Artigo de método

Quantificação absoluta dos níveis plasmáticos de MicroRNA em macacos Cynomolgus, usando o quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR

DOI:

10.3791/56850

⸱

12 de fevereiro de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Medicinal Safety Research Laboratories, Daiichi Sankyo Co., Ltd.

Neste artigo

Resumo

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Este relatório descreve um protocolo para medir os níveis absolutos de plasma miRNA, usando quantitativo em tempo real a transcrição reversa PCR com ou sem pré-amplificação. Este protocolo permite melhor entendimento da quantidade de plasma miRNAs e permite a avaliação qualitativa da correspondentes dados de diferentes estudos ou laboratórios.

Resumo

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RT-qPCR é um dos métodos mais comuns para avaliar os miRNAs destino individual. Níveis de MiRNAs são geralmente medidos em relação a uma amostra de referência. Esta abordagem é apropriada para examinar as alterações fisiológicas em níveis de expressão de gene alvo. No entanto, quantificação absoluta usando melhor análise estatística é preferível para uma avaliação global dos níveis de expressão do gene. Quantificação absoluta é ainda não de uso comum. Este relatório descreve um protocolo para medir os níveis absolutos de plasma miRNA, usando RT-qPCR, com ou sem pré-amplificação.

Um volume fixo (200 µ l) de plasma-EDTA foi preparado a partir do sangue coletado da veia femoral de macacos cynomolgus consciente (n = 50). O RNA total foi extraído utilizando sistema comercialmente disponível. Plasma miRNAs foram quantificados por ensaios de RT-qPCR sonda-based, que contém a sonda e a primeira demão PCR de avanço/retrocesso miRNA-específica. Curvas padrão para quantificação absoluta foram geradas usando oligonucleotides de RNA sintéticos disponíveis comercialmente. Um sintético cel-miR-238 foi usado como um controle externo para avaliação de normalização e qualidade. Os miRNAs que mostrou a quantificação ciclo (Cq) valores acima de 35 foram pre-amplificados antes da etapa de qPCR.

Entre os 8 miRNAs examinados, 122-miR, miR-133a e miR-192 foram detectáveis sem pré-amplificação, Considerando que miR-1 e miR-206 miR-499a pré-amplificação por causa de seus níveis baixos de expressão. MiR-208a e miR-208b não foram detectáveis mesmo após pré-amplificação. Eficiência de processamento da amostra foi avaliada pelos valores da cel-miR-238 cravado de Cq. Neste método de ensaio, variação técnica foi estimada em menos de 3 vezes e o limite inferior de quantificação (LLOQ) foi 102 cópia / µ l, para a maioria dos miRNAs examinadas.

Este protocolo fornece uma melhor estimativa da quantidade de plasma miRNAs e permite a avaliação da qualidade de correspondentes dados de diferentes estudos. Considerar que o baixo número de miRNAs em fluidos corporais, pré-amplificação é útil para realçar a deteção de mal expressa miRNAs.

Introdução

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Um número crescente de estudos foram explorar microRNAs (miRNAs) como biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico de câncer, ou monitoramento e detecção de outras doenças em estudos clínicos e adequado1,2,3 . Quantitativo em tempo real transcrição reversa PCR (RT-qPCR) é um dos métodos mais comuns utilizados para avaliar os miRNAs destino individual, porque esta técnica é mais sensível do que microarray4 e sequenciamento de RNA baseiam plataformas5. Em geral, expressão de miRNA é medido em relação a uma amostra de referência ....

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Protocolo

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Todos os experimentos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da Daiichi Sankyo co., Ltd.

1. preparação da amostra

  1. Colete sangue (pelo menos de 0,5 mL) da veia femoral de macacos cynomolgus em tubos de 2K-contendo EDTA.
    Nota: Citrato e heparina não são aceitáveis porque estes anticoagulantes inibem subsequente PCR14,15.
  2. Coloca as amostras coletadas imediatamente sobre o gelo e o processo de isolamento do plasma dentro de 2 horas de coleção.
  3. Centrifugar as amostras a 10.000 x g a 4 ° C por 5 min.
  4. Transferi o sobrena....

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Resultados

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Fluxo de trabalho de miRNA ensaio por RT-qPCR e qualidade assessment
A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho de miRNA ensaio de amostras de sangue usando qPCR10. A qualidade das experiências pode ser verificada por incluindo cel-miR-238 como um controle externo. Isto irá revelar variações técnicas de extração do RNA e RT-qPCR subsequente processos. Neste estudo, a média ± DP do Cq valores calculados a partir .......

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Discussão

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Nossa avaliação abrangente fornecido uma análise estatística mais rigorosa da extensão da faixa dinâmica, que indicava claramente que a magnitude da variação entre amostras individuais foi extremamente diferente entre os miRNAs testados. Embora estas variações podem ser atribuíveis à suas pequenas quantidades em fluidos corporais, note-se que esses dados refletem não apenas variações biológicas, mas também variações técnicas. A maioria da variação técnica pode ser avaliada por meio de valores de Cq do controle externo (c.......

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Divulgações

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O autor não tem nenhum conflito de interesses para divulgar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa não recebeu qualquer subsídio específico de agências de financiamento no setor público, comercial ou não-lucrativa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo BD Microtainer (K2EDTA)Becton, Dickinson and Company365974Para coleta de sangue
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mLEppendorf0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mLEppendorf0030120094
Oligonucleotídeo sintéticoHokkaido SystemScience-IndividualmiRNA (0,2 μ mol, grau HPLC)
Buffer Tris-EDTA  (pH 8,0)Nippon Gene314-90021TE buffer
Buffer RPEQIAGEN-Conteúdono kit mini miRNeasy 
Tampão RWTQIAGEN-Conteúdono mini kit miRNeasy 
Kit Mini miRNeasyQIAGEN217004
Água Livre de Nuclease QIAGEN129114
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN-Conteúdoem mini kit miRNeasy 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic QIAGEN219600ID: MSY0000293, adaptadores SC de 5 nmol
TAIGEN Bioscience CorporationS0120para extração de RNA
VacEZor 36 Sistema completoTAIGEN Bioscience CorporationM3610para extração de RNA
7900HT Sistema de PCR rápido em tempo realThermo Fisher Scientific Inc.4351405de bloco rápido de 96 poços
9700Thermo Fisher Scientific Inc.9700
Thermo Fisher Scientific Inc.
Filme Adesivo Óptico MicroAmpThermo Fisher Scientific Inc.
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific Inc.
Ensaios de microRNA TaqMan (cel-miR-238-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID do ensaio: 000248
Ensaios de microRNA TaqMan (has-miR-122-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID do ensaio: 002245
Ensaios de microRNA TaqMan (has-miR-133a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID do ensaio: 002246
Ensaios de microRNA TaqMan (has-miR-1-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID do ensaio: 002222
Ensaios de microRNA TaqMan (has-miR-192-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID do ensaio: 000491
Ensaios de microRNA TaqMan (has-miR-206)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID do ensaio: 000510
Ensaios de microRNA TaqMan (has-miR-208a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID do ensaio: 000511
Ensaios de microRNA TaqMan (has-miR-208b-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID do ensaio: 002290
Ensaios de microRNA TaqMan (has-miR-499a-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975ID do ensaio: 001352
Kit de transcrição TaqMan MicroRNA Reverse
Thermo Fisher Scientific Inc.
TaqMan PreAmp Master Mix (2 vezes;)Thermo Fisher Scientific Inc.
clorofórmio Wako Pure Chemicals035-02616
Etanol (99.5)Wako Pure Chemicals057-00456
Sistema de PCR GeneAmp Placa de Reação Óptica Rápida de 96 Poços MicroAmp 43469074311971444455743665974391128

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
  2. Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers ....

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