Imagens 3D de alta resolução da rede Neuro-insular pâncreas humano

Até recentemente, 3-dimensional (3D) reconstrução de grandes tecidos ou órgãos inteiros foi realizada através de seccionamento serial laborioso, coloração e reconstrução de imagem de várias seções. Esses métodos tinham várias desvantagens, incluindo a dependência de um grande número de seções seriais, tecido pobre penetração com anticorpos e luz espalhamento impedindo imagem profunda dentro de tecidos. Para permitir maior luz e penetração de anticorpo, os pesquisadores desenvolveram métodos químicos para preservar os antígenos da proteína enquanto remove a maioria dos lipídios de espalhamento de luz. Vários relacionados com métodos são Clear Lipid-Exchanged do acrilamido-hibridizado rígida tecido Imaging hidrogel (clareza), técnica passiva de clareza (Pacto) e assistida por perfusão de agente de liberação in situ (PARS) (revisado em ^{1,2 ,3,4,5,6}). O método de clareza baseia-se na estabilização de proteínas usando um formaldeído, acrilamida e bis hidrogel seguido por remoção de lipídios, usando electroforese SDS solução². Esta abordagem foi mais tarde modificada para compensação de passivo e avançada de imagem⁷. Otimização mais levou para a eliminação do bis e de diferentes percentagens de paraformaldeído na solução hidrogel (% de 1-4) para obter a estabilização de antígeno ideal com o menor tempo de compensação por uma técnica chamada pacto ⁸. Primeiras tentativas de desenvolver estas técnicas de compensação óptica envolveram orgânicos ou outros compostos que eram difíceis de trabalhar e extinta endógenas proteínas fluorescentes em modelos do rato transgénico. Estes métodos adicionais incluíam escalas, análise de Cocktails desobstruída do cérebro/corpo e computacional (cúbico), métodos SWITCH e Dimensional Imaging of Solvent-Cleared órgãos (discoteca), todos com várias vantagens e desvantagens^{9, 10,11,12}. O método de clareza original foi desenvolvido em tecido de cérebro de rato rica em lipídios e métodos de compensação óptica tinham limitado a testes em tecidos humanos^7,8,11,13,14 .

Métodos de compensação óptica são ideais para os nervos de rastreamento longas distâncias, como no sistema nervoso central do mouse intactos. O pâncreas é bem inervado pelo sistema nervoso autonômico e sensorial. O compartimento endócrino do pâncreas, ilhotas de Langerhans, compõem uma parte muito pequena do órgão inteiro (1-2%) e ilhéus tem conhecido a heterogeneidade em tamanhos (50-250 µm), proporções de células endócrinas e densidade particularmente no diabetes (revisto em ^{15 ,},¹⁶). No desenvolvimento de um protocolo, vários métodos de compensação óptica foram testados para o pâncreas humana e um procedimento de pacto foi encontrado para fornecer o melhor equilíbrio de tempo para limpar (~ 2 semanas) com excelente preservação morfológica dos nervos e ilhotas. O procedimento final otimizado é descrito aqui na delineação da rede neuro-insular para em grande escala (distâncias de milímetro) e imagem em 3D de alta resolução de várias ilhotas pancreáticas intactas. A técnica é adequada para o pâncreas humana imediatamente após a fixação, ou depois de armazenamento, bem como as amostras fixadas em formol tamponado neutro e incorporado em cera de parafina. As amostras são adequadas para a imagem latente por confocal ou microscopia lightsheet.

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Conselho de revisão institucional Universidade da Flórida e diretrizes federais.

Cuidado: Paraformaldehyde e acrilamida são tóxicos irritantes. Manipule os reagentes em uma coifa com equipamento de protecção adequado (jaleco, luvas, óculos de proteção, etc.).

1. deparaffinization de tecidos fixados em formol (se trabalhar com tecidos frescos, pule para a etapa 2)

1. Use uma nova lâmina de barbear ou bisturi para cortar a parafina perpendicular à superfície do tecido. Corte a parafina na borda do tecido para terminar-afrouxamento. Usar o fórceps ou uma espátula suavemente solte e remova o tecido a ser apuradas opticamente. Lixe ligeiramente parafina em excesso do tecido usando uma espátula (figura 1A).
2. Encher um recipiente de vidro com xilol (cerca de 30 mL para um 3 x 3 x 3 seção mm de tecido) e incube o tecidos nesta solução por 24 horas à temperatura ambiente (RT).
3. Encha um outro recipiente de vidro com xileno fresco com o mesmo volume que 1.2.1. Transferência e incubar o tecido nessa solução por 24 h no RT
4. Coloque 100% de etanol em um tubo cónico com o mesmo volume que 1.2.1. Transferência e incubar o tecido nessa solução por 24 h no RT
5. Coloque o etanol a 95% em um tubo cónico com o mesmo volume que 1.2.1. Transferência e incubar o tecido nessa solução por 24 h no RT
6. Coloque 70% de etanol em um tubo cónico com o mesmo volume que 1.2.1. Transferência e incubar o tecido nessa solução por 24 h no RT
7. Lave o tecido em fosfato 0,01 M tampão salino (PBS) e lugar na PBS 0,01 M em um tubo cônico para equilibrar por 24 h no RT. Certifique-se de que o tecido está livre de parafina (figura 1B, painel direito).

2. prepare o fixador de paraformaldeído (PFA) 4%

1. Pipete 10 mL 16% PFA em um tubo cónico de 50 mL, adicione 4 mL 0,1 M PBS e adicione 26 mL de água destilada deionizada (ddH₂O). Feche a tampa e misture rapidamente.
2. Volumes maiores de PFA pode ser feita em frente e congelados em alíquotas de 4%. Alíquotas são boas para 1 dia em temperatura ambiente (RT), uma semana a 4 ° C e 1 mês a-20 ° C.

3. pâncreas fixação

1. Fixar a amostra de pâncreas (≤ 1 x 1 x 2 cm) recentemente preparada 4% PFA a 4 ° C por 48 h. Se a amostra for maior do que 1 x 1 x 2 cm, usar um bisturi ou lâmina de barbear para dissecar em pequenos pedaços não mais de 1 cm de espessura. Lavar a amostra de tecido em três mudanças de 0,01 M PBS durante pelo menos 15 min cada lavagem e armazenar em tubo de centrífuga de 15 mL em 0,01% PFA/0,01 M PBS ou 0,5% de sódio azida/0,01 M PBS até o uso.
2. Após a fixação, seção o tecido em seções grossas de 1-2 mm para posterior processamento. Use um vibratome para ajudar no corte mesmo.
   Nota: O número final de seções dependerá do tamanho da amostra inicial.

4. incorporar o tecido em hidrogel

1. Prepare 200 mL da solução de monômero de hidrogel de paraformaldeído (A4P1) de acrilamida/1% 4% como segue:
   1. Coloca um balão no gelo em um balde na parte superior uma placa de agitação magnética. Certifique-se de que o balão está sentado plana e adicionar uma barra de agitação magnética.
   2. Adicione a seguinte ordem: 147,8 mL frio (4-8 ° C) ddH2O, PBS 0,1 M de 20 mL, 20 mL frio (4-8 ° C) 40% de solução de acrilamida, 12,2 mL de solução de PFA 16% e iniciador 250mg VA-044. Misturar a solução de hidrogel inteiro com uma barra de agitação magnética para pelo menos 10 min e deixe a solução no gelo para o próximo passo.
2. Coloque um tubo cônico de 15 mL no gelo ao lado o frasco contendo a solução de hidrogel. Pipetar 14 mL de solução de monômero do tubo e adicionar um pedaço de amostra de tecido fixo grosso de 1-2 mm. Então o tubo do tampão.
3. Incubar a amostra em solução de monômero durante 3 dias a 4 ° C e proteger da luz. Alíquota qualquer solução de monômero restantes e loja a-20 ° C para uso futuro.

5. desgaseificar a solução de monômero e polimerizar o hidrogel

1. Retire o oxigênio da solução monômero hidrogel usando gasoso N₂⁸.
   1. Preparar um balde de gelo e colocar a amostra na solução de monômero de hidrogel no gelo.
   2. Juntem-se 2-3, agulha de calibre 18 por exemplo, película de parafina e um temporizador. Conecte o tubo no tanque de nitrogênio, para que o nitrogênio pode fluir. Mantendo-se a amostra em gelo, pierce cuidadosamente a tampa de um tubo cônico contendo a amostra de um lado e pressione uma agulha hipodérmica através de até que ele está sob a superfície da solução de monômero líquido.
   3. Usar outra injeção para punção do lado oposto da PAC, mas não permitem a tornar-se submerso.
      Nota: A segunda agulha exalará o tubo.
   4. Conecte o tubo do tanque de nitrogênio para a agulha hipodérmica submergida do hidrogel e rode lentamente o nitrogénio até está borbulhando constantemente através do líquido.
   5. Permitir que o nitrogênio a borbulhar através do líquido por 10 min.
2. Uma vez que o oxigênio é removido, rapidamente remover as duas agulhas e cobrir a tampa com uma película de parafina para evitar qualquer outra troca de gases entre o tubo e o ambiente. Coloca a amostra libertos na incubadora a 37 ° C por 3 h a polimerizar o hidrogel.

6. tecido clareira

1. Prepare 500 mL de solução (4% SDS a pH 8,5) de compensação. A ~ 300 mL de DDQ₂O, adicione 50 mL 0,1 M PBS e 20 g SDS em pó, agitando com uma barra de agitação magnética. Ajuste a solução usando hidróxido de sódio e ácido clorídrico de pH 8,5. Adicione O ddH₂até que o volume final de 500 mL.
2. Após a polimerização, deite fora o excesso hidrogel e descartá-lo em um recipiente de resíduos químico. Use uma toalha de papel para gentilmente limpe hidrogel fora da amostra e descarte em um recipiente de resíduos químico.
3. Lave a amostra em 3-5 trocas de 0,01 M PBS (fluido de lavagem descarte no lixo químico) por 15 min a cada etapa de lavagem. Transferi a amostra para um tubo cónico de 50 mL com 40 mL de tampão de compensação.
4. Incubar a amostra no buffer de compensação a 37 ° C e alterar a amostra para buffer de compensação fresco todos os dias.
   1. Deixe a amostra no buffer de compensação para 2-8 semanas, dependendo do tamanho da amostra (~ 8 semanas para uma 3 x 3 mm x 3 mm amostra) para garantir a compensação adequada.
   2. Monitorar a clareira de tecido e parar quando terminar. Certifique-se de que a amostra é suficientemente transparente, segurando-o contra a luz para verificar se há compensação adequada (geralmente uma coloração bronzeada permanecerá nas regiões exócrinas).
      Nota: Uma amostra de excesso apurada aparecerá desgastada nas bordas e a textura será muito macia quando pegou com fórceps. É comum para o exemplo para limpar de forma desigual. Além disso, o tecido não será totalmente transparente até colocado na montagem de mídia (inserir, Figura 1).

7. múltiplos de imunofluorescência

1. Lave as amostras num agitador a 60 rpm a RT por um dia com 40 mL 0,01 M PBS mudando para fresca reserva muitas vezes (buffer de 4-5 alterações no total, 40 mL de cada lavagem, mudando a cada h até a lavagem final). Deixe a lavagem final continuar durante a noite no RT
2. Prepare o Pacto de reserva de coloração. A PBS de 0,01 M de 500 mL, adicione azida sódica 50 mg e 0,5 mL TritonX-100. Misture bem.
3. Incube a amostra com os anticorpos primários.
   1. Adicionar 2% de soro normal (mesma espécie que o anticorpo secundário) ao Pacto de base coloração buffer em um tubo de fundo chato de 2 mL (volume total de pelo menos 1 mL é recomendado por amostra/tubo).
   2. Adicione o anticorpo primário ao 2% soro/pacto de reserva de coloração. Use aproximadamente 5 vezes a quantidade de anticorpo primário para coloração de pacto como seria usado para immunohistochemistry padrão (ou seja, se um anticorpo é diluído 1: 500 para immunohistochemistry padrão, uso 1: 100 para coloração do pacto).
   3. Use uma espátula para retirar o tampão de lavagem da amostra e pincele o buffer excesso fora sobre uma toalha de papel, em seguida, coloque no tubo com uma solução de anticorpo primário.
4. Incube a 2-4 dias em RT em um shaker em 60 rpm. Lave as amostras em RT em um shaker em 60 rpm em 0,01 M PBS mudando para buffer fresco 4 - 5 vezes e deixando a lavagem final em uma noite como na etapa 7.1.
5. Incube as amostras com anticorpos secundários.
   1. Adicionar 2% de soro normal (mesma espécie que o anticorpo secundário) ao Pacto de base coloração buffer em um tubo de fundo chato de 2 mL (volume total de 1 mL é recomendado por amostra/tubo).
   2. Acrescente os anticorpos secundários em uma concentração de 1: 200 (5 µ l em 1 mL de tampão).
      Nota: Formato pequeno anticorpos são anticorpos preferenciais, bem como altamente adsorvido Cruz-se usando mais de um anticorpo primário.
   3. Use uma espátula para remover a amostra de tampão de lavagem e enxugue o excesso buffer fora sobre uma toalha de papel, em seguida, coloque no tubo com uma solução de anticorpo secundário.
6. Incubar a RT em um shaker em 60 rpm por 2 dias e proteja a amostra da luz.
7. Lave as amostras, como no passo 7.1, em RT em um shaker em 60 rpm em PBS de 0,01 M, mudando para o novo buffer 4 - 5 vezes e deixando o final lavar em uma noite, proteger da luz durante lavagens.

8. amostras de montagem para a imagem latente

1. Prepare o buffer de solução combinado (jantes) de índice de refração.
   1. Pesar 11g de médio gradiente de densidade não-iônico (por exemplo, Histodenz) e com cuidado transferir para um tubo cónico de 50 mL.
   2. Adicione ~ 5 mL 0,02 M fosfato tampão (PB)⁸ usando uma espátula para liberar o ar do meio gradiente de densidade não-iónicos de pó.
      Nota: A solução será muito viscoso, misture bem.
   3. Trazer o volume de 10 mL com mais PB, misture com uma espátula e raspe o excesso fora a espátula dentro do tubo.
   4. JANTES, incubar a 37 ° C até dissolver, inverter e misture suavemente conforme necessário.
2. Transferi as amostras para jantes. Para fazer isso, pipete 1 mL jantes para um tubo de fundo plano 2 mL. Use uma espátula para remover a amostra de tampão de lavagem e enxugue o excesso buffer fora sobre uma toalha de papel, em seguida, coloque no tubo com solução de jantes.
   1. Bata levemente o tubo para submergir a amostra em jantes. Colocar as amostras em jantes no banco protegido da luz em RT para 2-4 dias antes de imagem.
3. Para a imagem, coloque uma pequena quantidade de jantes em uma corrediça de câmara 8 poços lamela inferior. Só adicionar apenas o suficiente para cobrir o fundo, mais fará com que a amostra para flutuar, tornando mais difícil a imagem em um escopo invertido. Adicionar a amostra para o poço e o slide para a imagem latente do tampão.

9. imaging

1. Microscopia confocal e software de imagem
   1. Selecione o apropriado lasers para a excitação e espectros de emissão do fluorophores usado para manchar as amostras do pacto. Ajuste as configurações do software aquisição para que qualquer sobreposição entre os canais é eliminada. Use faixas separadas se necessário (quando dois fluorophores têm espectros de excitação semelhante).
   2. Configurar a aquisição de imagem
      1. Escolher a velocidade de aquisição máxima, 16 bits, 4 ou mais médias e resolução de 1024 x 1024 ou melhor.
      2. Amplie o objeto a ser fotografado.
         Nota: Isto irá diminuir o tempo de aquisição para reduzir a foto-branqueamento e também diminuir o tamanho do arquivo e editar a jusante.
   3. Configure a z-pilha.
      1. Selecione o corte ideal para o objetivo que está sendo usado. Se deconvolução é desejada, mais tarde, use um z-passo menor do que o ideal como 1 µm.
      2. Use o z-pilha de correção.
         1. Começar mais perto da superfície do tecido e aumentar o ganho, como o objectivo centra-se através de z-plano e adicionar correções. Não altere as configurações do laser para a correção!
         2. Adquira uma pilha de teste com uma média, resolução 512 x 512 e velocidade máxima de aquisição. Verifique a imagem em 3D para certificar-se de que não há brilho igual em toda a pilha para cada cor, antes de adquirir a z-pilha alta resolução final.
2. Imagem de Lightsheet
   1. Certifique-se que as amostras têm sido equilibradas jantes de imagem pelo menos 24 h. idealmente, transferir as amostras para jantes frescos na câmara de imagem e permitem equilibrar na câmara pelo menos um dia.
   2. Montar a amostra para a imagem latente
      1. Selecione o menor capilar (preto) para montar a amostra
      2. Use o putty ou um prato para manter a amostra ao aplicar cola super à extremidade do capilar. Cole o tecido para o capilar tocar tão pouco uma superfície do tecido quanto possível.
      3. Inserir a amostra para a imagem latente.
   3. Imagem usando 5 X ou 25 X objectivos adequados para opção de verificação opticamente apuradas amostras utilizando o pivô. Se sombreamento ou embaçamento ocorre, girar a amostra e tente novamente ou deixe a amostra continuam a se equilibrar em jantes.
      Nota: Uma pilha de 1 mm geralmente pode ser adquirida em menos de cinco minutos, dependendo das configurações.
   4. Exiba e edite as pilhas de imagem usando o software de análise de imagem.

Esses procedimentos de coloração foram desenvolvidos para fornecer uma análise em larga escala do pâncreas humano para examinar ilhotas e redes associadas autonômicas e sensoriais. Testaram-se vários procedimentos incluindo clareza7, iDISCO17, e pacto8 com o método de pacto encontrado melhor adequado para pâncreas humano e a imagem latente confocal.

Anticorpos primários foram inicialmente testados em fixo amostras de pâncreas humano com amostras de controlo adequados em positivo e negativo (mouse cérebro, outros). Os anticorpos primários e diluições sugeridas estão listadas na Tabela de materiais, embora cada laboratório pode esperar para otimizar as diluições de anticorpo dependendo da fonte de tecido e número de lote. Variação de lote para lote de anticorpo primário pode afetar a intensidade de coloração e a especificidade e exigem a validação para atingir o mesmo grau de intensidade da mancha como com reagentes antigo.

No pâncreas humano, ilhéus foram delineados pela insulina, glucagon e secretogranin 3 (Figura 2). Células de Schwann foram delineadas usando a proteína de ácida fibrilar glial (GFAP, Figura 2 e Figura 3A). Os nervos manchados com anticorpos contra o marcador parassimpático intestinal vasoativo (VIP) foram fotografados sobre o Lightsheet (Figura 3B). Nervos simpáticos podem ser vistos com coloração para Tirosina Hidroxilase (não mostrado).

Figura 1. Compensação óptica pâncreas humano. (A) uma lâmina de barbear é usada para cortar e soltar uma secção de tecido parafina (painéis superiores) antes de remover a seção de tecido e raspagem parafina excesso fora do tecido (painéis de fundo). Amostras representativas são mostradas antes (B esquerdo, C em cima) e depois (B certo, C médio) compensação óptica de tecido parafina, conforme descrito na seção de protocolo. O tecido limpo, fixo não é completamente transparente depois de limpar (B certo, top C) e muitas vezes o tecido inchaço pode ser apreciada (C, painel de média). O tecido limpo torna-se totalmente transparente após equilibration em aros (C, painel inferior). Barras de escala: 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Rede humana neuro-insular. Amostras de pâncreas humano foram apuradas conforme descrito a partir de nPOD doadores de órgãos ou tecidos parafina arquivamento. (A-D) Células de Schwann (GFAP +, brancos) e células endócrinas são mostradas manchadas pela insulina (vermelha) e glucagon (verde). (A) Confocal microscopia e máxima projeção de intensidade (MIP) mostra o rastreamento das células de Schwann (GFAP +) nos nervos, correndo ao lado de vasos sanguíneos na periferia do Ilhéu e estendendo-se para os ilhéus. O baixo-relevo demonstra alta resolução obtidas e mostra o contato entre as células de Schwann GFAP + e células endócrinas. (B) uma imagem 3D do painel (escala: x = 50 µm, y = 20 µm, z = 25 µm) A. Uma amostra de parafina-pacto é mostrada a imagem através de microscopia confocal e apresentado como uma projeção de intensidade máxima (C) e em 3D (D), escala: x, y = 50 µm, z = 25 µm). Escala de barras , C: 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. visualização 3D e costura. Três pilhas de imagem costurados foram adquiridas das células de Schwann manchado usando microscopia confocal e GFAP e rastreadas utilizando um plugin de rastreamento de axônio do software de análise de imagem. (A) o preenchimento 3D do rastreamento é mostrado (barras de escala: x = 150 µm, y = 200 µm (0,2 mm), z = 120 µm) (B) A pacto amostra estava manchada com anticorpo VIP e fotografada usando um microscópio lightsheet. A pilha é > 1 mm em profundidade e fibras nervosas são claramente vistos em alta resolução. Fibras, envolvendo um duto (D, primeiro plano) e um gânglio (G, plano de fundo) podem ser vistas (grande grade: x, y, z = 200 µm; carrapato marcas: x, y, z = 40 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.