Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo padronizado detalhado de arranjar em sequência do elevado-throughput 16S rRNA-amplicon. O protocolo apresenta um protocolo integrado, uniformizado, viável e barato a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. Este protocolo permite a análise de um grande número de amostras com padrões rigorosos e vários controles.

Resumo

A humana microbiome intestinal desempenha um papel central em proteger as células de uma lesão, no processamento de energia e nutrientes e na promoção da imunidade. Desvios do que é considerado uma composição da microbiota saudável (disbiose) podem prejudicar as funções vitais levando a condições patológicas. Esforços recentes e em curso de investigação tem sido direcionados para a caracterização das associações entre composição microbiana e a saúde humana e a doença.

Avanços em tecnologias de sequenciamento do elevado-throughput permitem a caracterização a composição microbiana do intestino. Estes métodos incluem 16S rRNA-amplicon sequenciamento e sequenciamento de espingarda. 16s rRNA-amplicon sequenciamento é usado para perfil composição taxonômica, enquanto o sequenciamento de espingarda fornece informações adicionais sobre as previsões de gene e anotação funcional. Uma vantagem em usar um método de sequenciamento alvo da região variável do gene de rRNA 16S é seu custo substancialmente menor comparado ao sequenciamento de espingarda. Diferenças de sequência no gene 16S rRNA são usadas como uma impressão digital microbiana para identificar e quantificar diferentes táxons dentro de uma amostra individual.

Grandes esforços internacionais tem alistado padrões para 16S rRNA-amplicon sequenciamento. No entanto, vários estudos relatam uma fonte comum de variação causada pelo efeito do lote. Para minimizar esse efeito, protocolos uniformizados para colheita de amostras, processamento e sequenciamento devem ser implementado. Este protocolo propõe a integração de protocolos amplamente usados a partir de coleta de amostra fecal para análises de dados. Este protocolo inclui uma abordagem direta-PCR coluna-livre, que permite a manipulação simultânea e extração de DNA de um grande número de amostras fecais, juntamente com a amplificação por PCR da região V4. Além disso, o protocolo descreve o pipeline de análise e fornece um script usando a versão mais recente do QIIME (QIIME 2 versão 2017.7.0 e DADA2). Este protocolo passo a passo é destinado a orientar os interessados em iniciar o uso do 16S rRNA-amplicon sequenciamento de forma robusta, reprodutiva, fácil de usar, detalhada.

Introdução

Esforços concentrados foram feitos para entender melhor microbiome diversidade e abundância, como outro aspecto de captar a diferença e semelhanças entre os indivíduos em condições saudáveis e patológicos. Idade^2,3, geografia⁴, estilo de vida^5,6e doença⁵ foram mostrados para ser associado com a composição de microbiome o intestino, mas muitas condições e populações ainda não foram totalmente caracteriza-se. Recentemente foi relatado que o microbiome pode ser modificado para aplicações terapêuticas

Protocolo

Aprovação ética para o estudo foi concedida pelo Comitê Local de ética pesquisa de Sheba e todos os métodos foram realizados em conformidade com as normas orientadoras aplicáveis e regulamentos. O protocolo recebido uma exceção de consentimento paciente do Conselho local de revisão ética, desde o material fecal que foram usados foram já apresentados para o núcleo de microbiologia como parte do exame clínico e sem informações identificáveis do paciente além de idade, gênero e resultados microbianos. Escrito, foi obtido o consentimento de voluntários saudáveis e o Conselho de revisão institucional aprovado o estudo. Algumas dessas amostras já foram incluídas em um anter....

Resultados

Uma ilustração esquemática do protocolo é mostrada na Figura 1.

Prospectivamente, nós recolhemos amostras de fezes de pacientes hospitalizados com diarreia infecciosa suspeita. As amostras foram submetidas ao laboratório de Microbiologia clínica no centro médico de Sheba entre fevereiro e maio de 2015, como foi descrito anteriormente¹. Amostras de fezes foram submetidas a cul.......

Discussão

16s rRNA-amplicon e sequenciamento de espingarda metagenomics ganharam popularidade em aplicações de Microbiologia clínica^21,22,23. Estas técnicas são vantajosas em sua capacidade aumentada para capturar táxons viáveis e não viáveis, fornecendo dados sobre a abundância relativa de inóculo patogênico e sua capacidade de identificar mais precisamente um polymicrobial infecciosa impressão digital²⁴. Os avanços no campo da pesquisa microbiome .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Primers	Integrated DNA Technologies (IDT)
Solução de extração	Sigma-Aldrich	E7526
Solução de diluição	Sigma-Aldrich	D5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit	KAPABIOSYSTEMS	KK2601	PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit de reagentes	Invitrogen	P7589	dsDNA quantificar o
reagente Kit de extração de gel MinElute	Qiagen	28606
Agarose	Amresco	0710-250G
Água Ultra Pura Dnase e Rnase Free	Biological Industries	01-866-1A
Kit de ensaio Qubit dsDNA HS	Sondas moleculares	Q32854	Kit de detecção de dsDNA
Sensibilidade D1000	Agilent Technologies	Fita de tela 5067-5582	separação e análise
Ensaio de fita de tela	Reagentes Agilent Technologies	5067-5583	para bibliotecas de DNA
PhiX Control v3	controle	de 15017666	Illumina
Kit de reagentes MiSeq v2 (500 ciclos)	Illumina	MS-102-2003
Brometo de etídio	Amresco	E406-10mL-TAM
coleção de 2 mL tubos	SARSTEDT	72.695.400	Tubos de coleta Safe Seal
Cotonete de plástico em tubo de ensaio	em PP INTERIOR ESTÉRIL	23117
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
>Equipamento
Máquina de PCR	Applied Biosystems	2720 Thermal Cycler
Sequncing Machine	Illumina	Miseq
PCR workstation	Biosan	UV-cleaner
tesoura
vortexer	Indústrias Científicas	Vortex-Genie 2

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