Method Article

Protocolo de diferenciação cerebelar 3D simplificada com modificação 2D opcional

DOI:

10.3791/56888

⸱

December 9th, 2017

 , 
1Department of Pediatrics/Child Neurology, Amsterdam Neuroscience, VU University Medical Center, 2Department of Complex Trait Genetics, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Amsterdam Neuroscience, Vrije Universiteit Amsterdam

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descrevemos um meio de protocolo para hPSCs, usando definido de diferenciação 3D simplificado e reduzido os fatores de crescimento, capazes de gerar agregados de células com início neuroepithelial estruturas e positivos para marcadores cerebelar associada, bem como um opcional Modificação de 2D para diferenciar as células como um monolayer para gerar neurônios funcionais.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reduzindo a complexidade e o custo dos protocolos de diferenciação é importante para os investigadores. Este interesse se encaixa com preocupações sobre possíveis efeitos não intencionais que fatores extrínsecos padronização podem introduzir células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) modelos de desenvolvimento do cérebro ou fisiopatologia, tais como mascaramento de fenótipo da doença. Aqui, apresentamos dois protocolos de diferenciação cerebelar para hPSCs, projetado com método de inicialização mais simples, menos factores de padronização e menos exigências materiais do que os protocolos anteriores. Recentemente, desenvolvemos procedimentos de cultura, que geram flutuantes 3-dimensional (3D) produtos consistentes com outros protocolos de "organoides" do cérebro, incluindo morfologias relevantes para o desenvolvimento do cérebro tais como zona ventricular/subde modelagem e rômbicas lábio-como estruturas. O segundo utiliza um procedimento de monocamada aderentes, 2D para diferenciação completa, que é mostrado capaz de gerar neurônios Cerebelares funcionais, como produtos são positivos para marcadores cerebelar associada e exibem afluxos de cálcio como neurônio. Juntos, esses protocolos oferecem cientistas uma escolha de opções adequadas para fins de investigação diferentes, bem como um modelo básico para testar outros tipos de diferenciações neurais simplificadas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro de protocolos de diferenciação hPSCs em direção a linhagens Cerebelares inicialmente operou-se o princípio da imitando na vivo desenvolvimento cerebelar1,2,3,.4. Como tal, eles precisavam de uma sucessão de fatores introduzidos em alturas específicas para conduzir a maturação e padronização pro-cerebelar. Chefe entre estes foram WNT, osso proteínas morfogenéticas (BMPs) e fatores de crescimento do fibroblasto (FGFs) com funções conhecidas no meio do rombencéfalo desenvolvimento e formação do organizador isthmic5,6,7. Claro, cada etapa adicional e fator significam um aumento de manipulações trabalhosas e maior despesa para o pesquisador, e então desenvolver protocolos mais simples capazes de atingir resultados iguais é de interesse. Esse problema prático se encaixa muito bem com a questão hipotética, se as células exigem tal controle apertado, externo ao longo de seu desenvolvimento in vitro.

Para diferenciação cerebelar, um protocolo publicado em 2015 abordou a necessidade de utilizar um número extenso de fatores de crescimento, usando apenas FGF2, FGF19 e fator derivado de células do estroma 1 (SDF1) para padronização de fins8. Este estudo também difere de protocolos Cerebelares anteriores, usando um sistema de livre flutuação cultura 3D. Além de produzir células positivas para marcadores Cerebelares, os cérebro "organoids" gerados por sua técnica foram mostrados para expor a morfologia relevante, indisponível em culturas de monocamada 2D tradicional, tais como estruturas lábio rômbicas. Embora menos complexo e oneroso com relação a fatores de crescimento, outras características tais como a formação dos órgãos do embryoid uniformes (EBs) e cultura em placas de 96 poços (96WPs), fez processualmente complexo durante os primeiros passos. Outro protocolo 3D publicado no mesmo ano, relataram sucesso diferenciação de linhagens neurais, utilizando de técnicas de cultura celular comum e barato9. Embora este grupo estava investigando cortical ao invés de diferenciação cerebelar, aplicação de seu conceito de diferenciação cerebelar não pode ser descontada.

Informamos recentemente um protocolo de diferenciação cerebelar 3D usando um número reduzido de fatores de padronização (ou seja, FGF2, 4 e 8), bem como de uma configuração simplificada, mantendo as células em placas de 6-bem (6WPs) por toda parte para minimizar requisitos média10. Para auxiliar na produção de células do grânulo, smoothened agonista (SAG) foi usada durante a etapa de maturação final. SAG é uma alternativa menos cara de química para sonic hedgehog (SHH), que tinha sido utilizado em anteriores protocolos Cerebelares, devido ao seu papel na promoção do crescimento do grânulo célula precursores (GCP) na vivo1,2, 11,12,13. Diferenciação de produtos foram consistentes com aqueles de outros protocolos 3D, incluindo a presença de marcadores cerebelar associada em estruturas morfologicamente relevantes8,9. Tais resultados reforçam a mensagem anterior que detalhava o mimetismo do na vivo ambiente pode não ser necessário para complexo 3D em vitro protocolos de diferenciação.

Além do protocolo 3D, este relatório descreve um protocolo 2D, projetado com a mesma configuração rápida, materiais básicos e reduziu o número de fatores de crescimento. É capaz de produzir células de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou induzida por células-tronco pluripotentes (hiPSCs), positivas para marcadores associados cedo neural, cerebelar e identidades de célula grânulo. Além disso, a imagem de cálcio indica a presença de neurônios humanos funcionais. A capacidade de escolher entre protocolos, adiciona um nível de flexibilidade para os investigadores, para aqueles interessados em ambos: (1) geração de célula específica, desenvolvimento do cérebro humano (2) modelagem e tipos associados a estruturas, (3) análise otimizada em monocamada configurações (por exemplo, gravações de patch-clamp), ou (4) interações célula-célula em cultura mista neural. Sua natureza simples e de baixo custo torna-las acessíveis para os investigadores que são novos para o campo de hPSC, ou precisam de procedimentos hPSC base para explorar ainda mais opções de diferenciação.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparações

Nota: Para todas as etapas consulte Tabela de materiais para itens específicos.

  1. Preparar 500 mL definido hPSC meio de cultura para cultura hPSC
    Nota: Utilize o meio de passos 2.1-2.6.
    1. Descongelar o hPSC médio suplemento durante a noite (o/n) a 4 ° C. Retire a 12,5 mL de meio base hPSC do frasco médio e, em seguida, adicionar 10 mL de suplemento e 2,5 mL (fazendo 100 U/L) penicilina/estreptomicina (caneta/Strep) no frasco.
    2. Armazenar a 4 ° C e usar dentro de 2 semanas.
      Nota: O hPSC médio pode ser utilizado para congelar células em baixo, adicionando 10 µM ROCK inibidor (RI) e 10% DMSO.
  2. Prepare o suporte de manutenção neural de 1L (NMM) para cultura de diferenciação
    Nota: Use médio para passos 3.1-4.4.
    1. Mix de glutamina fortificada DMEM/F12 e meio base neural (proporção de 1:1) em 1 litro de um garrafa, então suplemento com suplemento de N2 (1x), (1x) B27 de suplemento, 5 µ g/mL insulina, 1,5 mM L-glutamina, 100 µM não aminoácidos essenciais (timina), 100 U/L caneta/Strep e 10 µM Beta-Mercaptoetanol.
    2. Armazenar o médio a 4 ° C e usar dentro de 3 semanas.
      Nota: Antes de adicionar suplementos misto meio basal, retire o volume apropriado para ajustar o volume necessário de adicionado componentes baseados em concentrações estoque.
  3. Preparar 500 mL de solução de trabalho de EDTA 0,5 mM para passagem hPSCs
    Nota: Utilize o meio de passos 2.4 e 2.5.
    1. Sob uma capa de fluxo, transferi 49 mL de fosfato tamponado salino (PBS) de uma garrafa de 500 mL de PBS estéril para um tubo de 50 mL. Adicione 0,5 mL de EDTA 0,5 M e 0,9 g de NaCl para o tubo de 50 mL. Misture suavemente para dissolver.
    2. Filtro-esterilizar solução usando um filtro de 0,22 µm e transferência para o frasco 500 mL de PBS estéril. Armazenar em temperatura ambiente (RT).
  4. Preparar hPSC placas de cultura para cultura hPSC
    Nota: Utilize placas de passos 2.1-2.6.
    1. Fazer 50 x solução de trabalho de revestimento aderente hPSC apropriado (ROSIN APAIVA paiva): descongelar um frasco de ROSIN APAIVA paiva o/n a 4 ° C. Dilua ROSIN APAIVA paiva na proporção de 1:1 com DMEM/F12 e transferência como 400 alíquotas µ l para tubos de 1,5 mL. Armazenar a solução de trabalho 50 x ROSIN APAIVA paiva a-80 ° C.
      Obs: (importante) ROSIN APAIVA paiva solidifica rapidamente na RT, portanto é necessário que todos os componentes (DMEM, tubos, etc.) são mantidos no gelo (ou a 4 ° C).
    2. Descongelar o tubo de 50 x solução de trabalho ROSIN APAIVA paiva a 4 ° C e, em seguida, diluir 50 x em DMEM/F12 frio. Adicione 750 µ l/poço de ROSIN APAIVA paiva diluído para um 6WP. Incubar a placa pelo menos 1 h a 37 ° C.
      Nota: Placas ROSIN APAIVA paiva podem ser armazenadas por 1 semana a 4 ° C, envolvendo o prato após o período de incubação de 1 h. Chapa quente a 37 ° C antes de usar.
  5. Preparar pratos antiadesivo (AA) para cultura de diferenciação
    Nota: Utilize placas de passos 3.1-4.1.
    1. Fazer 5 mg/mL poli (metacrilato de 2-hidroxietil) solução (poli-HEMA) em 95% etanol. Agite o/n a 37 ° C até obter uma solução límpida. Loja em RT.
      Nota: Filtragem através de um filtro de 0,22 µm pode remover poli-HEMA não dissolvido.
    2. Adicione poli-HEMA na placa de cultura, de modo que cobre o fundo de cada poço. Incubar a placa a 37 ° C durante 2 dias e inspecione a placa para garantir a evaporação completa do líquido/uniforme de revestimento de poços. Placas de AA podem ser empacotadas e armazenadas no RT
  6. Preparar as placas de poli-L-ornitina/laminina (PLO/LAM) para cultura de diferenciação
    Nota: Utilize placas de passos 4.2-4.4.
    1. Revestimento da superfície dos poços, usando 20 µ g/mL PLO dissolvido em PBS estéril. Incubar a placa o/n a 37 ° C. PLO de aspirar e lavar 3 vezes com PBS.
      Nota: Prato (opcional) Incubated com PLO pode ser empacotado e armazenado a 4 ° C, até que seja necessário.
    2. Revestir as áreas de superfície dos poços revestidos PLO, usar 10 µ g/mL LAM dissolvida em PBS estéril. Incubar durante pelo menos 2 h a 37 ° C ou o/n a 4 ° C. Remover leite e lavagem poços de 2-3x com PBS, em seguida, adicione imediatamente meio apropriado e/ou células.
      Nota: Solução (opcional) removido LAM pode ser armazenada a 4 ° C e re-usada até 2 vezes. (Importante) Não permitem superfícies revestidas LAM secar; para evitar isto imediatamente adicione o PBS ou meio apropriado.
       

2. Protocolo 1: Livre de alimentador hPSC cultura

Nota: hESCs foram obtidos a partir de uma organização não-comercial (linha H01, consulte Tabela de materiais). Três linhas de controle de hiPSC (hvs51, 60 e 88) foram gerados pela reprogramação de fibroblastos de três pacientes humanos saudáveis (fibroblastos foram derivadas de doadores anônimos, não-identificáveis e, portanto, isentos de aprovação IRB)10, 17.

  1. Manter hPSCs em cultura livre de alimentador
    1. Depois de descongelar e chapeamento hPSCs em placas de ROSIN APAIVA paiva hPSC médio (consulte a etapa 2.2), manter hPSCs a 37 ° C com 5% de CO2. Atualizar hPSC médio diariamente (ver passo 2.3), exceto o dia após o descongelamento ou passagem e examinar as células sob o microscópio (objetivos: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0.25 Ph1) para observar o crescimento taxa e identificar áreas potenciais de diferenciação (Figura 3 , painel superior esquerdo mostra exemplo de diferenciação).
    2. Passagem hPSCs cada 3-4 dias, ou quando a cultura atinge > confluência de 80%. Se a menos de 5% de células exposição diferenciação, uso normal hPSC passagem método (ver passo 2.4), caso contrário, use o método suave (consulte a etapa 2.5). Quando não for necessário na cultura, hPSCs pode ser congelado para armazenamento a longo prazo (ver passo 2.6).
  2. HPSCs de degelo hPSC médio
    1. Transferi o volume necessário de hPSC médio para tubos estéreis para o processo de descongelação (9 tubo criogênico/mL) e a placa de ROSIN APAIVA paiva preparada para receber células descongeladas. Completar o médio em ambos os tubos com 10 µM de RI.
    2. Recupere o criotubo de LN2 armazenamento e lugar diretamente em um banho de água (37 ° C). Quando apenas uma pequena restos de cristal de gelo, retire do banho e transferir o conteúdo do tubo criogênico do tubo para o processo de descongelamento (total de volume de 10 mL). Centrifugar o tubo a 290 x g durante 5 min à RT
    3. Usar uma pipeta sorológica para remover a ROSIN APAIVA paiva solução dos poços da placa ROSIN APAIVA paiva (consulte a etapa 1.4) destinado a receber as células e adicionar hPSC médio com 10 µM de RI.
      Nota: (importante) fazer não aspirado solução ROSIN APAIVA paiva com uma agulha de aspiração, ou ele pode solidificar e entupir as linhas para a bomba de vácuo.
    4. Remover o sobrenadante do tubo e ressuspender as células hPSC médio com 10 µM de RI. Distribua as células para a placa de destino na proporção de 1 tubo criogênico/poço de 6WP. Incubar a 37 ° C com 5% de CO2e não se refrescar médio para 1 dia.
      Nota: Arranque células em 5% O2 pode aumentar a sobrevivência da pilha.
  3. Atualizar o hPSC médio
    1. Aquecer o volume necessário de hPSC médio em um tubo estéril no RT ou num banho de água; sugere-se 2 mL/poço das 6WP.
      Nota: (Opcional): adicionando uma quantidade extra de hPSC médio, hPSCs pode ficar mais um dia sem atualizar; no entanto, não permita mais de uma vez por semana.
    2. Aspire o meio de poços contendo hPSCs e adicionar hPSC fresco médio.
    3. Cultura do hPSCs em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.
  4. Passagem hPSCs médio/hPSC
    1. Transferi o volume necessário de hPSC médio para tubos estéreis, por processo de passagem e para a preparação da placa ROSIN APAIVA paiva receber células passadas. Completar o meio para a placa de destino com 10 µM de RI. Aqueça os tubos no RT ou num banho de água.
      Nota: Preparação e manipulação serão diferentes se usar um material de revestimento alternativo que um listado na Tabela de materiais.
    2. Usar uma pipeta sorológica para remover a ROSIN APAIVA paiva solução dos poços da placa ROSIN APAIVA paiva (consulte a etapa 1.4) destinado a receber as células e adicionar hPSC médio com 10 µM de RI.
      Nota: (importante) que não aspire a solução ROSIN APAIVA paiva com uma aspiração da agulha, que possa solidificar e entupir as linhas para a bomba de vácuo.
    3. Aspire o meio de poços com hPSCs para ser passadas, lavar as células duas vezes com 0,5 mM EDTA, em seguida, adicionar 0,5 mM EDTA e incubar durante 2-5 min a 37 ° C.
      Nota: 1 mL/poço de 6WP é um volume suficiente de EDTA para lavagem e incubação.
    4. Verifique os poços sob o microscópio (objetivos: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0.25 Ph1). Se as células estão começando a se destacar, Aspire a solução de EDTA e células descarga livre usando hPSC médio.
      Nota: (importante) tome cuidado para não remover toda hPSC colônias quando aspirar EDTA (não espere até que todo colônias são desanexando). Não liberar células mais do que 5 vezes como isso pode prejudicar o hPSCs e afetam a pluripotência. Além disso, não deixe células perante hPSC médio com RI rubor células de poços, como eles podem re-aderir à placa.
    5. Com base na determinação empírica (geralmente relacionada a confluência, tamanho das colônias e a taxa de crescimento), transferir hPSCs aos poços da placa de destino usando uma divisão relação de 1:4-1:16 (ou seja, 1 poço da placa original de 4 poços do destino placa). Incubar a 37 ° C com 5% de CO2e não se refrescar médio para 1 dia.
      Nota: Divisão de proporções tão altas quanto 01:16-01:20 são possíveis de evitar aglomeração e melhorar a aparência das colônias.
  5. HPSCs de passagem usando o suave-método (G)
    1. Transferi o volume necessário de hPSC médio para tubos estéreis, para o processo de passaging e para a preparação da placa ROSIN APAIVA paiva receber células passadas. Completar o meio para a placa de destino com 10 µM de RI. Tubos quentes no RT ou em banho-maria a 37 ° C.
    2. Pipeta sorológica uso para remover ROSIN APAIVA paiva solução de poços da placa ROSIN APAIVA paiva (consulte a etapa 1.4) destinado a receber as células e adicionar hPSC médio com 10 µM de RI.
      Nota: (importante) fazer não aspirado ROSIN APAIVA paiva com uma agulha de aspiração, ou ele pode solidificar e entupir as linhas para a bomba de vácuo.
    3. Aspire o médio dos poços com hPSCs para ser passadas e lavar as células duas vezes usando 0.5 mM EDTA. Na segunda lavagem, espere 30 s antes de aspirar o EDTA, então adicione 1 mL de PBS e incube por 4-9 min a 37 ° C. Enquanto espera, prepare um tubo estéril com 4 mL de PBS.
      Nota: 1 mL/poço de 6WP é um volume suficiente de EDTA para lavar.
    4. Verifique os poços sob microscópio (objetivos: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0.25 Ph1). Se as células estão começando a retirar, cuidadosamente, bata nos lados da placa para ajudar livre colônias. Quando > 50% das colônias são livres de flutuante, usar uma pipeta sorológica 5ml para transferir colônias em 1 mL de PBS para o tubo contendo 4 mL de PBS (não triture).
      Nota: (importante) desde que o objetivo é limpar o hPSC cultura, verificação para determinar se diferenciadas células permanecem anexado à placa. Além disso, não é necessário para a passagem de todas as colônias em um bem usando este processo, então colônias que permanecem anexadas podem ser deixadas para trás.
    5. Espere 5-10 min a RT para células resolver no tubo (não centrifugar). Aspire PBS do tubo, cuidando para não remover hPSCs resolvido. Cuidadosamente Ressuspender as células em meio de hPSC (não triture) e transferir as células para a placa de destino usando uma divisão relação de 1:4-1:16. Incubar a 37 ° C com 5% de CO2e não se refrescar médio para 1 dia.
  6. Congelar para baixo hPSCs
    1. Dependendo da confluência, use 1 bem de hPSCs, em 2-3 dias (máximos) em cultura, para encher frascos de criopreservação de 1-2 para armazenamento em LN2.
    2. No final da passagem (etapa 2.5), usar 500 µ l ou 1 mL de meio de hPSC transferir células de 1 bem de 6WP para 1 ou 2 frascos de criopreservação, respectivamente (500 µ l/frasco). A cada tubo, adicione 500 µ l de 2 x congelamento médio contendo hPSC médio, 20 µM RI e 20% DMSO.
      Nota: As células (opcional) podem ser transferidas diretamente em 1x congelamento médio em 1 mL/frasco.
    3. Coloque os tubos criogênicos em um recipiente criogênico (contendo isopropanol) previamente resfriados a 4 ° C e imediatamente em-80 ° C.
    4. No dia seguinte, transfira os tubos criogênicos para um tanque de2 LN para armazenamento a longo prazo.

3. protocolo 2: 3D "organoides" diferenciação

  1. Instalação de diferenciação com G-método modificado da passagem de hPSCs
    1. Transferi o volume necessário de NMM para o número de poços de destino para um tubo estéril. Suplemento com 4 ng/mL FGF2 e 10 µM RI. Aquecer o tubo médio no RT ou em banho-maria a 37 ° C.
      Nota: Dependendo da confluência dos poços de originação, hPSCs estão concentrados durante a distribuição para a placa de destino em um 2:1 ou 3:1 ratio (ou seja, 2 poços da placa original de 1 bem da placa de destino), com um volume final de 2,5 mL/poço de 6WP.
    2. Aspire o meio de poços que contém hPSCs para ser diferenciado e lavar as células duas vezes usando 0.5 mM EDTA. Na segunda lavagem, espere 30 s antes de aspirar o EDTA, então adicione 1 mL de PBS e incube por 4-9 min a 37 ° C. Enquanto espera, prepare um tubo estéril com 4 mL de PBS.
      Nota: 1 mL/poço de 6WP é um volume suficiente de EDTA para lavar. (Importante) É preferível usar hPSCs que eram não mais de 3 dias em cultura após a última passagem e pelo menos 1-2 passagens após o descongelamento.
    3. Verifique poços sob o microscópio (objetivos: 2.5x/0.06, 5 x / 0.12 Ph0, 10 x / 0.25 Ph1). Se as células estão começando a desanexar, livre as células tocando suave nas laterais da placa. Transfira as células para um tubo contendo 4 mL de PBS com uma pipeta de 5 mL.
      Nota: (importante) leve rubor e trituração é permitido para quebrar acima colônias e recolher pilhas soltas, mas ignorar as células que permanecem aderidas à placa.
    4. Permitir que o tubo se sentar por 10 min em RT, para separação de gravidade. Opcionalmente, Centrifugar as células levemente (não superior a 200 g de x em RT, por 5 min) se necessário.
    5. Aspire a PBS do tubo, cuidando para não remover hPSCs resolvido, Ressuspender as células em NMM com 4 ng/mL FGF2 e 10 µM RI e depois distribuir a placa AA-revestido na proporção de 2:1 ou 3:1. Incubar a 37 ° C com 5% de CO2e não atualizar o médio durante 3 dias, a menos que exigido (ver passo 3.2.1).
      Nota: (Opcional) para a conveniência da transferência de células, adicione uma porção do meio de cultura aos poços da placa de destino antes da distribuição e ressuspender as células em um volume menor. Além disso, hPSCs pode ser manchado e contados definir a densidade exata de célula inicial. No entanto, o volume final da placa de destino deve ser 2,5 mL/poço das 6WP.
  2. Manter a cultura livre flutuação diferenciação a 37 ° C (5% CO2)
    1. Verifique as placas de todos os dias para que as alterações na cor média, acúmulo de células mortas, aglutinando e adesão ao bem fundo.
      1. Opcional: Independentemente do médio alterar agendamento, atualizar (incluindo os 3 primeiros dias do não refrescante) o meio se transformou amarelo e siga as instruções para alterar/atualizar médio (passo 3.3). Se a maioria das células aparece morta, siga as instruções para alterar/atualizar médio com separação de gravidade (passo 3.4).
        Nota: Formação de EBs e crescimento em agregados de células grandes são esperados, mas células e agregados de células podem aglutinar-se em grandes massas não devido ao crescimento individual/proliferação. Se isto for observado, trituração luz romper massas é admissível. Se células começam a aderir à superfície da placa de AA, os restantes flutuante conteúdo dos poços podem ser transferidos diretamente para novos poços ou transferidos durante o processo de alteração/atualização médio. Não tente transferir células que tenham aderido à placa.
    2. No dia 3, altere o meio para NMM com FGF2 de 4 ng/mL. Atualize o meio todos os dias.
    3. No dia 7, altere o meio para NMM com 1 µM 4 ng/mL FGF2, 100 ng/mL FGF8B e ácido retinoico (RA). Atualize o meio todos os dias.
      Nota: (importante) RA é sensível à luz. Protege as amostras de cultura RA da luz.
    4. No dia 14, mude o meio de NMM com 100 ng/mL FGF8B, FGF4 de 100 ng/mL e 20 ng/mL FGF2. Atualize o meio todos os dias.
    5. No dia 17, mude o meio de NMM com 100 ng/mL FGF8B. Atualize o meio todos os dias.
    6. No dia 21, mude o meio de NMM com 100 ng/mL cérebro derivada Neurotrophic Factor (BDNF) e 10 ng/mL gliais derivado Neurotrophic Factor (GDNF). Atualize o meio todos os dias.
    7. No dia 28, mude o meio de NMM com 100 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF, SAG, 100 ng/mL fator Neurotrophic 3 (NT3) e 25 mM KCl. Refresh o meio de todos os outros dias de 3 ng/mL.
    8. No dia 35, recolha o organoids 3D para análise.
  3. Alteração/atualização meio de diferenciação de cultura 3D
    1. Transferi o volume necessário de NMM com os componentes apropriados (ver 3.2.2-3.2.7 passos para programação de componente) para um tubo estéril. Quente em banho maria a 37 ° C.
    2. Dica da placa e agite suavemente até que as células se acerte para as extremidades inferiores dos poços. Cuidadosamente, remover 2 mL do meio antigo, usando uma pipeta sorológica, evitando a remoção das células, em seguida, adicione 2 mL de meio fresco. Incube a 37 ° C com 5% de CO2.
      Nota: O volume de (importante), o fim deve ser 2,5 mL/poço de 6WP. Se ocorrer evaporação, não remova 2 mL do velho médio como este iria secar ainda mais as culturas de células; em vez disso, adicione meio extra.
  4. Meio de diferenciação de alteração/atualização com separação de gravidade
    1. Transferi o volume necessário de NMM com os componentes apropriados para um tubo estéril. Quente em banho maria a 37 ° C.
    2. Transferir o conteúdo dos poços a um tubo estéril e permitir que o tubo se sentar por 10 min em RT, para separação de gravidade.
    3. Usar uma pipeta para remover o antigo médio do tubo, tomando cuidado para não remover células, Ressuspender em NMM com componentes apropriados, estabeleceu-se e depois distribuir para novos poços revestidos AA. Incube a 37 ° C com 5% de CO2.
      Nota: (Opcional) para sua conveniência, uma porção do meio de cultura pode ser adicionada para o destino poços antes da distribuição, com diferenciação de células resuspended em um volume menor. O volume final deve ser 2,5 mL/poço das 6WP.

4. protocolo 3: Alternativa 2D diferenciação cultura

  1. Iniciar e manter a cultura usando as etapas conforme seção 3 para protocolo 3D através de dia 12
    1. Segui etapas 3.1-3.2.3 e médio de alteração/atualização conforme as etapas 3.3 e 3.4.
  2. Alternar para e manter como cultura monocamada 2D
    1. No dia 13 de diferenciação, siga as instruções para alterar/atualizar meio com separação de gravidade (passo 3.4), distribuir apenas células/agregados para placa PLO/LAM revestido (ver passo 1.6) com um volume final de 2,5 mL/bem de 6WP.
      Nota: O meio pode ser suplementado com 10 µM RI durante o chapeamento inicial para ajudar a aderência e a sobrevivência das células. (Importante) É desejável para espalhar uniformemente as células dos poços, para evitar baixa densidade ou aglomeração nas placas e a passagem (consulte a etapa 4.4) conforme necessário. O tamanho preferencial de PLO/LAM revestido de placas (i.e., 6WP, 12WP, etc.) deve ser determinado empiricamente, com base na taxa de proliferação para a linha de celular e finalidade do produto. Instruções darão volumes para 6WP e podem ser convertidas pela metade para cada duplicação do número bem (ou seja, 2 mL/bem por 6WP, 1 mL/bem para 12WP, etc)
    2. No dia 14, mude o meio de NMM com 100 ng/mL FGF8B, FGF4 de 100 ng/mL e 20 ng/mL FGF2. Atualize o meio todos os dias, conforme descrito no passo 4.3.
    3. No dia 17, mude o meio de NMM com 100 ng/mL FGF8B. Atualize o meio todos os dias, conforme descrito no passo 4.3.
    4. No dia 21, mude a médio NMM com 100 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF. Atualize o meio todos os dias, conforme descrito no passo 4.3.
    5. No dia 28, mude o meio de NMM com 100 ng/mL BDNF e 10 ng/mL GDNF, SAG de 3 ng/mL, 100 ng/mL NT3 e 25 mM KCl. Refresh o meio todos os dias, conforme descrito no passo 4.3.
    6. No dia 35, coletar as células para análise, ou manter a mesma médio como etapa 4.2.5 para cultura estendida (limite potencial não testado).
  3. Alteração/atualização meio de diferenciação de cultura 2D
    1. Transferi o volume necessário de NMM com componentes apropriados (ver 4.2.2-4.2.5 passos para programação de componente) para um tubo estéril. Quente em banho maria a 37 ° C.
    2. Aspire o meio dos poços e, em seguida, adicionar 2 mL de meio de novo. Incube a 37 ° C com 5% de CO2.
      Nota: (Opcional) o fim de volume pode ser mantido em 2,5 mL/bem de 6WP, usando uma pipeta para remover a 2 mL do meio velho e adicionar 2 mL de meio fresco. Reservando uma parte do velho médio nos poços e células prevenção do contato do ar, pode diminuir o choque para as células durante as etapas de mudança.
  4. Cultura de diferenciação 2D de passagem
    1. Transferir o volume necessário de NMM com os componentes apropriados (ver 4.2.2-4.2.5 passos para programação de componente) para tubos estéreis, por processo de passagem e, separadamente preparar o PLO/LAM revestido chapa para receber células passadas. Completar o meio da placa de destino com 10 µM de RI. Aqueça os tubos no RT, ou em banho maria a 37 ° C. Para economizar componentes, é possível usar o NMM sozinho para lavagem de células durante o processo de passaging.
      Nota: (importante) se forem usados produtos em imagens de cálcio de experimentos, certifique-se de células de passagem entre 2 a 6 dias antes do final de diferenciação.
    2. Aspire o meio de poços para ser passadas. Adicionar 300 µ l/poço de agente baseado em tripsina dissociação (ver Tabela de materiais), placa de redemoinho para cobrir os poços e, em seguida, remova imediatamente o agente de dissociação.
    3. Deixar a placa se sentar por 2 min em RT e, em seguida, solte as células tocando os lados da placa. Adicionar inibidor de 600 µ l/poço definido tripsina (DTI) e transferir as células no DTI para um tubo estéril com 5 mL NMM.
    4. Centrifugar o tubo a 290 x g, durante 15 min em RT. Aspire o meio e adicionar outro 5ml NMM ao tubo.
    5. Centrifugar o tubo a 290 x g, durante 15 min em RT. Aspire o meio e ressuspender as células em meio adequado contendo RI.
    6. Distribuir as células na placa PLO/LAM usando uma divisão relação de 1:1-1:12, dependendo a confluência inicial, taxa de proliferação e tamanho diferencial na origem para a placa de destino e manter a 37 ° C com 5% de CO2.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Visão geral visual do crescimento reduzido Factor de protocolos de diferenciação cerebelar 2D e 3D
A Figura 1 mostra o cronograma global para os protocolos de diferenciação cerebelar 2D e 3D, identificação de fatores extrínsecos e tempo do chapeamento. O progresso típico para hPSCs, passando por diferenciação cerebelar 3D é representado na Figura 2: com hESC linha H01 como colônias no cultura livre de alimentador no dia 0 (superior esquerdo da figura); passando por formação EB por dia 2 (médio superior); crescendo em grandes agregados de células com lúmen aparente após indução neural com RA e FGF8 no dia 14 (superior direito); formação de agregados de tamanho variável e forma no dia 28 (canto inferior esquerdo); desenvolvimento de complexidade com diferentes estruturas de um único agregado indicado no dia 28 (médio inferior); e com continuidade mudanças morfológicas para as mesmas estruturas no dia 35 (inferior direito). O progresso típico para hPSCs, passando por diferenciação cerebelar 2D é representado na Figura 3: com hESC linha H01 como colônias na cultura do alimentador-livre no dia 0 (canto superior esquerdo da figura, com círculo indicando a área de células diferenciadas entre colônias hESC) ; passando por formação EB por dia 2 (médio superior); crescendo em grandes agregados de células com lúmen aparente após indução neural com RA e FGF8 no dia 13 (superior direito); se proliferando como células aderentes após chapeamento no dia 14 (canto inferior esquerdo); e depois como uma monocamada de células com morfologia mais complexo/maduro no dia 35 sob alta ampliação (inferior direito) e baixo (médio inferior).

Marcadores de exposição de produtos 3D e estruturas de Neuroepithelium início
Figura 2 (imagem inferior esquerda) e a Figura 4 mostra a heterogeneidade da morfologia de agregados 3D vista em todo o cultivo, devido à variação crescimento e/ou taxas de maturação, bem como a fusão estocástico ou desfazer-se dos agregados. Apesar da heterogeneidade, cada diferenciação produz agregados exibindo primeiros marcadores neurais e neuronais, incluindo o marcador de grânulo cerebelar ZIC1, como indicado por imunocitoquímica (ICC) coloração na Figura 5. Mais importante, a Figura 5 e Figura 6 sugerem que uma cultura 3D simples, com redução de fatores de crescimento, é capaz de gerar agregados com estruturas complexas relacionadas com o desenvolvimento do cérebro, tais como o neuroepithelium precoce e lábio rômbico.

2D produtos exibem atividade Neuronal funcional e marcadores Cerebelares
Enquanto culturas 2D não podem reproduzir estruturas 3D complexas, são capazes de gerar células exibindo primeiros marcadores neurais e neuronais, incluindo o marcador de célula grânulo cerebelar ZIC1, conforme indicado pela ICC coloração na Figura 7. Análise de expressão do gene através de RT-PCR, como visto na Figura 8, oferece suporte a resultados de coloração de ICC, embora a presença do marcador de célula grânulo cedo ATOH1 é variável entre as experiências e as linhas. Imagem de cálcio é mais facilmente tratada na cultura 2D. Como visto na Figura 9, suplementar Video 1e 2 de vídeo suplementar, eletricamente estimulado as células apresentam fluxos de cálcio que são típicos de disparo neuronal padrões, sugerindo que a geração de neurônios funcionais.

figure-results-1
Figura 1: linha do tempo do protocolo de diferenciação (iniciando no dia 0 de diferenciação). Caixas de linha sólida indicam quando fatores específicos são adicionados ao meio de cultura, e caixas de linha pontilhada indicam placa-revestimento para modificação 2D opcional. Por FGF2, na seta para baixo refere-se a concentrações inferiores (4 ng/mL), e a seta para cima refere-se a umas concentrações mais elevadas (20 ng/mL). Esta figura foi modificada de Holmes e Heine10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: imagens brightfield representante do protocolo 3D. hESC colônias no d0, EBs em d2, agrega após indução no d14, agregados de diferente tamanho e morfologia (numerados de 1-5) no d28, um único agregado com exclusivos, identificáveis características (indicadas por letras um–c) no d28, e mudanças visíveis nas mesmas características em d35. Barra de escala = 100 µm. Esta figura foi modificada de Holmes e Heine10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: imagens brightfield representante do protocolo 2D. hESC colônias um d0, EBs em d2, agrega após indução no d13, depois chapeamento agregados no d14, após maturação em d35, como visto em 5x ampliação e ampliação de 20 x. O círculo branco no painel superior esquerdo mostra a área de células diferenciadas entre colônias hESC. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Brightfield imagens mostrando a variação de tamanho e complexidade na cultura 3D. Agregados em dia (A) 8 (hESCs) e (B) d35 (hiPSCs). A última imagem é composta de três imagens separadas para mostrar todo o agregado. Ambos os agregados podem ter sido afetados pela fusão de agregados ou perda (interrompendo) de estruturas menores. Barra de escala = 200 µm. Esta figura é republicada de Holmes e Heine10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: imagens de ICC de produtos 3D mostram marcadores relevantes e estruturas. Na cultura d35, exposição produtos 3D: PAX6 (verde) e TBR2 (vermelho) pelo lúmen da formação de Roseta, como neural (primeira linha); DCX (verde) e NeuN (vermelho) da zona ventricular de borda externa (VZ)-como estruturar (segunda linha); KIRREL2, um marcador associado com neuroepithelium cerebelar (terceira fila, à esquerda); e ZIC1 um marcador associado com grânulo cerebelar células (terceira fila, direita). O experimento foi conduzido várias vezes usando quatro hPSC diferentes linhas: linha hESC H01 (n = 5) e hvs88 de linhas de iPSC (n = 4), hvs60 (n = 3) e hvs51 (n = 1). As setas apontam para Rhombic lábio (RL)-como estrutura. Barra de escala = 100 µm. Esta figura é republicada de Holmes e Heine10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: estrutura em forma de zona ventricular em grande escala em 3D produto. Na cultura d35, um agregado de hESC-derivado é positivo para PAX6 (verde) e TBR2 (vermelho), comumente associados com primeiros neurônios encontrados dentro de zonas ventriculares (VZs) e zonas subventricular (SVZs), em vivo. (Topo) Um asterisco (*) marca o lado apical de uma região, como VZ correndo ao longo da borda do agregado, com colchetes, indicando a profundidade/divisão de VZ / SVZs. (médio) mesclada sinais mostram secções dispersas de PAX6 + TBR2-células aumentando de tamanho em direção a extremidade superior direita do VZ. (Parte inferior) Imagem de ampliação mais elevada da seção indicada por um retângulo no painel do meio. Barra de escala = 100 µm. Esta figura foi modificada de Holmes e Heine10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-7
Figura 7: imagens de ICC de produtos 2D mostram marcadores pertinentes. No cultura d35, exposição de produtos 2D, de hESCs (linha superior) e hiPSCs (linha inferior), células positivas para: marcador de célula grânulo ZIC1 e marcador de neurônio cerebelar migratórias TAG1 (coluna da esquerda); e Neurofilamento marcador neuronal (NF) e TAG1 (coluna direita). Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-8
Figura 8: RT-PCR de produtos 2D. análise da expressão do mRNA da linha hESC H01 (linha superior) e hiPSC linha hvs60 (linha inferior) no final da 2D protocolo mostra produtos com eletroforese em gel para: marcador de célula grânulo ZIC1, grânulo célula marcador ATOH1, marcador migratórias neurônio cerebelar TAG1, Purkinje marcador de célula muscular (CALB), canal de cálcio dependente de voltagem CACNA1A (1A-C), CACNA1E (C-1E), ácido gama - aminobutírico (GABA) receptor de B 1 (G-Br1) e serviço de limpeza gene EIF4G2).

figure-results-9
Figura 9: imagem de cálcio/análise de produtos 2D. Na cultura d35, produtos de diferenciação hPSC foram gravados por 2 min sob o microscópio, após incubação com tintura de fluor5. Em 30 s, células foram estimuladas eletricamente para 10 s 10 Hz. (A) ainda imagens Mostrar hESCs em 0 s (à esquerda) e após o início da estimulação elétrica em 30 s (à direita). As setas indicam a região de interesse (ROI) para análise do influxo de cálcio. Mostrando de análise gráfica (B) mudança de fluorescência relativa versus tempo para ROI (mudar na fluorescência = (F-F0) f0, onde F0 = (∑F1-n) / n), com picos de neurônio-como ocorrem antes, durante e após a estimulação. Barra preta indica o comprimento da estimulação elétrica. (Branco) da barra de escala = 50 µm. completo de gravação para hESC (como visto aqui) e uma linha de hiPSC (não mostrado) estão disponíveis em vídeo complementar 1 e complementar a 2, respectivamente. As gravações são em formato AVI, em velocidade de 4x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar vídeo 1: cálcio de imagens vídeo do produto 2D da linha hESC H01. Na cultura d35, produtos de diferenciação hESC linha H01 foram gravadas por 2 min sob o microscópio, após incubação com fluor5 de tingem. Em 30 s, células foram estimuladas eletricamente para 10 s em 10 Hz. gravações foram feitas em 2 frames/s e transformadas em vídeo AVI em ~ 7 frames/s, produzindo um vídeo duração ~ 30 s, a velocidade de ~ 4 x. Clique aqui para baixar este arquivo.

Suplementar vídeo 2: cálcio de imagens vídeo do produto 2D de hiPSC linha hvs51. Na cultura d35, produtos de diferenciação de hiPSC linha hvs51 foram gravados por 2 min sob o microscópio, após incubação com tintura de fluor5. Em 30 s, células foram estimuladas eletricamente para 10 s em 10 Hz. gravações foram feitas em 2 frames/s e transformadas em vídeo AVI em ~ 7 frames/s, produzindo um vídeo duração ~ 30 s, a velocidade de ~ 4 x. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Complexidade e os custos são factores relevantes para pesquisadores de células-tronco ao escolher ou desenvolvimento de protocolos de diferenciação. Isto é especialmente verdadeiro porque é uma questão em aberto de quanto controle externo é necessário para gerar tipos de células desejado, ou — para posar é diferente — como hPSCs competentes estão em produzir seu próprio ambiente de desenvolvimento, se deixou a mesmos com suficiente nutrientes. Introdução de fatores extrínsecos em vitro pode muito bem produzir produtos da célula desejada, mas eles também podem interferir com as capacidades do desenvolvimento intrínsecas células que comparecemos na vivo. Tais considerações são importantes, especialmente se o objetivo é o uso de derivados de paciente iPSCs para modelagem de doença. Uso extensivo de padronização e/ou fatores de crescimento pode mascarar fenótipos de doença. Os protocolos detalhados neste relatório seguem a tendência de estudos anteriores para reduzir a complexidade, custo, e/ou uso de padronização extrínsecos fatores8,9.

Com base em resultados relatados por Muguruma et al e nosso próprio estudo recente, parece que é possível conseguir diferenciação para destinos Cerebelares sem esforços concertados para reproduzir condições na vivo , como estudos anteriores feitos 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10. a parte intrigante é que os dois estudos usado diferentes conjuntos de fatores de crescimento, sugerindo que o conjunto nem eram necessário, embora ambos usados FGF2. Nós fizemos testes adicionais, onde FGFs seletivamente foram excluídos do protocolo e mostrou que as células eram capazes de gerar os mesmos produtos sem extrínseco FGFs10. Diferenças entre nossos estudos foram qualificadas pelo fato de que usamos hPSC diferentes linhas e métodos de cultura, induziu a diferenciação neural com RA e incluíram componentes para oferecer suporte a sobrevivência da pilha do grânulo e maturação (BDNF, GDNF, SAG e KCL)11 –14. Além disso, um método de inicialização menos complexo, em comparação com Muguruma et al., foi empregado. O protocolo deles começou gerando EBs uniforme em 96WPs, que isolado-los fisicamente e quimicamente uns dos outros. O protocolo aqui tinha todos os EPS relativamente amontoados em 6WPs durante a formação de EB, o que permitiu que eles interajam livremente. Como isto pode ter diferencialmente afetado o ambiente físico e químico de EBs e organoids posterior (incluindo produção intrínseca de sinalização compostos) é desconhecido e pode ser explorado. Além disso, enquanto mostramos a expressão de genes associados — e tão sugestivos de — origem cerebelar, localizada dentro de estruturas morfologicamente semelhantes aos relatados por Muguruma et al., não podemos excluir geração de neuronal-como estruturas que são de identidade não-cerebelar. Estudos futuros, usando um grande painel de anticorpos como aqueles relatados por Muguruma et al (ou seja, ATOH1, CALB, etc) tornaria tais atribuições e comparação entre produtos de ambos os protocolos, mais conclusivos.

Dentro do protocolo 3D, isso é importante para começar e manter um número suficiente de células em cultura para garantir um número suficiente de produtos finais para análise. Dada a significativa mortandade cedo no protocolo, recomendamos começar com mais de 500 EBs/bem durante os 3 primeiros dias na cultura (Figura 1). Isto não deve ser difícil de alcançar determinada colônia tamanhos para hPSCs na cultura do alimentador-livre, mas pode não ser tão fácil para aqueles que ainda utilizam métodos alimentador-dependente. Dado o grande número de células, é importante prestar atenção para a alteração de cor no meio (indicando as alterações do pH) e acúmulo de células mortas. Ambos devem ser corrigidos para evitar o colapso da cultura. Também pode haver aglutinação de células e agregados em estruturas maciças. Embora ainda pode resultar em agregados que podem ser analisados, quantidade de produto será bastante reduzida, portanto, quebrando-os em agregados menores com trituração suave pode ser útil. No entanto, evitar agregados normais perturbadoras, que eles mesmos podem crescer até tamanhos grandes (Figura 4). Se agregados tornam-se muito esparsos, é aconselhável combinar os poços para que os agregados não são completamente isolados. Variabilidade do produto (em número, tamanho e morfologia) é um problema bem conhecido em cultura de células 3D, inclusive para aqueles protocolos começando com isolado, uniformes EB formação passos, sugerindo que um procedimento de inicialização menos complexo (tais como o protocolo descrito aqui ) pode ser mais prático8,15. Embora esta heterogeneidade é algo pesquisadores precisam manter em mente, particularmente durante a análise, o protocolo relatado gerado produtos consistentes com aqueles encontrados em outros protocolos 3D8,9,15. Baseado no tamanho e morfologia, eles caem dentro do intervalo de Roseta neural de organoides cerebral, conforme descrito em uma recente revisão por Kelava e Lancaster15, com o mais adequado à classificação de esferoide. Particularmente notável, são a presença de estruturas 3D sugestivos de rosetas neurais com lúmen, zonas ventriculares (sub) e rômbico-lábio como características (Figura 5 e Figura 6) identificados por outros grupos8 , 15 , 16 , 17. desde que cada experimento produzido pelo menos um agregado com putativos VZ/SVZs e marcadores cerebelar associada (ZIC1, KIRREL2), são critérios úteis para determinar o sucesso de uma diferenciação 3D usando nosso protocolo, com RL-like características, fornecendo apoio adicional. Estender o comprimento de cultura passados 35 dias não foi testado, mas seria possível para determinar a extensão máxima de crescimento, a complexidade e maturidade permitido por esta técnica.

O protocolo 2D usa a mesma formação de EB não-aderente e o processo de indução neural como o protocolo de 3D e então os comentários acima também se aplica. Uma vez chapeado, um conjunto de considerações diferentes deve ser considerado. O EBs devem aderir rapidamente para as células a proliferar para fora na placa. Se houver problemas com a aderência, adição de RI (se não já usado), reduziram o volume de meio, ou experimentais alterações na concentração de PLO/LAM podem ser aplicadas. É importante manter as células de crescimento muito densa ou escassa (de preferência crescido entre 20-80% confluência) dos poços; acompanhamento diário e oportuna passagem é importante, para evitar células acabou-confluência ou flutuantes. Ao contrário do protocolo de 3D, não deve haver significativa mortandade durante a cultura, embora possa haver zonas de crescimento pobre, ou uma desaceleração das taxas de proliferação. Passagem afeta o estado de maturação das células (por exemplo, remoção de processos celulares e redes desenvolvidas entre as células) e deve ser mantido em mente quando se aproxima de pontos onde as células serão recolhidas ou analisadas de alguma forma. Por exemplo, para o cálcio de imagem é muito importante para as células de passagem entre 2 a 6 dias antes da análise. Passagem muito perto de análise pode significar células não tiveram tempo para se conectar e/ou madura e longe demais podem resultar em células superlotação, dificultando a imagem latente. Embora possam existir variabilidade entre experiências, resultados são consistentes com aqueles relatados na inicial 2D cerebelar protocolos1,2. Análise de expressão de gene e coloração ICC corroboram a presença de células positivas para o marcador de célula grânulo ZIC1, enquanto também identifica marcadores associados com outras identidades neurais e Cerebelares (Figura 7 e Figura 8). Imagem de cálcio, que envolve a estimulação elétrica das células incubadas com tintura de fluor5, indicou atividade neuronal funcional (Figura 9, suplementar 1 Figurae suplementar a Figura 2), embora não está confirmado se estes eram células grânulo. É discutível que, dando as células mais tempo para amadurecer, estendendo o comprimento da cultura últimos 35 dias, aumente a quantidade de atividade neuronal funcional. Este potencial pode ser explorado no futuro.

Além das linhas de pesquisa acima sugeridas, que seria de interesse para determinar diferenças nas identidades de produto (quantidade e qualidade) entre os protocolos 2D e 3D. A importância da FGFs extrínsecas não foi testada no protocolo 2D, e seria útil saber se a falta de estrutura 3D depois de chapeamento, e então as vias de sinalização associadas, tornaria 2D culturas mais ou menos dependentes aqueles cedo padronização compostos. Os protocolos mais reduzidos (por exemplo, não RA, BDNF, SAG) são igualmente plausíveis linhas para maiores investigações. Finalmente, estudos futuros podem se beneficiar de novas ferramentas de pesquisa para melhor caracterizar (e avaliar a eficiência de geração de) humanos específicos Cerebelares neuronais subtipos.

Com as determinado ressalvas em mente, ambos relataram protocolos podem ser utilizados para diferenciações Cerebelares, com produtos adequados para diferentes propósitos. Eles podem servir como pontos de partida práticos para pesquisadores realizando estudos-piloto, testes de viabilidade da linha celular para tais diferenciações, ou como um modelo básico para outros tipos de diferenciação neural alvo.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós estamos gratos ao Gerbren Jacobs e Jurjen Broeke para sua assistência técnica especializada, a Prisca Leferink por contribuir para a geração e caracterização de duas linhas de iPSC de controle e a Lisa Gasparotto por demonstrar os nossos procedimentos.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM/F12+GlutamaxGibco31331-028fortificado com glutamina DMEM/F12
Meio neurobasalGibco21103-049meio básico neural
suplemento N2Gibco17502-048
suplemento B27Gibco17504001
InsulinaImgenPT468-B
L-glutaminaGibco25030-024
Aminoácidos não essenciais (NEAA)Gibco11140-035
beta-mercaptoetanolGibco21985-023
Poli-L-OrnitinaSigmaP3655
Poli (2-hidroxietil metacrilato)SigmaP3932também conhecido como Poli-Hema
LamininaSigmaL2020
E8 meio e suplementoGibcoA1517001hPSC meio e suplemento
Penicilina/EstreptomicinaGibco15140-122
Cloreto de SódioSigmaS-5886
y-27632 (inibidor de ROCK)SelleckChemS1049-10mg
DMSOSigmaD-2650
GeltrexGibcoA1413302Revestimento aderente apropriado para hPSC (PAAC)
0,5M EDTAGibco15575-020
Filtro de 0,2 umVWR28145-77
Tubo Eppendorf de 1,5 mLVWR525-0130
DMEM/F12Gibco21331-020
EtanolVWR83804360
ParafilmSigmaPM996envoltório para placas de cultura
criotubosThermoFisher368632
TrypLEGibco12563-029agente de dissociação à base de tripsina
Inibidor de tripsina definido (DTI)GibcoR-007-100
FGF-2Peprotech100-18B
FGF-4R& D Systems100-31
FGF-8BPeprotech100-25
Ácido RetinóicoSigmaR2625
Fator Neurotrófico Derivado do CérebroPeprotech450-02
Fator Neurotrófico Derivado da GliaPeprotech450-10
Cloreto de PotássioSigmaP5405
Neurotrófico Fator 3Peprotech450-03
Agonista Suavizado (SAG)Cayman11914CAS 912545-86-9
Microscópio Axiovert 40CMicroscópio de imagem de campo claroZeiss
AxiocamZeissImagem de campo claro - aquisição de imagem
Centrífuga Eppendorf 5810Eppendorf521-0996centrífuga para cultura de células
de 5Braun Medical3623140
Pipetas serológicas de 10VWR612-4950
Pipetas serológicas de 10 mlVWR612-4951
Placas de cultura de 6 poçosVWR734-2323
Placas de cultura de 12 poçosVWR734-2324
hESCsWiCELLlinha H01
Pipetas serológicas ml da ml

References

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