A pele humana age como uma primeira linha de defesa contra o ambiente externo. Apresentamos um método para isolar os queratinócitos humanos primários da pele adulta. Estes queratinócitos isolados são úteis em inúmeras configurações experimentais e são um modelo altamente adequado para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea em vitro.
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Artigo de método
Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto
Neste artigo
Resumo
Resumo
A principal função dos queratinócitos é fornecer a integridade estrutural da epiderme, mantendo assim uma barreira mecânica ao mundo exterior. Além disso, os queratinócitos desempenham um papel essencial na iniciação, manutenção e regulamento de epidérmicos respostas imunes por ser parte do sistema imunológico inato, respondendo a estímulos antigênicos de forma rápida e não específica. Aqui, descrevemos um protocolo para isolamento de queratinócitos humanos primários da pele de adulto e demonstrar que estas células respondem à diferenciação terminal induzida por cálcio, como medido por um aumento da expressão da involucrin de marcador de diferenciação. Além disso, mostramos que os queratinócitos isolados são responsivos à IL-1 β-induzida por ativação de vias de sinalização intracelulares, medida pela ativação da via MAPK p38. Tomados em conjunto, descrevemos um método para isolamento e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele adulta. Porque os queratinócitos são o tipo de célula predominante na epiderme, este método é útil para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea in vitro.
Introdução
A pele é o maior órgão do corpo humano e serve como uma barreira protetora contra o ambiente externo. A pele é composta de duas camadas principais: a derme e epiderme, onde a epiderme constitui a camada mais externa da pele. O tipo mais abundante de células na epiderme é os queratinócitos que compreende mais de 95% da célula em massa1,2. Os queratinócitos são mantidos em vários estágios de diferenciação na epiderme e são organizados em camadas basais, espinhosos, granulares e cornificadas que correspondem às fases específicas de diferenciação3. A principal função dos queratinócitos é fo....
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Protocolo
A coleta de amostras de pele de voluntários adultos saudáveis, submetidos à cirurgia plástica requer aprovação do Comitê de ética das instituições de acolhimento. Este protocolo foi aprovado pelo Regional éticas Comitê da região Midtjylland, Dinamarca (M-20110027). O método descrito aqui é derivado de estudos semelhantes por Maciaq et al . 10 e Liu e Karasek11.
1. isolamento de queratinócitos da pele humana
- Começar por fazer as seguintes soluções: 50 mL de solução de glicose de tripsina e 0,1% de 0,25% em DPBS. Mix e filtro esterilizem (0,2 µm) a solução. Prepare-se 10 mL ....
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Resultados
Diferenciação Terminal induzida por cálcio
Queratinócitos humanos passam por diferenciação terminal após tratamento com cálcio14,15,16. Queratinócitos humanos primários foram isolados e cultivados conforme descrito no protocolo acima. Quando aproximadamente 50-60% de confluencia, as células foram estimuladas com cálcio (1.2 mM) ou veículo e fotos das células foram tiradas no dia 0, 1 e 2.
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Discussão
Aqui, descrevemos como isolar facilmente queratinócitos humanos primários da pele adulta e como a cultura deles em vitro. Este modelo pode ter uma aplicação ampla para a investigação da biologia das células epidérmicas e pode ser útil para pesquisadores interessados no estudo de doenças cutâneas.
Algumas das vantagens do protocolo descrito aqui é que, em contraste com os queratinócitos isolados do prepúcio neonatal obtido de recém-nascido machos submetidos à circuncisão, queratinócito.......
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Divulgações
. O autor não tem nenhum conflito de interesses.
Agradecimentos
O autor deseja agradecer a Annette Blak Rasmussen e Kristine Moeller para seu suporte técnico
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 Meio de | cultura celular |
| Suplementos KSFM | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Suplementos para KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS sem Cálcio e Magnésio |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimetil sulfóxido |
| Gentamicina | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Aditivo de meio de cultura de células Filtro |
| esterilização | Sartorius | 16534 | Filtro de seringa com um tamanho de poro de 0,2 µ m |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T7409 | Usado para tripsinizar células |
| Glicose | Sigma-Aldrich | G7528-RPMI-1640 | |
| ThermoFisher Scientific | 61870-010-FBS | ||
| ThermoFisher Scientific | 16000044 | Usado para inativar tripsina | |
| Fórceps | - | Fórceps de qualquer empresa podem ser usados | |
| Tesouras | - | Tesouras de qualquer empresa podem ser usadas | |
| Bisturi | Swann Morton | 0501 | Bisturis de qualquer empresa podem ser usados |
| 70% de etanol | - | -- | |
| Almofadas de gaze | NOBAMED | 875420 | Almofadas de gaze de qualquer fornecedor podem ser usadas |
| Plaina de pé | Credo Solingen | 1510 | Plaina de pé de qualquer fornecedor pode ser usada |
| Placas de Petri | TPP | 93100 | Placas de Petri de qualquer fornecedor podem ser usadas |
| Filtro de metal | - | Filtro de metal interno de 1 mm de tamanho de furo | |
| 75 cm<>2 Frascos de cultura | NUNC | 156499-150 | |
| cm2 | TTP | 90151-0,05 | |
| % Solução de tripsina-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Usado para tripsinizar células ao passar |
Referências
- Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. Keratinocytes as initiators of inflammation. Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).
- Nickoloff, B. J., Turka, L. A. Keratinocytes: key immunocytes of the integument. Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).
- Fuchs, E., Rag....
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Reimpressões e permissões
