir de uma célula progenitora único. Estes ensaios devem permitir análise mais cuidadosa das vias moleculares responsáveis pela HSPC proliferação, diferenciação e regulamento, que permitirá que os pesquisadores a entender os fundamentos da hematopoiese vertebrado e sua desregulação durante a doença.

Introdução

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Hematopoiese é o processo de fazer a multidão de células maduras do sangue necessário para a sobrevivência do organismo. É uma chave no desenvolvimento do processo que envolve a diferenciação de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) em uma variedade de tipos de células desenvolvente restrito que compõem o sangue maduro. Estes linfócitos auto devem renovar para que o sistema nunca está esgotado e eles devem persistir de desenvolvimento embrionário precoce até à morte. Nos vertebrados, constante diferenciação e proliferação de células estaminais e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) são necessários para repor adequadamente a maioria das células do sangue que são pós mitóticas e sendo reciclados todos os dias. Linfócitos geram células maduras do sangue por primeira diferenciação em subconjuntos de células progenitoras restrito; comum progenitores linfoides (CLPs)1, que eventualmente produzir células T, B e NK e comum progenitores mieloides (CMPs)2 que geram granulócitos, eritrócitos, macrófagos e megacariócitos. Estes progenitores estão empenhados em gerar linhagens de células específicas e diferenciarem ainda mais em mais células progenitoras desenvolvente restrito como progenitores mieloide eritroide (MEPs) que geram eritrócitos e plaquetas ou granulócitos progenitores do macrófago (GMPs) que geram basófilos, eosinófilos, neutrófilos e macrófagos2. Identificando e isolando esses progenitores permitem a identificação de importantes vias moleculares envolvidos na diferenciação hematopoiética e muitas doenças hematopoiéticas, como a leucemia surgem quando essas células progenitoras não corretamente Diferencie-se.

Ao longo das últimas décadas, o modelo de sistema de peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se uma ferramenta chave de pesquisa para estudos hematopoiéticas adultas e embrionárias. Zebrafish são passível de análise genética e são as espécies de vertebrados modelo filogeneticamente menores que têm um sistema vascular semelhante e sistema hematopoiético aos seres humanos. Desenvolvem de embriões de zebrafish ex utero, e dentro de 48 horas pós fertilização (hpf) gerar HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafish são também altamente fecundo, com fêmeas deitado sobre 100 ovos em uma única embreagem, permitindo a replicação experimental e tamanhos de amostra grande. Zebrafish embriões são opticamente transparentes, permitindo a visualização microscópica do sistema hematopoiético. Várias linhas de transgênicas fluorescentes de zebrafish marcando linfócitos como runx1: EGFP peixe9, cd41: EGFP peixe10, e kdrl:mCherry; CMap: animais de duplo-positivo do GFP3 , permitem a visualização em tempo real de HSC surgimento e expansão na vivo3,4,7,8, 9. Geração rápido tempo e desenvolvimento ex utero do zebrafish conduziu a seu uso em mutagênese estudos11,12,13,14,15 e drogas rastreio de16,17,18,19,20 para compostos que mantêm a promessa terapêutica para distúrbios do sangue humano. Em geral, conservação do sistema hematopoiético, a presença e o desenvolvimento fácil de linhas transgénicas e tempo de regeneração rápida fez o zebrafish um modelo barato, rápido, flexível e ideal para estudos hematopoiéticos.

Numerosos métodos de isolamento e testes de linfócitos foram desenvolvidos em mamíferos sistemas hematopoiéticos. Os investigadores podem utilizar uma combinação de receptores de superfície celular para marcar linfócitos21,22,23,24, bem como explorar a capacidade dos linfócitos de efluxo tintura25,26. Depois que eles são rotulados, fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação permite que a sua separação física. Provar que é uma célula de um HSC requer irradiando um animal hospedeiro para destruir HSPCs endógenos, transplantando linfócitos putativos e observando a longo prazo, linhagem multi reconstituição de todos amadurecem tipos de células do sangue. Estes ensaios funcionam bem em ratos, como existem numerosos da pilha-superfície anticorpos contra células hematopoiéticas e linhagens puras do mouse que facilitam a correspondência imune para transplante. No entanto, alguns zebrafish anticorpos de superfície de células hematopoiéticas foram gerados27, dificultando a identificação e isolamento de linfócitos. A maneira mais comum para marcar e isolar linfócitos zebrafish é com animais transgénicos, segundo o qual uma sequência do promotor celular específico está dirigindo expressão de uma proteína fluorescente. Estudos têm visualizado e enumerado de linfócitos na parede ventral da aorta dorsal com microscopia utilizando esta técnica3,4,8,9. Outros laboratórios geraram variedades clonais de zebrafish28,29 e realizaram transplantes bem sucedidos em animais MHC-combinadas30. No entanto, essas técnicas são custo proibitivo para muitos laboratórios são tecnicamente difíceis e são demoradas. Para solucionar esses problemas, laboratórios têm gerado vários ensaios em vitro para testar para a presença, as taxas de proliferação e a capacidade de diferenciação de HSPCs31,32,33, 34,35,36. Estes ensaios mostram proliferação e diferenciação dos HSPCs em vitro31,32,33,34,35,36, o resgate de hematopoiéticas defeitos36e um método eficiente para descobrir e testar citocinas33,34,35. Eles também têm sido utilizados para identificar os genes responsáveis pela HSPC biologia31,32. Neste estudo, tomamos estes ensaios um passo adiante, permitindo a quantificação de HSPCs em um embrião em desenvolvimento do zebrafish. Estes ensaios também podem ser utilizados para quantificar o número de HSPCs em animais mutantes e os animais tratados com drogas hematopoiéticas interrupções. Em essência, estes ensaios são rápidos, presentes alguns desafios técnicos e maneiras baratas de dosar números HSPC, examinar sua proliferação e investigar blocos na diferenciação.

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Protocolo

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Conselho Consultivo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC) Universidade Estadual da Califórnia, Chico, aprovou todos os métodos descritos abaixo.

1. bleach 48 hpf Zebrafish embriões

  1. Com 15 cm (w) x 15 cm (l) x recipientes plásticos de 7cm (h) criar 3 estações de lavagem: 1) com 1 mL de água sanitária de 5% em 1000 mL de meio de embrião (E3; ver tabela 1), 2) com E3 estéril e 3) com E3 estéril. Certifique-se de que cada contêiner tem 500 mL de solução a submergir os embriões em.
    Nota: Para cada condição testada, pelo menos 10 embriões serão necessários. Este procedimento de lavagem pode acomodar até 200 embriões.
  2. Com uma pipeta de transferência, colocar os embriões em um coador de chá e mergulhe os ovos na estação de lavagem #1 por 5 min. Retire o coador de chá (com embriões dentro) e coloque no estação de lavagem #2 por 5 min; Repita para a estação de lavagem #3 para um final 5 min.
  3. Após a última lavagem, enxaguamento embriões de coador de chá, transformando-o de cabeça para baixo sobre um limpa de Petri de 10 cm e enxaguando suavemente embriões fora o coador de chá com E3 estéril e uma pipeta de transferência.

2. Dechorionate embriões

  1. Com uma pipeta de transferência, remover e descartar E3 tanto quanto possível da caixa de Petri e adicionar 500 μL de dechorionation protease (10 mg/mL) de embriões. Incube a temperatura ambiente por 5 min. Bata levemente o lado da caixa de Petri para remover completamente o chorions.
  2. Com uma pipeta sorológica, adicione 20 mL de E3 estéril para diluir a protease. Permitir que embriões resolver e remover o E3 com uma pipeta de transferência. Repita essa etapa de lavagem 3 vezes para remover todos os vestígios de protease a dechorionation.

3. preparação de amostras de embrião

  1. Usando uma pipeta P1000, coloque 10 embriões em um tubo de microcentrifugadora único estéril 1,5 mL.
  2. Retire E3 com uma pipeta e descarte.
    Cuidado: Pipetar com cuidado como embriões podem ser facilmente deslocados e descartados durante as etapas de lavagem a seguir.

4. preparação de embriões para dissociação

  1. Transferir as amostras para fluxo laminar hood e lavar os embriões, adicionando 1 mL estéril E3. Permitir que os embriões resolver a parte inferior do tubo e remover o sobrenadante com uma pipeta P1000. Repita para um total de 3 lavagens.
  2. Após a última lavagem, remova a E3 e descarte. Adicione 1 mL de 10mm ditiotreitol (DTT) na E3 para remover o revestimento de muco (e qualquer esporos, leveduras ou bactérias que podem ser presos nele) cercando o zebrafish embrionário. Colocar o tubo microcentrifuga horizontalmente e incubar a temperatura ambiente na capa de fluxo laminar para 25 min.

5. o embrião dissociação

  1. Lave a amostra 3 vezes com 1 mL de estéril DPBS (com Ca2 + e Mg2 +). Após a última lavagem, adicione 500 μL de DPBS (com Ca2 + e Mg2 +) e adicione 5 μL de protease de dissociação de 5 mg/mL (26 U/mL).
    Atenção: Esta enzima precisa de Ca2 + e Mg2 +, para garantir que o DPBS contém esses íons.
  2. Incubar as amostras a 37 ° C em um agitador orbital horizontal a 180 rpm para amostras de 60 min. lugar do capuz de fluxo laminar e triture os embriões com uma P1000 até amostras são totalmente dissociadas.
    Atenção: Verifique embriões periodicamente para determinar quando eles se tornam dissociados. A solução de embrião deve ter alguma quantidade de tecido presente; Não deve ser completamente homogêneo. É possível digerir excesso, que destruirá as HSPCs (ver suplementar Figura 1).

6. preparação dos embriões dissociadas

  1. Embriões de pipeta 10 dissociada para o reservatório superior de um poliestireno 5ml redondo tubo inferior com uma tampa de filtro de célula de 35 μm.
  2. Com uma pipeta, enxaguar o tubo de Petri com solução de transferência para poliestireno tubo de 5 mL contendo e PBS estéril (com nenhum Ca2 + ou Mg2 +) filtrados células da etapa 6.1. Repita até 4 mL de líquido está presente no tubo de poliestireno de 5 mL.
    Nota: PBS, DPBS ou outras soluções isotônicas em buffer podem ser utilizadas nesta fase, desde que não contenham Ca2 + ou Mg2 +
  3. Centrifugar tubos a 4 ° C e 300 x g por 5 min para a amostra homogeneizada célula de Pelotas. Com uma pipeta, remover e descartar o sobrenadante do tubo de fundo redondo. Tome cuidado para não perturbar as células peletizadas na parte inferior do tubo. Ressuspender as células em 100 µ l de PBS.

7. preparação de metilcelulose

  1. Gerar 1 x solução completa metilcelulose (tabela 1) e adicionar 2,5 mL de tubos estéreis fundo redondo 14 mL com 16G agulhas e seringas de 3 mL. Use um tubo para cada condição testada.
  2. Adicione citocinas, moléculas pequenas ou outros agentes para ser investigado para cada amostra.
    1. Para diferenciação mieloide, adicione 1% carpa soro e 0,3 mg/mL zebrafish recombinante granulócitos da colônia fator (Gcsf)34 para meio de metilcelulose. Ver Svoboda et al 37 para uma descrição completa sobre como gerar citocinas de soro e recombinação de carpa.
    2. Para diferenciação eritroide, adicione 1% carpa soro e 0,1 mg/mL zebrafish recombinante eritropoietina (Epo)38 a médio de metilcelulose.
    3. Para examinar os progenitores multilineage, adicione Epo e Gcsf.
      Cuidado: Citocinas e aditivos devem não total superior a 10% do volume total, como o meio não será suficientemente viscoso para discernir as colônias individuais.

8. adição de embriões dissociadas de metilcelulose

  1. Utilizando uma pipeta, adicione 100 μL de dissociada 10 embriões para a superfície da metilcelulose preparado com soro recombinante de citocinas e carpas. Tampa da tampa e vórtice suavemente para homogeneizar completamente a amostra. Cada tubo agora deve conter o tecido dissociado de 10 embriões.
  2. Usando 3 mL seringas e agulhas de 16G, alíquota de 1ml da amostra em separado 35 mm 2 placas de Petri. Certifique-se que a amostra é totalmente dispersos por todo o prato de Petri. Repita para cada amostra.
  3. Coloque os pratos de Petri 35mm com células em metilcelulose em uma placa de Petri de 15 cm. Para cada prato 15cm, adicione uma placa de Petri 35mm com 5 mL de água estéril para umidificar as amostras. Incube a 32 ° C e 5% de CO2 por 7-10 dias.

9. visualização de HSPC-derivado unidades formadoras (CFUs)

  1. Após 7 dias de incubação, coloca amostras em um microscópio invertido em 40-100 X para visualização e enumeração. Neste ponto, colônias individuais podem ser isoladas com uma pipeta e submetidas a análise de coloração e/ou gene.

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Resultados

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Para avaliar os números HSPC no zebrafish embrionário, 48 embriões hpf foram digeridos, banhados em metilcelulose com fatores de crescimento hematopoiéticos-apoio exógenos e incubados durante 7 dias (Figura 1A). Após 7 dias, unidades formadora de Colônia (CFUs) foram enumerados (Figura 1B) e imagem (Figura 1C). Controlando as diferentes citocinas adi...

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Discussão

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O modelo de sistema de zebrafish tornou-se um modelo eficiente, eficaz e barato para o estudo de hematopoiese vertebrado primitivo e definitivo. Geração de ensaios que são rápidos, baratos e apresentar algumas dificuldades técnicas pode ser utilizada para teste de pequenas moléculas, analisando os embriões mutantes e elucidação moleculares vias importantes para a biologia HSPC. Em vitro chapeamento de HSPCs de zebrafish adulto é um método eficaz para estudar mutagênese e citocinas hematopoiéticos defeitos. Este ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Financiamento foi fornecido pela National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 para D.L.S.), o programa de Universidade de estado de Califórnia para Educação & pesquisa em biotecnologia (CSUPERB: controle Molecular do nicho Hematopoietic vertebrados para D.L.S.) e da Secretaria de pós-graduação na Universidade do estado da Califórnia Chico (a A.C.B).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10% de albumina de soro bovino em Iscove MDMStemCell Technologies 9300
DPBS (10x) com Cálcio2+ e Magnésio2+Life Technologies14080-055
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
  DMEM 500 mLCorning CellGrow10-017-CVnbsp
; Presunto F12 500 mLCorning CellGrow10-080-CV
FBS 500 mLGemini Bio-Products100-108
HEPES 100 mL (1 M)Gibco life technologies15-630-080
Penicilina/estreptomicina (5000 U/mL
e 5000 mg/mL) com L-Glutamina (200 mM)		Corning Mediatech30-009-CI
Sulfato de Gentamicina 10 mL (50 mg/mL)Corning Tubo MCF Mediatech30-005-CR
1.5 mLFisherBrand05-408-129
Agulha de injeção de 3 mL 23gx1 com trava Luer TuboSafety Glide305905
5 mL com tampa de filtro de célulaCorning Falcon352235
Methocel MCSigma-Aldrich64630
14 mL Tubo inferior redondo de poliestirenoCorning Falcon352057
placa de Petri de poliestireno de 10 mm easygripCorning Falcon351008
Librease TMRoche Sigma-Aldrich5401119001protease de dissociação
PronaseRoche Sigma-Aldrich11459643001protease de descorionação
15 cm Placa de PetriCorning Falcon351058
ABZebrafish International Resource Center (ZIRC)cepa de peixe-zebraZL1
Dithiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich646563
inferior redondo de poliestireno BD A usou

Referências

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