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Artigo de método

Geração e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele de adulto

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DOI:

10.3791/56863

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22 de dezembro de 2017

1Department of Dermatology, Aarhus University Hospital

Neste artigo

Resumo

A pele humana age como uma primeira linha de defesa contra o ambiente externo. Apresentamos um método para isolar os queratinócitos humanos primários da pele adulta. Estes queratinócitos isolados são úteis em inúmeras configurações experimentais e são um modelo altamente adequado para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea em vitro.

Resumo

A principal função dos queratinócitos é fornecer a integridade estrutural da epiderme, mantendo assim uma barreira mecânica ao mundo exterior. Além disso, os queratinócitos desempenham um papel essencial na iniciação, manutenção e regulamento de epidérmicos respostas imunes por ser parte do sistema imunológico inato, respondendo a estímulos antigênicos de forma rápida e não específica. Aqui, descrevemos um protocolo para isolamento de queratinócitos humanos primários da pele de adulto e demonstrar que estas células respondem à diferenciação terminal induzida por cálcio, como medido por um aumento da expressão da involucrin de marcador de diferenciação. Além disso, mostramos que os queratinócitos isolados são responsivos à IL-1 β-induzida por ativação de vias de sinalização intracelulares, medida pela ativação da via MAPK p38. Tomados em conjunto, descrevemos um método para isolamento e cultivo de queratinócitos humanos primários da pele adulta. Porque os queratinócitos são o tipo de célula predominante na epiderme, este método é útil para estudar os mecanismos moleculares em biologia cutânea in vitro.

Introdução

A pele é o maior órgão do corpo humano e serve como uma barreira protetora contra o ambiente externo. A pele é composta de duas camadas principais: a derme e epiderme, onde a epiderme constitui a camada mais externa da pele. O tipo mais abundante de células na epiderme é os queratinócitos que compreende mais de 95% da célula em massa1,2. Os queratinócitos são mantidos em vários estágios de diferenciação na epiderme e são organizados em camadas basais, espinhosos, granulares e cornificadas que correspondem às fases específicas de diferenciação3. A principal função dos queratinócitos é fornecer a integridade estrutural da epiderme, produzindo assim uma barreira intacta ao mundo exterior.

Os queratinócitos também representam a primeira linha de defesa contra patógenos na pele e, portanto, desempenham um papel importante na resposta imune inata4,5. Exposição dos queratinócitos a estímulos externos leva à ativação das vias de sinalização intracelulares e, posteriormente, a produção de um número de vários mediadores inflamatórios, incluindo citocinas, quimiocinas e peptídeos antimicrobianos. Estas proteínas derivadas de queratinócitos participarem na resposta inflamatória, recrutamento e ativação de células imunes como específico T células6,7, neutrófilos e células dendríticas. Assim, porque os queratinócitos desempenham um papel crucial em inúmeros processos biológicos, a lógica por trás da técnica apresentada aqui foi gerar um modelo in vitro para estudar a biologia da pele. Culturas de queratinócitos primários obtidas de prepúcio neonatal são frequentemente utilizadas para estudar pele biologia8,9. No entanto, com a técnica descrita aqui, queratinócitos de ambos os sexos são obtidos resultando em uma maior diversidade biológica das células.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e a geração de queratinócitos humanos primários da pele de adulto, incluindo manutenção e congelamento de queratinócitos. O objetivo geral deste método é gerar queratinócitos humanos primários que podem ser usados como um modelo para estudar Biologia cutânea in vitro.

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Protocolo

A coleta de amostras de pele de voluntários adultos saudáveis, submetidos à cirurgia plástica requer aprovação do Comitê de ética das instituições de acolhimento. Este protocolo foi aprovado pelo Regional éticas Comitê da região Midtjylland, Dinamarca (M-20110027). O método descrito aqui é derivado de estudos semelhantes por Maciaq et al . 10 e Liu e Karasek11.

1. isolamento de queratinócitos da pele humana

  1. Começar por fazer as seguintes soluções: 50 mL de solução de glicose de tripsina e 0,1% de 0,25% em DPBS. Mix e filtro esterilizem (0,2 µm) a solução. Prepare-se 10 mL de RPMI-1640 + 2% solução FBS, 50 mL de DPBS e queratinócito meio livre de soro (KSFM). Adicione 250 µ l de gentamicina e KSFM suplementos para 500 mL de KSFM. Pré-aquecer as soluções a 37 ° C antes do uso.
  2. Colete a pele de voluntários adultos saudáveis, submetidos à cirurgia plástica. As amostras de pele usadas são aproximadamente 10 cm x 15 cm, mas podem variar de tamanho. Manter a calma de pele sob transporte transportando amostras de pele em uma caixa de isopor contendo um elemento de refrigeração. Se necessário, a amostra de pele pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite.
  3. Remova a gordura da abaixo da seção de pele usando pinças, bisturis e tesoura esterilizada.
  4. Fivela para fora a seção de pele (aproximadamente 10 x 15 cm) em uma cobertura estéril em cima de uma placa usando agulhas. Primeiro, limpe a pele com uma gaze esterilizada seca. Em seguida, limpe a pele usando uma gaze esterilizada com etanol a 70%.
  5. Utilizando uma plaina de pé, corte da camada superior (epiderme) da seção de pele e colocá-lo em uma placa de Petri de 9 cm. Então, imediatamente Adicione 25 mL da solução de DPBS/tripsina/glicose (preparada na etapa 1.1) para a placa de Petri. Incubar durante 30 min a 37 ° C.
  6. Usando uma pipeta retire a placa de Petri a solução de tripsina/DPBS/glicose e adicionar 10 mL de RPMI-1640 + 2% FBS para inactivar a tripsina.
  7. Usando duas pinças, agora solte as células epidérmicas no meio de delicadamente raspando e agitação epidérmico e dérmico compartimento das secções de pele.
  8. Filtrar a suspensão de células epidérmicas por um filtro de metal (tamanho do furo de 1 mm) e recolher em um tubo de 50 mL. Adicione as restantes secções de pele para um tubo de 50 mL contendo 10 mL de RPMI-1640 sem FBS e vórtice para 10 filtro s. a suspensão através do metal do filtro em um tubo de 50 mL contendo a suspensão de células epidérmicas. Adicione DPBS para um volume total de 50 mL.
  9. Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos a 450 x g, à temperatura ambiente.
  10. Remover o sobrenadante e ressuspender o celular epidérmica em cerca de 10 mL de 37 ° C KSFM dependendo do tamanho do centrifugado. Conte as células usando o azul Trypan método sob microscópio de coloração. O número de células obtidas a partir de uma seção de pele de 10 x 15 cm é aproximadamente 50-100 x 106 células. Cada frasco de cultura2 75cm, transferência de 8 x 106 células juntamente com 12 mL de 37 ° C KSFM. Agite os frascos de cultura para garantir uma distribuição uniforme das células.
  11. Incube os queratinócitos em uma incubadora de 37 ° C, com 100% de umidade e 5% de CO2. Mude o meio após 2 dias e três vezes por semana. Células de passagem quando a cultura é 70-80% de confluencia, que leva cerca de 2 semanas, dependendo da taxa de proliferação de queratinócitos.

2. passagem de queratinócitos

  1. Calor a quantidade adequada de solução de tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C numa incubadora. Uso de 4,5 mL de solução de tripsina-EDTA 0,05% para um frasco de cultura 75 cm2 .
  2. Remova as células médio e adicione frasco de cultura 4,5 mL/75 cm2 pré aquecido solução de tripsina-EDTA 0,05% para as células. Coloque o frasco de cultura na incubadora (37 ° C) e após cerca de 5 min, verifique sob o microscópio, se as células começaram a afrouxar.
  3. Quando aproximadamente 50% das células afrouxaram, Bata suavemente o frasco de cultura contra a mão para soltar as células restantes. Então, para inactivar a tripsina, adicionar 6 mL de RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) para o frasco de cultura 75 cm2 e transferir a suspensão de eritrócitos para tubos de 50 mL.
  4. Lave os frascos de cultura com 3 mL de RPMI 1640 + 2% FBS e adicionar aos tubos de 50 mL. Centrifugar as células por 10 min a 450 x g, à temperatura ambiente.
    1. Ressuspender as células peletizadas em 10 mL de KSFM (37 ° C). Contar as células e transferir 3 x 106 células para um frasco de cultura 150 cm2 junto com 20 mL de KSFM (37 ° C). Agite suavemente o frasco de cultura para garantir uma distribuição uniforme das células. Congele as células, quando a cultura é confluente de 80-90%, o que leva cerca de 4 a 6 dias dependendo da taxa de proliferação de queratinócitos (ver secção 3, congelando o protocolo abaixo). Expanda os queratinócitos para gerar estoques congelados apropriados.

3. congelamento dos queratinócitos

  1. Calor a quantidade adequada de solução de tripsina-EDTA 0,05% a 37 ° C numa incubadora. Uso 9 mL da solução de tripsina-EDTA 0,05% para um frasco de cultura de2 a 150 cm.
  2. Remova as células médio e adicione frasco de cultura 9ml/150 cm2 pré aquecido solução de tripsina-EDTA 0,05% para as células. Coloque o frasco de cultura na incubadora (37 ° C) e após cerca de 5 min, verifique sob o microscópio, se as células começaram a afrouxar.
  3. Quando aproximadamente 50% das células afrouxaram, Bata suavemente o frasco de cultura contra a mão para soltar as células restantes. Então, para inactivar a tripsina, adicionar 12 mL de RPMI-1640 + 2% FBS (37 ° C) para o frasco de cultura de2 a 150 cm e aspire a suspensão de células para tubos de 50 mL.
  4. Lave os frascos de cultura com 6 mL de RPMI 1640 + 2% FBS e adicionar aos tubos de 50 mL. Centrifugar os tubos por 10 min a 450 x g a 4 ° C. Prepare o celular gelada congelamento médio (KSFM + 10% de DMSO).
  5. Ressuspender as células em KSFM + 10% de DMSO, contar as células e congelar as células em uma densidade de 6 x 106 células/mL, usando de métodos de criopreservação de congelamento lento padrão12.
  6. Armazene os queratinócitos em nitrogênio líquido (fase vapor) até que esteja pronto para usar.

4. descongelar e cultivo queratinócitos congelados

  1. Descongele rapidamente os frascos apropriados congelados em banho maria a 37 ° C. Use etanol a 70% para limpar o exterior do cryovial. Transferir o número adequado de células (aproximadamente 15.000 células/cm2) para um balão de cultura e adicione imediatamente meio de cultura previamente aquecido (KSFM) para o frasco de cultura.
    Qualquer tamanho de frascos de cultura pode ser usado dependendo da instalação do experimento.
  2. Use 5 mL de meio de cultura para um frasco de cultura 25 cm2 .
O número de células adicionado que o frasco de cultura pode variar, porque o crescimento das células varia de um doador para o doador. Incube as células em uma incubadora de 37 ° C, com 100% de umidade e 5% de CO2.
  • Alterar o meio depois de 2 dias e três vezes semanalmente usando fresco KSFM previamente aquecido.
    Nota: Nossos dados demonstraram que, em média, 95% das células isoladas pelo protocolo descrito aqui são positivas para o queratinócito-marcador cytokeratine-1413.

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    Resultados

    Diferenciação Terminal induzida por cálcio
    Queratinócitos humanos passam por diferenciação terminal após tratamento com cálcio14,15,16. Queratinócitos humanos primários foram isolados e cultivados conforme descrito no protocolo acima. Quando aproximadamente 50-60% de confluencia, as células foram estimuladas com cálcio (1.2 mM) ou veículo e fotos das células foram tiradas no dia 0, 1 e 2.

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    Discussão

    Aqui, descrevemos como isolar facilmente queratinócitos humanos primários da pele adulta e como a cultura deles em vitro. Este modelo pode ter uma aplicação ampla para a investigação da biologia das células epidérmicas e pode ser útil para pesquisadores interessados no estudo de doenças cutâneas.

    Algumas das vantagens do protocolo descrito aqui é que, em contraste com os queratinócitos isolados do prepúcio neonatal obtido de recém-nascido machos submetidos à circuncisão, queratinócito...

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    Divulgações

    . O autor não tem nenhum conflito de interesses.

    Agradecimentos

    O autor deseja agradecer a Annette Blak Rasmussen e Kristine Moeller para seu suporte técnico

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    Materiais

    Lista de materiais utilizados neste artigo
    NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
    KSFMThermoFisher Scientific17005-034 Meio decultura celular
    Suplementos KSFMThermoFisher Scientific37000-015Suplementos para KSFM
    DPBSThermoFisher Scientific14190-144DPBS sem Cálcio e Magnésio
    DMSOSigma-AldrichD8418Dimetil sulfóxido
    GentamicinaThermoFisher Scientific15710-049Aditivo de meio de cultura de células Filtro
    esterilizaçãoSartorius16534Filtro de seringa com um tamanho de poro de 0,2 µ m
    TripsinaSigma-AldrichT7409Usado para tripsinizar células
    GlicoseSigma-AldrichG7528-RPMI-1640
    ThermoFisher Scientific61870-010-FBS
    ThermoFisher Scientific16000044Usado para inativar tripsina
    Fórceps-Fórceps de qualquer empresa podem ser usados
    Tesouras-Tesouras de qualquer empresa podem ser usadas
    BisturiSwann Morton0501Bisturis de qualquer empresa podem ser usados
    70% de etanol---
    Almofadas de gazeNOBAMED875420Almofadas de gaze de qualquer fornecedor podem ser usadas
    Plaina de péCredo Solingen1510Plaina de pé de qualquer fornecedor pode ser usada
    Placas de PetriTPP93100Placas de Petri de qualquer fornecedor podem ser usadas
    Filtro de metal-Filtro de metal interno de 1 mm de tamanho de furo
    75 cm<>2 Frascos de culturaNUNC156499-150
    cm2TTP90151-0,05
    % Solução de tripsina-EDTAThermoFisher Scientific25300-062Usado para tripsinizar células ao passar
    de de

    Referências

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