Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas

Resumo

Protocolos detalhados para a introdução de uma enzima de divisão de engenharia-TET2 (cidra) em células de mamíferos para química inducible DNA hydroxymethylation e remodelação epigenéticas são apresentados.

Resumo

Metilação do DNA é uma modificação epigenética estável e hereditária no genoma dos mamíferos e está envolvida na regulação da expressão gênica para controlar funções celulares. A reversão da metilação do DNA, ou demetilação do ADN, é mediada por dez-onze translocação (TET) da proteína da família dos dioxygenases. Embora tem sido amplamente relatado que aberrante a metilação do DNA e a desmetilação estão associadas com câncer e defeitos do desenvolvimento, como estas mudanças epigenéticas contribuem directamente para a subsequente alteração na progressão de doença ou de expressão do gene Ainda não está claro, em grande parte devido à falta de ferramentas confiáveis com precisão, adicionar ou remover modificações do DNA no genoma em resolução espacial e temporal definido. Para superar este obstáculo, nós projetamos uma enzima split-TET2 para permitir o controle temporal de oxidação 5-metilcitosina (5mC) e subsequentes a remodelação dos Estados epigenéticos em células de mamíferos simplesmente adicionando produtos químicos. Aqui, descrevemos os métodos para a introdução de uma ferramenta de remodelação químico-inducible Epigenoma (cidra), com base em uma divisão de engenharia-TET2 enzima, em células de mamíferos e quantificar a produção química inducible do 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) com immunostaining, citometria de fluxo ou um ensaio de dot-blot. Esta ferramenta de remodelação Epigenoma químico-inducible encontrará ampla utilização em sistemas celulares a interrogar sem alterar o código genético, bem como na investigação das relações epigenotype−phenotype em diferentes sistemas biológicos.

Introdução

Metilação do DNA, principalmente refere-se a adição de um grupo metil na posição do carbono 5 da citosina para formar 5-metilcitosina (5mC), é catalisada por DNA metil-transferases (DNMTs). 5mC atua como uma marca importante epigenética no genoma de mamíferos que geralmente sinaliza para repressão transcriptional, inativação do cromossomo x e transposon silenciar¹. A reversão da metilação do DNA é mediada pela família de proteínas de dez-elven translocação (TET). Enzimas de TET pertencem ao ferro (II) e 2-do oxoglutarate dioxygenases dependente que catalisam a oxidação sucessiva de 5mC 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-....

Protocolo

1. cultura, transfeccao Plasmideo e indução química da pilha

1. Cultura de uma linhagem de células aderentes (por exemplo, o embrionário rim humano HEK293T célula) no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM), suplementada com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino, 100 U/mL penicilina e estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO₂.
2. Transfect células com o plasmídeo de cidra.
   1. Pelo menos 18 h antes de transfeccao, semente 0.3 x 10⁶ células 2,5 mL de DMEM apropriado por bem em uma placa de 6 e incubam as células a 37 ° C durante a noite para chegar a confluência de 60-80%.
   2. Pré-aquecer ....

Resultados

Conversão de 5mC-para-5hmC inducible química pode ser validado pelo immunostaining em nível de célula única, análise de citometria de fluxo em populações de células transfectadas de (mCherry-positivo) ou um ensaio de dot-blot mais quantitativo, conforme ilustrado na Figura 1. O domínio catalítico de TET2, ou TET2CD, foram utilizados ao longo do estudo como um controle positivo. Consulte referências 18-20 para maiores detalhes sobre o mapeamento de todo o geno.......

Discussão

Aqui nós ilustraram o uso de uma enzima de split-TET2 projetado para conseguir o controle temporal de DNA hydroxymethylation. Após a descoberta da família de TET de dioxigenase 5-methycytosine, muitos estudos foram realizados para decifrar as funções biológicas das proteínas de TET e seu principal produto catalítico 5hmC^{1,2,3, 4,5,}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente de transfecção de lipofectamina 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027
Rapamicina	Sigma-Aldrich	37094
Paraformaldeído, solução a 16%	VWR	100503-916
Triton X-100	Amresco	0694-1L
Ácido clorídrico	Amresco	0369-500ML
Albumina, Bovino	Amresco	0332-100G
Tween 20	Amresco	0777-1L
5-Hidroximetilcitosina (5-hmC) anticorpo (pAb)	Motivo Ativo	39769
Anticorpo Secundário de IgG de Cabra Anti-Coelho (H+L), Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11008
4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Biotium	40043
SVAC1E SHEL LAB Forno a vácuo econômico, 0,6 pés cúbicos. (17 L)	SHEL LAB	SVAC1E
UltraPure SSC, 20X	Thermo Fisher Scientific	15557036
Aparelho Bio-Dot	BIO-RAD	1706545
Anti-5-metilcitosina (5mC) Anticorpo, clone 33D3	Millipore	MABE146
Anti-mouse IgG,	Tecnologia de Sinalização de Células	7076S
Anti-coelho IgG, Tecnologia de	sinalização de célula	7074S
West-Q Pico Dura ECL Solution	Gendepot	W3653-100

de Anticorpo Ligado a HRP de anticorpo ligado a HRP