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Artigo de método

Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas

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DOI:

10.3791/56858

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18 de dezembro de 2017

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1Centre for Epigenetics and Disease Prevention, Department of Molecular and Cellular Medicine, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University, 2Centre for Translational Cancer Research, Department of Medical Physiology, Institute of Biosciences and Technology, College of Medicine, Texas A&M University

Neste artigo

Resumo

Protocolos detalhados para a introdução de uma enzima de divisão de engenharia-TET2 (cidra) em células de mamíferos para química inducible DNA hydroxymethylation e remodelação epigenéticas são apresentados.

Resumo

Metilação do DNA é uma modificação epigenética estável e hereditária no genoma dos mamíferos e está envolvida na regulação da expressão gênica para controlar funções celulares. A reversão da metilação do DNA, ou demetilação do ADN, é mediada por dez-onze translocação (TET) da proteína da família dos dioxygenases. Embora tem sido amplamente relatado que aberrante a metilação do DNA e a desmetilação estão associadas com câncer e defeitos do desenvolvimento, como estas mudanças epigenéticas contribuem directamente para a subsequente alteração na progressão de doença ou de expressão do gene Ainda não está claro, em grande parte devido à falta de ferramentas confiáveis com precisão, adicionar ou remover modificações do DNA no genoma em resolução espacial e temporal definido. Para superar este obstáculo, nós projetamos uma enzima split-TET2 para permitir o controle temporal de oxidação 5-metilcitosina (5mC) e subsequentes a remodelação dos Estados epigenéticos em células de mamíferos simplesmente adicionando produtos químicos. Aqui, descrevemos os métodos para a introdução de uma ferramenta de remodelação químico-inducible Epigenoma (cidra), com base em uma divisão de engenharia-TET2 enzima, em células de mamíferos e quantificar a produção química inducible do 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) com immunostaining, citometria de fluxo ou um ensaio de dot-blot. Esta ferramenta de remodelação Epigenoma químico-inducible encontrará ampla utilização em sistemas celulares a interrogar sem alterar o código genético, bem como na investigação das relações epigenotype−phenotype em diferentes sistemas biológicos.

Introdução

Metilação do DNA, principalmente refere-se a adição de um grupo metil na posição do carbono 5 da citosina para formar 5-metilcitosina (5mC), é catalisada por DNA metil-transferases (DNMTs). 5mC atua como uma marca importante epigenética no genoma de mamíferos que geralmente sinaliza para repressão transcriptional, inativação do cromossomo x e transposon silenciar1. A reversão da metilação do DNA é mediada pela família de proteínas de dez-elven translocação (TET). Enzimas de TET pertencem ao ferro (II) e 2-do oxoglutarate dioxygenases dependente que catalisam a oxidação sucessiva de 5mC 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxycytosine (5caC). Oxidação mediada por TET 5mC impõe uma camada adicional de controle epigenético do genoma dos mamíferos. A descoberta do TET provocou intenso interesse no campo epigenético para desvendar as funções biológicas das proteínas TET e 5hmC seu produto principal catalítico. 5hmC não é apenas um intermediário durante o TET-mediado ativo DNA desmetilação2,3,4, mas também atua como um estábulo epigenética marca5,6,7,8 . Apesar de hydroxymethylation de DNA é altamente correlacionada com a expressão de gene e aberrante mudanças no DNA hydroxymethylation estão associadas a algumas doenças humanas9,10,11, as relações causais entre as modificações epigenéticas no DNA e os fenótipos frequentemente permanecem um desafio a ser estabelecida, que pode ser parcialmente atribuída à falta de uma ferramenta confiável com precisão, adicionar ou remover modificações do DNA no genoma em definido pelo temporal e espacial resolução.

Aqui nós relatamos o uso de um produto químico-inducible Epigenoma remodelar ferramenta (cidra) para superar o obstáculo que enfrentam os estudos de relações causais entre transcrição hydroxymethylation e gene de DNA. O design é baseado no pressuposto de que o domínio catalítico de TET2 (TET2CD) pode ser dividido em dois fragmentos inativos quando expressa em células de mamíferos e sua função enzimática pode ser restaurada por uma abordagem de dimerização quimicamente inducible ( Figura 1A). Para estabelecer um sistema de separação-TET2CD, nós selecionamos seis locais em TET2CD, composto por uma região rica em Cys e uma dobra dupla-hélice β-hélice (DSBH), com base em uma estrutura de cristal relatado do ADN TET2-complexo que carece de uma região de baixa complexidade12. Um sintético gene que codifica a proteína dimerização rapamicina-inducible módulo FK506 12 (FKBP12) e domínio de ligação FKBP rapamicina (FRB) de mamíferos alvo de14,rapamicina15, juntamente com um peptídeo Self chicotado T2A polipeptídeo sequência16,17, individualmente foi inserido em sites selecionados dividido dentro de TET2CD. A seleção de TET2 como nosso alvo engenharia baseia-se as seguintes considerações. Mutações somáticas, primeiras no TET2 com concomitante redução de hydroxymethylation de DNA são frequentemente observadas em doenças humanas incluindo distúrbios mieloides e câncer10, que fornece informações úteis em locais sensíveis deve ser evitada para inserção. Em segundo lugar, uma grande fração do domínio catalítico TET2, particularmente a região de baixa complexidade, é dispensável para a função enzimática12, permitindo assim que um split-TET2 minimizado para modificações epigenéticas inducible do ofício. Após a triagem de mais de 15 construções, uma construção que exibiu maior restauração rapamicina-inducible da sua actividade enzimática no sistema dos mamíferos foi escolhida e designada como cidra18. Neste documento descrevemos o uso de mCherry-tag cidra para alcançar hydroxymethylation de DNA inducible e epigenéticas remodelação com rapamicina e apresentar três métodos para validar a produção 5hmC mediada por cidra em um sistema celular modelo HEK293T.

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Protocolo

1. cultura, transfeccao Plasmideo e indução química da pilha

  1. Cultura de uma linhagem de células aderentes (por exemplo, o embrionário rim humano HEK293T célula) no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM), suplementada com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, 100 U/mL penicilina e estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO2.
  2. Transfect células com o plasmídeo de cidra.
    1. Pelo menos 18 h antes de transfeccao, semente 0.3 x 106 células 2,5 mL de DMEM apropriado por bem em uma placa de 6 e incubam as células a 37 ° C durante a noite para chegar a confluência de 60-80%.
    2. Pré-aquecer o reagente de transfeccao à temperatura ambiente antes do uso.
    3. Lugar de 250 µ l de meio livre de soro em um tubo estéril.
      Nota: Este montante é adaptado para uma placa de 6 com a confluência de 80%. Se necessário, ajuste proporcionalmente as quantidades médias de acordo com os tamanhos de placas ou números de telemóvel.
    4. Adicionar 2,5 µ g do plasmídeo codificação cidra18 ou o domínio catalítico de TET2 (TET2CD como controle positivo)12,13 entram no meio livre de soro e delicadamente misture por pipetagem.
    5. Adicionar 7,5 µ l de reagente de Transfeccao para a mistura de DNA diluída e misture suavemente pipetando.
    6. Incube a mistura à temperatura ambiente por 20-30 min.
    7. Mudar de mídia previamente aquecida e adicione a mistura de drop-wise aos poços e agite suavemente a placa de cultura de células para distribuir uniformemente o reagente de transfeccao e mistura de DNA.
    8. Incubar as células e mistura durante a noite e em seguida, substitua o reagente de transfeccao contendo mídia com 2ml de DMEM completa fresco.
  3. Indução química
    1. Diluído a 2 mM do estoque de rapamicina (dissolvido em DMSO) a uma concentração de 20 µM em meio apropriado completo.
    2. Adicionar 20 µ l de rapamicina diluída para células transfectadas mantidas em 2 mL de meio para atingir uma concentração final de 200 nM.
      Nota: Após a incubação por 48 h, as células estão prontas para quantificação da geração de 5hmC ou quaisquer outras aplicações a jusante. Se necessário, a eficiência de indução pode ser monitorizada por tirar células cada 3h para mais 5hmC quantificação conforme descrito abaixo e mostrada na Figura 1.
    3. Para melhor quantificação da eficiência de indução 5hmC, semente separadas poços para monitorar as células a cada 3 horas.

2. quantificação da produção de 5hmC induzida por rapamicina por imunocoloração

  1. mancha de 5hmC da imunofluorescência
    Nota: Adicione quantidades suficientes da solução de fixação, composto por paraformaldeído 4%, 0,2% de tensoativo (tais como o Triton X-100) em PBS com 3 N HCl, para cobrir todas as células na placa. Por exemplo, 500 µ l de solução seria suficiente para um poço em uma placa de 6. Execute todas as etapas, à temperatura ambiente.
    1. Para corrigir as células, adicione paraformaldeído 4% em PBS a rapamicina-tratados células durante 15 minutos à temperatura ambiente. Para o grupo de controle, use células expressando mCherry-cidra sem tratamento de rapamicina. Não agite.
      Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico. Use proteção adequada.
    2. Descarte a solução fixador. Incube células fixas com surfactante de 0,2% em PBS durante 30 min para permeabilize membrana celular.
    3. Descarte a solução de permeabilização. Adicionar 3 N HCl para as células permeabilized e incube por 15 min desnaturar o DNA.
    4. Descarte a 100 mM de HCl. Add tampão Tris-HCl (pH 8.0) às células por 10 min para a neutralização do pH.
    5. Descarte toda a solução. Lavar as células completamente com PBS para 3 - 5 vezes. Remova completamente o PBS.
      Nota: Adicione quantidades suficientes de PBS para cada etapa de lavagem. Por exemplo, 1 mL de PBS é o suficiente para uma placa de 6.
    6. Bloquear células adicionando o tampão de bloqueio, composto por 1% de BSA e 0,05% de surfactante (tais como Tween 20) em PBS para 1 h com agitação suave.
    7. Descarte a solução de bloqueio. Adicione o anticorpo 5hmC diluído (1: 200) para as células e incubar durante 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
    8. Lave as células com PBS, três vezes por 15 min.
    9. Adicionar um fluoróforo diluído (FITC)-conjugado anticorpo secundário (1: 200) para as células e incubar durante 1 h.
    10. Lave as células com PBS três vezes extensivamente para remover anticorpos residuais.
    11. Adicionar 250 ng/mL de 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para manchar o núcleo 5 min. remover a coloração da solução.
    12. Monte o prato de cultura slide ou vidro baixo com células immunostained para a imagem latente confocal. Um resultado representativo foi mostrado na figura 1B.
  2. Citometria de fluxo
    Nota: Use uma placa de fundo redondo de 96 poços para o seguinte procedimento de coloração. Geralmente, 150 µ l de reagentes é suficiente para cada poço.
    1. Ressuspender as células transfectadas e induzida a rapamicina no buffer de FACS (PBS com 1% de BSA, 2 mM EDTA). Para o grupo de controle, use cidra-expressando células sem tratamento de rapamicina.
    2. Corrigir e permeabilize as células conforme descrito no passo 2.1.
    3. Adicione 2 N HCl para as células para desnaturar o DNA por 10 min.
    4. Descartar o HCl. neutralizar e bloquear as células conforme descrito no passo 2.1.
    5. Adicionar um anticorpo anti-5hmC diluído (1: 200) para as células e incube por 1h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
    6. Lave as células com buffer de FACS três vezes. Buffer de FACS remova completamente.
    7. Adicionar um fluoróforo diluído (FITC)-conjugado anticorpo secundário (1: 400) por fluorescência-ativado da pilha classificação análise (FACS) e incube por 1h à temperatura ambiente.
    8. Lave as células com buffer de FACS três vezes.
    9. As amostras estão prontas para análise de FACS. Um resultado representativo foi mostrado na Figura 1-D.

3. dot-blot ensaio para quantificar 5hmC e 5-metilcitosina (5mC) eleva-se

  1. Isole o DNA genômico de células transfectadas induzida por rapamicina usando um kit de extração de DNA comercial. Para o grupo de controle, use células transfectadas de cidra sem tratamento de rapamicina.
  2. Aqueça o forno a vácuo para 80 ° C e pré-embebição membrana de nitrocelulose em bidestilada H2O e, depois, em 6 x tampão citrato de sódio-solução salina (SSC) por 10 min.
  3. Carrega 60 µ l de quantidades iguais de DNA (total 2 µ g/ml tampão TE) em uma chapa de PCR de 96 poços. Adicione 30 µ l de tampão TE (Tris-HCl de 10 mM, 1 mM EDTA, pH 8.0) nos poços do resto.
  4. Fazer diluições em série dupla verticalmente na placa de 96 poços através da transferência de 30 µ l de solução na linha 1 para a mesma posição da coluna na linha 2. Misture novamente e 30 µ l de solução de transferência aos poços na linha subsequente até atingir o limite.
Remova os últimos 30 µ l.
  • Adicionar 20 µ l de 1m NaOH e 10 mM de EDTA para cada poço, selar a placa e aquecer a mistura durante 10 minutos a 95 ° C para desnaturar completamente do duplex de DNA.
  • Imediatamente arrefecer as amostras no gelo e adicionar 50 µ l de acetato de amônio 2m gelada (pH 7.0) e incubar no gelo por 10 min.
    Nota: Passos 3.7-3.10 envolve o uso de vácuo.
  • Montar o aparelho de borrão ponto com membrana previamente embebido e remover residual buffer usando vácuo total.
  • Lave a membrana adicionando-se 200 µ l de tampão TE a cada poço do aparato de dot blot. Ligue o aspirador para remover o tampão TE.
  • Carrega o DNA desnaturado (preparado nas etapas anteriores 3.1-3.6) a cada poço do aparato de dot blot. Ligue o aspirador para remover a solução.
  • Lave a membrana adicionando-se 200 µ l de 2 x SSC e remover soluções residuais completamente usando o vácuo.
  • Desmontar o aparelho de borrão do ponto, retire a membrana e lavar a membrana inteira com 20 mL de 2 x SSC.
  • Secar ao ar livre da membrana por 20 min.
  • Asse a membrana a 80 ° C sob vácuo por 2 h.
  • Adicionar a solução de bloqueio (5% leite desnatado em TBST) para a membrana e incube por 1h à temperatura ambiente.
  • Descarte a solução de bloqueio. Adicionar um 5hmC diluído (1:5, 000) ou 5mC (1:1, 000) anticorpos à membrana e incubar durante a noite a 4 ° C.
  • Lave a membrana com TBST três vezes para 10 min para remover anticorpos residuais. TBST remova completamente.
  • Adicionar um anticorpo secundário conjugado HRP (01:10, 000 de anti-coelho HRP(5hmC) ou 1:3,000 para anti-mouse HRP(5mC)) para a membrana e incube por 1h à temperatura ambiente.
  • Lave a membrana com TBST três vezes por 10 min.
  • Adicione ECL mancha o substrato para a membrana para visualização de sinais de 5hmC usando um detector de quimioluminescência ocidental. Um resultado representativo foi mostrado na Figura 1E.

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    Resultados

    Conversão de 5mC-para-5hmC inducible química pode ser validado pelo immunostaining em nível de célula única, análise de citometria de fluxo em populações de células transfectadas de (mCherry-positivo) ou um ensaio de dot-blot mais quantitativo, conforme ilustrado na Figura 1. O domínio catalítico de TET2, ou TET2CD, foram utilizados ao longo do estudo como um controle positivo. Consulte referências 18-20 para maiores detalhes sobre o mapeamento de todo o geno...

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    Discussão

    Aqui nós ilustraram o uso de uma enzima de split-TET2 projetado para conseguir o controle temporal de DNA hydroxymethylation. Após a descoberta da família de TET de dioxigenase 5-methycytosine, muitos estudos foram realizados para decifrar as funções biológicas das proteínas de TET e seu principal produto catalítico 5hmC1,2,3, 4,5,

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    Divulgações

    Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

    Agradecimentos

    Agradecemos a financeira das sustentações do National Institutes of Health concedem (R01GM112003 para YZ), Fundação Welch (BE-1913 a YZ), a American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE para YZ), a prevenção do câncer e Instituto de pesquisa de Texas (RR140053 a YH, RP170660 para YZ), a associação americana do coração (16IRG27250155 a YH) e o programa de prêmio de pesquisa colaborativa de fundação de John S. Dunn.

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    Reagente de transfecção de lipofectamina 2000Thermo Fisher Scientific11668027
    RapamicinaSigma-Aldrich37094
    Paraformaldeído, solução a 16%VWR100503-916
    Triton X-100Amresco0694-1L
    Ácido clorídricoAmresco0369-500ML
    Albumina, BovinoAmresco0332-100G
    Tween 20Amresco0777-1L
    5-Hidroximetilcitosina (5-hmC) anticorpo (pAb)Motivo Ativo39769
    Anticorpo Secundário de IgG de Cabra Anti-Coelho (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11008
    4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI)Biotium40043
    SVAC1E SHEL LAB Forno a vácuo econômico, 0,6 pés cúbicos. (17 L)SHEL LABSVAC1E
    UltraPure SSC, 20XThermo Fisher Scientific15557036
    Aparelho Bio-DotBIO-RAD1706545
    Anti-5-metilcitosina (5mC) Anticorpo, clone 33D3MilliporeMABE146
    Anti-mouse IgG,Tecnologia de Sinalização de Células7076S
    Anti-coelho IgG, Tecnologia desinalização de célula7074S
    West-Q Pico Dura ECL SolutionGendepotW3653-100
    de Anticorpo Ligado a HRP de anticorpo ligado a HRP

    Referências

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