Artigo de método

Protocolo guiado para caracterização microbiana Fecal de 16S rRNA-Amplicon sequenciação

DOI:

10.3791/56845

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19 de março de 2018

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1Sheba Medical Center, 2Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 3Ariel University, 4Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Este manuscrito descreve um protocolo padronizado detalhado de arranjar em sequência do elevado-throughput 16S rRNA-amplicon. O protocolo apresenta um protocolo integrado, uniformizado, viável e barato a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. Este protocolo permite a análise de um grande número de amostras com padrões rigorosos e vários controles.

Resumo

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A humana microbiome intestinal desempenha um papel central em proteger as células de uma lesão, no processamento de energia e nutrientes e na promoção da imunidade. Desvios do que é considerado uma composição da microbiota saudável (disbiose) podem prejudicar as funções vitais levando a condições patológicas. Esforços recentes e em curso de investigação tem sido direcionados para a caracterização das associações entre composição microbiana e a saúde humana e a doença.

Avanços em tecnologias de sequenciamento do elevado-throughput permitem a caracterização a composição microbiana do intestino. Estes métodos incluem 16S rRNA-amplicon sequenciamento e sequenciamento de espingarda. 16s rRNA-amplicon sequenciamento é usado para perfil composição taxonômica, enquanto o sequenciamento de espingarda fornece informações adicionais sobre as previsões de gene e anotação funcional. Uma vantagem em usar um método de sequenciamento alvo da região variável do gene de rRNA 16S é seu custo substancialmente menor comparado ao sequenciamento de espingarda. Diferenças de sequência no gene 16S rRNA são usadas como uma impressão digital microbiana para identificar e quantificar diferentes táxons dentro de uma amostra individual.

Grandes esforços internacionais tem alistado padrões para 16S rRNA-amplicon sequenciamento. No entanto, vários estudos relatam uma fonte comum de variação causada pelo efeito do lote. Para minimizar esse efeito, protocolos uniformizados para colheita de amostras, processamento e sequenciamento devem ser implementado. Este protocolo propõe a integração de protocolos amplamente usados a partir de coleta de amostra fecal para análises de dados. Este protocolo inclui uma abordagem direta-PCR coluna-livre, que permite a manipulação simultânea e extração de DNA de um grande número de amostras fecais, juntamente com a amplificação por PCR da região V4. Além disso, o protocolo descreve o pipeline de análise e fornece um script usando a versão mais recente do QIIME (QIIME 2 versão 2017.7.0 e DADA2). Este protocolo passo a passo é destinado a orientar os interessados em iniciar o uso do 16S rRNA-amplicon sequenciamento de forma robusta, reprodutiva, fácil de usar, detalhada.

Introdução

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Esforços concentrados foram feitos para entender melhor microbiome diversidade e abundância, como outro aspecto de captar a diferença e semelhanças entre os indivíduos em condições saudáveis e patológicos. Idade2,3, geografia4, estilo de vida5,6e doença5 foram mostrados para ser associado com a composição de microbiome o intestino, mas muitas condições e populações ainda não foram totalmente caracteriza-se. Recentemente foi relatado que o microbiome pode ser modificado para aplicações terapêuticas7,8,9. Portanto, insights adicionais sobre a relação entre várias condições fisiológicas e a composição microbiana é o primeiro passo para a otimização dos potenciais futuras modificações.

Os métodos tradicionais de cultura microbiana são limitados por baixos rendimentos de10,11e são conceitualizados como um estado binário, onde uma bactéria está presente no intestino, ou não. Sequenciamento de alto rendimento baseado em DNA revolucionou a ecologia microbiana, permitindo a captura de todos os membros da comunidade microbiana. No entanto, a sequência ler comprimento e qualidade permanecem entraves significativos à taxonomia exata atribuição12. Além disso, experimentos com base alta produtividade podem sofrer de efeitos em lote, onde as medições são afetadas por variáveis não-biológicos ou não-científica13. Nos últimos anos, vários programas foram estabelecidos para estudar a microbiome humano, incluindo o projeto americano Gut, o projeto de Microbiome humano dos Estados Unidos (EUA) e o projeto MetaHIT do Reino Unido (UK). Estas iniciativas têm gerado grandes quantidades de dados que não são facilmente comparáveis devido à falta de consistência em suas abordagens. Uma variedade de projetos internacionais como o consórcio internacional de Microbiome humano, o projeto humana Microbiome as normas internacionais e o National Institute of Standards e tecnologia (NIST) tentou abordar algumas dessas questões14 e desenvolveu padrões para medições de microbiome que deverá permitir a obtenção de resultados reprodutivos confiáveis. Aqui descrito é um protocolo integrado de vários métodos amplamente utilizados15,16 para 16S rRNA elevado-throughput sequenciamento (16S-seq) a partir de coleta de amostra fecal através de análises de dados. O protocolo descreve uma abordagem PCR coluna-livre, projetada originalmente para extração direta de planta DNA16, para habilitar a manipulação simultânea de um grande número de fecal amostras em um tempo relativamente curto com alta qualidade amplificado DNA para alvo sequenciamento da região de V4 microbiana da variável sobre uma plataforma comum de sequenciamento. Este protocolo visa orientar cientistas interessados em iniciar o uso do 16S rRNA-amplicon sequenciamento de forma robusta, reprodutiva, fácil de usar, detalhada, usando controles importantes. Tendo um protocolo guiada e detalhadas passo-a-passo pode minimizar o efeito de lote e assim permitirá resultados de sequenciamento mais comparáveis entre laboratórios.

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Protocolo

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Aprovação ética para o estudo foi concedida pelo Comitê Local de ética pesquisa de Sheba e todos os métodos foram realizados em conformidade com as normas orientadoras aplicáveis e regulamentos. O protocolo recebido uma exceção de consentimento paciente do Conselho local de revisão ética, desde o material fecal que foram usados foram já apresentados para o núcleo de microbiologia como parte do exame clínico e sem informações identificáveis do paciente além de idade, gênero e resultados microbianos. Escrito, foi obtido o consentimento de voluntários saudáveis e o Conselho de revisão institucional aprovado o estudo. Algumas dessas amostras já foram incluídas em um anterior análise1.

1. manipulação de amostra

  1. Recolher um esfregaço2 mm com aproximadamente 5 (aproximadamente do tamanho de uma borracha de lápis) de uma amostra fecal fresca com um cotonete estéril em um teste de tubo (ver Tabela de materiais). Armazene todos os esfregaços contendo amostras fecais a-80 ° C dentro de 24 h. Os esfregaços fecais podem permanecer lá até o processamento adicional.

2. extração de DNA

  1. Descongelar as soluções de extração e diluição à temperatura ambiente (ver Tabela de materiais).
  2. Transferência o swab fecal em uma coleção vazia de 2 mL do tubo (ver Tabela de materiais). Ajuste o tamanho da vara cotonete cortando-o usando uma tesoura limpa para permitir o fechamento do tubo com contaminação mínima. Adicione 250 μL de solução de extração para cada tubo de coleta contendo o swab fecal e vórtice para misturar.
  3. Aquecer as amostras por 10 min em um banho de água a ferver (95-100° C). Adicione 250 μL de solução de diluição para cada amostra e o vórtice para misturar.
  4. Armazenar os tubos de 2 mL contendo o DNA extraído e o cotonete a 4 ° C.

3. PCR e preparação de biblioteca

Para obter as etapas 3.1 e 3.2, ambiente de trabalho em uma estação de trabalho PCR que fornece limpa, modelo e amplicon livre.

  1. Rotule os primers (tabela 1), de acordo com seu código de barras. Diluir cada primer na água bidestilada (DDW) a uma concentração de μM 50 e loja a-20 ° C.
  2. Use uma placa de 96 poços para reações de PCR. Cada placa pode conter 32 amostras diferentes, que são marcadas por 32 primeiras demão índice diferente. Descongelar o primer para a frente e os 32 primers inverso à temperatura ambiente e diluí-los a 5 μM.
  3. Prepare misturas de reação de PCR para 100 reações (volume final em cada poço será 20 μl) misturando-se 100 μL de cartilha para a frente de 5 μM, 1ml 2 X PCR Master mix e 400 μL DDW. Colocar 15 μL desta mistura de PCR em cada poço (total de 96 poços). Adicione 1 μL de cada 5 μM de primer indexado reverso 3 diferentes poços (32 diferentes cartilhas em triplica dá um total de 96 poços).
  4. Em uma zona dedicada do pre-PCR, significando uma bancada limpa que é modelo e amplicon livre, adicionar 4 μL de cada amostra de DNA extraída de misturas de reação (cada amostra de DNA coletada é amplificada em triplicado — 32 amostras por placa de 96 poços).
  5. Executar o PCR com as seguintes configurações: desnaturação inicial de 94 ° C por 3 min; seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C por 1 min, recozimento a 55 ° C, durante 1 minuto e extensão a 72 ° C por 1 min; e uma extensão final a 72 ° C por 10 min.
  6. Em um banco diferente, que será definido como uma zona dedicada post-PCR, combine cada reação de PCR triplicada em um tubo de volume único (60 μL por amostra).
  7. Para avaliar a qualidade do PCR amplicons, execute 4 μL de cada reação de PCR combinados em um gel de agarose a 1% manchadas de brometo de ethidium. Sob UV comprimento de onda de 260 nm, o positivo amplicons aparecerá em um tamanho de banda esperada da bp 375-425. Só estes amplicons serão incluídos nas etapas subsequentes.
    Nota: Cada amostra é amplificada em triplicado, significado que cada amostra é amplificada em 3 diferentes reações de PCR. Não aumenta.

4. Biblioteca quantificação e limpeza

  1. A fim de obter uma piscina de concentração equimolar de todas as amostras PCR, quantificar cada amplicon por um ADN encalhado dobro (dsDNA quantificar reagente) fluorescente ácido nucleico mancha (ver Tabela de materiais), adequado para a quantificação simultânea de um grande quantidade de amostras.
    Nota: Uma vez que a escala do tamanho do amplicon é equívoca, a quantidade real em nanogramas é usada para carregar uma concentração equimolar.
  2. Combine 500 ng de cada amostra para um tubo estéril e único. Vórtice de misturar.
  3. Execute 200 μL da biblioteca em pool em um gel de agarose a 1% manchadas de brometo de etídio. Extraia faixas de bp de 375-425 do gel usando um kit de extração do gel de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais) e eluir a biblioteca agrupada em 80 μL DDW.
    Nota: A biblioteca em pool deve ser tamanho selecionado para reduzir os produtos de amplificação não-específica do host DNA.
  4. Medir a concentração final de biblioteca usando um dsDNA altamente sensível detectando o kit de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais). Medir o tamanho exato de biblioteca usando um kit de separação e análise altamente sensível para bibliotecas de DNA de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais).

5. sequenciamento

  1. Diluir a biblioteca em pool para 19:00 com adição de biblioteca de controle de 20% (ver Tabela de materiais), de acordo com o protocolo de máquina de sequenciamento.
  2. Para sequenciamento, uso personalizado projetado Leia as primeiras demão que são gratuitas para os primers de amplificação de V4 (ver tabela 1).
  3. Cartilha de uso um terço personalizado projetado sequenciamento que lê o código de barras em um adicional ciclo (ver tabela 1) e gera leituras emparelhado-fim de 175 bases de comprimento em cada sentido, de acordo com as especificações do fabricante.
  4. Executar a máquina de sequenciamento e obter os arquivos FASTQ de acordo com o protocolo do fabricante.

6. processamento de dados

  1. Costurar e processar os arquivos FASTQ emparelhado-final sobrepostos em um pipeline de curadoria de dados implementado em QIIME 2 versão 2017.7.017. Demultiplex as leituras de acordo com a amostra de códigos de barras específicas.
  2. Use DADA218 para a deteção de variante (SVs) controle de qualidade e sequência. Truncar leituras 15 bases da extremidade 5', e 13 bases da extremidade 3' descarte lê com mais de 2 erros esperados. Identificar e remover as quimeras usando o método do consenso — quimeras são detectadas em amostras individualmente, e sequências encontradas quiméricoes em uma fração suficiente de amostras são removidas.
  3. Executar a classificação taxonômica de SVs usando um classificador Naive Bayes equipado, treinado em de 2013 a agosto 99% identidade Greengenes banco de dados6, para 175 tempo leituras e o primer de avanço/retrocesso definido.
  4. Rarefy todas as amostras, a profundidade de 2.146 sequências.
  5. Use UniFrac não ponderada para medição da diversidade-β (entre amostra diversidade19,20) nas amostras de rarefeita, para evitar um efeito de tamanho de amostra.
  6. Use a matriz de distância resultante para realizar uma análise de coordenadas principais (PCoA).
    Nota: Os arquivos de script e mapeamento de processamento de dados são fornecidos como material suplementar (complementar Material 1 e 2).

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Resultados

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Uma ilustração esquemática do protocolo é mostrada na Figura 1.

Prospectivamente, nós recolhemos amostras de fezes de pacientes hospitalizados com diarreia infecciosa suspeita. As amostras foram submetidas ao laboratório de Microbiologia clínica no centro médico de Sheba entre fevereiro e maio de 2015, como foi descrito anteriormente1. Amostras de fezes foram submetidas a cul...

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Discussão

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16s rRNA-amplicon e sequenciamento de espingarda metagenomics ganharam popularidade em aplicações de Microbiologia clínica21,22,23. Estas técnicas são vantajosas em sua capacidade aumentada para capturar táxons viáveis e não viáveis, fornecendo dados sobre a abundância relativa de inóculo patogênico e sua capacidade de identificar mais precisamente um polymicrobial infecciosa impressão digital24. Os avanços no campo da pesquisa microbiome ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado em parte pelo programa-CORE (subvenções n º 41/11), a Israel Science Foundation (grant no. 908/15) e o Europeu de Crohn e colite organização (ECCO).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
PrimersIntegrated DNA Technologies (IDT)
Solução de extraçãoSigma-AldrichE7526
Solução de diluiçãoSigma-AldrichD5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR Master mix
Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit de reagentesInvitrogenP7589dsDNA quantificar o
reagente Kit de extração de gel MinEluteQiagen28606
AgaroseAmresco0710-250G
Água Ultra Pura Dnase e Rnase FreeBiological Industries01-866-1A
Kit de ensaio Qubit dsDNA HSSondas molecularesQ32854Kit de detecção de dsDNA
Sensibilidade D1000Agilent TechnologiesFita de tela 5067-5582separação e análise
Ensaio de fita de telaReagentes Agilent Technologies5067-5583para bibliotecas de DNA
PhiX Control v3controlede 15017666Illumina
Kit de reagentes MiSeq v2 (500 ciclos)IlluminaMS-102-2003
Brometo de etídioAmrescoE406-10mL-TAM
coleção de 2 mL tubosSARSTEDT72.695.400Tubos de coleta Safe Seal
Cotonete de plástico em tubo de ensaioem PP INTERIOR ESTÉRIL23117
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
>Equipamento
Máquina de PCRApplied Biosystems2720 Thermal Cycler
Sequncing MachineIlluminaMiseq
PCR workstationBiosanUV-cleaner
tesoura
vortexerIndústrias CientíficasVortex-Genie 2
Alta Biblioteca de

Referências

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