Artigo de método

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

15.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/56911

⸱

7 de fevereiro de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Program, University of Miami School of Medicine, 2Department of Biology, University of Miami

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o uso de geneticamente codificado Ca2 + repórteres para alterações de registro da atividade neural em se comportando vermes Caenorhabditis elegans .

Resumo

Tornou-se cada vez mais claro que atividade de circuito neural em se comportando animais difere substancialmente que visto em animais anestesiados ou imobilizados. Altamente sensíveis, geneticamente codificados repórteres fluorescentes de Ca2 + revolucionaram a gravação da célula e a atividade sináptica usando abordagens ópticas não-invasiva em comportamento de animais. Quando combinado com genética e optogenetic técnicas, os mecanismos moleculares que modulam a atividade celular e do circuito durante o comportamento de diferente Estados-Membros pode ser identificados.

Aqui descrevemos os métodos para a ratiometric Ca2 + imagem latente de neurônios único em livremente se comportando vermes Caenorhabditis elegans . Podemos demonstrar uma técnica de montagem simples que gentilmente vermes de sobreposições, crescendo em um ágar padrão de nematódeo crescimento Media (NGM) bloqueiam com uma lamela de vidro, permitindo animais para ser gravado em alta resolução durante o movimento irrestrito e comportamento. Com essa técnica, nós usamos sensível Ca2 + repórter GCaMP5 para gravar as alterações no intracelular Ca2 + nos neurônios específico serotoninérgico hermafrodita (HSNs) como eles conduzem o comportamento de oviposição. Expressando co mCherry, uma Ca2 +-proteína fluorescente insensível, podemos rastrear a posição da HSN dentro ~ 1 µm e correto para flutuações na fluorescência causadas por mudanças no foco ou movimento. Imagem de infravermelho, simultânea brightfield permite gravação de comportamento e rastreamento de animais usando um palco motorizado. Integrando essas técnicas microscópicas e fluxos de dados, podemos gravar a atividade de Ca2 + no circuito de postura de c. elegans como progride entre Estados de comportamento ativo e inativo por dezenas de minutos.

Introdução

Um objetivo central da neurociência é compreender como os neurônios se comunicam em circuitos de comportamento animal unidade. Circuitos neurais integram uma gama de diversas pistas sensoriais a fim de mudar atividade do circuito, assim conduzir mudanças comportamentais necessárias para os animais respondem a seus ambientes. O nemátodo do Pinheiro, c. elegans, tem um sistema nervoso simples com 302 neurônios cujas conexões sinápticas têm sido completamente mapeado1. Além disso, os genes que codificam para proteínas envolvidas na neurotransmissão são altamente conservados entre c. elegans e mamíferos2. Apesar da simplicidade anatômica de seu sistema nervoso, ele exibe um repertório complexo de comportamentos conservados, fornecendo uma plataforma fértil para compreender como os neurônios regulam o comportamento3.

C. elegans é passível da aplicação de uma vasta gama de abordagens como a manipulação genética, célula ablação a laser, técnicas eletrofisiológicas, bem como na vivo óptico de imagem de4,5. Estudos recentes produziram mapas detalhados do neurotransmissor importante sinalização sistemas em c. elegans , incluindo o colinérgicos e redes neuronais gabaérgica. Estes estudos, juntamente com estudos em andamento para mapear a expressão dos receptores de proteína G-acoplado todos neuronais Coloque este modelo em uma posição única para alavancar estrutural altamente detalhada e mapas de conectividade neuronal funcional para entender completamente como esses sinal de neurotransmissores diferentes através de receptores diferentes e escalas de tempo diferentes aspectos de unidade de comportamento animal.

A fim de estudar os padrões de actividade neuronal dinâmico em qualquer sistema, um pré-requisito essencial é desenvolver metodologias robustas para registrar a atividade nos neurônios individuais ou circuitos inteiras durante comportamentos. Especialmente importante é a acessibilidade de tais abordagens óticas para visualizar a atividade pré-sináptica que impulsiona a fusão de vesículas sinápticas. Rápido e altamente sensíveis repórteres fluorescentes de intracelular Ca2 +, juntamente com a disponibilidade crescente de fotodetectores sensível, revolucionaram a gravação da célula e a atividade sináptica em animais acordados, vivas durante o comportamento. Porque um resultado importante da atividade elétrica sináptica é regular os canais de Ca2 + , mudanças no intracelular Ca2 + são pensadas para fielmente comportamentalmente relevantes alterações no relatório na atividade das células.

Neste estudo, apresentamos uma abordagem para executar ratiometric Ca2 + imagem do HSN motor neurônios serotoninérgicos que promovem o comportamento de oviposição em c. elegans6,7. Esta abordagem baseia-se esforços anteriores para visualizar o Ca2 + atividade em c. elegans e o circuito de postura durante comportamento5,8,9,10,11 . O método permite simultaneamente correlacionar as mudanças observadas na atividade celular/circuito com eventos de postura, bem como alterações no estado de locomoção animal. Embora nós usamos esta abordagem para estudar a atividade em vermes adultos, trabalho não publicado de nosso laboratório mostra que essa abordagem pode ser estendida para animais juvenis na quarta larval (L4) fase também. É provável que a atividade de outros neurônios de c. elegans que funcionam em circuitos distintos e comportamentos deve ser da mesma forma acessível com esta técnica. Outros recentemente desenvolvido rápido Ca2 + indicadores com disjunto espectros de emissão12,13,14,15,16, ferramentas optogenetic17 e geneticamente codificado ópticas indicadores de membrana de tensão18, deverá permitir-nos realizar penetrantes 'all-optical' investigações como alterações na atividade de circuito neural dirige Estados de comportamento distinto.

Protocolo

1. cepas, cultura, mídia e montagem de animais

  1. C. elegans worms a 20 ° C em padrão-60mm nematódeo crescimento médio (NGM) placas de ágar inoculadas com OP50 Escherichia coli alimentar bacteriana19de crescer.
  2. Prepare dois plasmídeos para cada promotor celular específico de interesse: um, dirigindo a expressão de GCaMP5 de registro intracelular Ca2 +e no segundo, dirigindo a expressão de mCherry para permitir a quantificação de ratiometric de GCaMP5 mudanças de fluorescência e simplifica a medição e a descoberta do objeto.
    Nota: GCaMP5:mCherry ratiometric imagem corrige para flutuações na fluorescência GCaMP5 que resultam em mudanças no movimento de foco e animal, não reais mudanças no intracelular Ca2 +.
  3. Injetar GCaMP5 - e mCherry-expressando plasmídeos juntamente com o plasmídeo de marcador de resgate visível pL15EK as gônadas de LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X animais mutantes e recuperar não-vum lin-15(+) animais expressando GCaMP5 e mCherry de um transgene alta-cópia20,21,22. Use o fundo mutante lite-1 para reduzir o comportamento de evitação de luz azul23,24.
  4. Integre os transgenes de cromossomos para reduzir mosaicismo e simplificar a geração de cepas mutantes composto25.
    Nota: A tensão de LX2004 descrita aqui carrega um transgene integrado de alta-cópia que expressa a GCaMP5 e mCherry nos HSNs do promotor de PNL-3 (ver Tabela de materiais)26,27, 28 , 29. o promotor de PNL-3 foi encontrado a expressão forte de carro nos HSNs de tarde L4 e animais adultos sem causar defeitos significativos no desenvolvimento de HSN ou comportamento de oviposição em comparação com outros promotores testado (e.g.,tph-1, EGL-6e unc-86). Esta estirpe e outros que expressam a GCaMP5 e mCherry no cabo ventral (VC) neurônios, músculos vulvares e células neuroendócrinas uv1 estão disponíveis a partir do centro de genética Caenorhabditis e detalhes de sua construção foram descritas 27.
  5. Aplicar OP50 escolher alimentar bacteriana de uma placa de ágar NGM semeada no fundo de um verme de platina e usá-lo para transferir ~ 20 animais L4 LX2004 tarde que expressam a GCaMP5 e mCherry nos HSNs do promotor de PNL-3 . Certifique-se que a vulva em desenvolvimento aparece em um estereomicroscópio como uma mancha clara escura rodeada por uma lua crescente branca. Incube os animais a 20 ° C por 24-40 h.
  6. Após a incubação, aplicar OP50 para a escolha e transferência ~ 3 dos vermes para uma placa NGM não-semeada, deixando uma pequena quantidade de comida por trás para os vermes que alimentam-se durante a imagem latente. Certifique-se de alimentos suficientes, como também pouca comida bacteriana incentivará os vermes a vaguear longe do centro da placa, enquanto muita comida aumentará a fluorescência de fundo e causar hipóxia.
  7. Use uma espátula plana arredondada para cortar um ~ 20 mm x 20 mm bolão da placa carregando os vermes e transferir o bloco para baixo para o centro de uma lamela limpa 24 x 60 mm #1.5 (Figura 1). Inicie a aplicação de um lado para evitar bolhas sendo presa sob a lamela e interferentes com imagem latente. Uma lamela 22 x 22 mm #1 para o topo do parte para reduzir a degola e evaporação.

2. hardware e instalação de instrumentação

  1. Coloque o encenado, vermes transgênicos para o palco de um microscópio invertido com um ≥ 0,7 numérica abertura plano-Apochromat 20 x estágio objetivo, motorizado de XY controlável com um joystick, um divisor de imagem e fluorescência filtros para GCaMP5 simultânea e mCherry de excitação e emissão, câmeras de infravermelho e fluorescência brightfield de imagem e um sistema de iluminação triggerable do diodo emissor de luz (LED)(Figura 2).
    Nota: Um divisor de feixe de 80/20 envia 80% do sinal de imagem da câmera de fluorescência e 20% para a câmara de brightfield. Um microscópio vertical também pode ser usado, mas o pedaço NGM deve ser colocado entre uma lâmina de vidro e a lamela grande neste caso.
    1. Use as oculares binoculares para selecionar um verme para a imagem latente. Quando um animal é selecionado, deslize o filtro infravermelho no lugar acima do condensador.
  2. Lógica do transistor-transistor (TTL) desencadeia
    1. Conecte cabos coaxiais de cada uma as três linhas de saída do TTL gatilho da câmera de fluorescência. Conecte a primeira saída à entrada BNC #3 do sistema de iluminação LED.
    2. Conecte a saída segunda a um adaptador de BNC 'banana' com verde e marrons fios do conector 8 pinos GPIO GPIO correndo entrada #3 (pino 4) e terra (pino 5) da câmera infravermelha, respectivamente.
    3. Conecte a saída de terceira para um adaptador de 'banana' BNC com fios de jumper, correndo para a entrada digital #8 e terra no dispositivo de aquisição digital (Figura 2B).
  3. Dispositivo de aquisição digital (DAQ)
    1. Conecte a placa do microcontrolador DAQ (ver Tabela de materiais) para o PC através de um cabo USB. Atualize o firmware com o padrão Firmata protocolo (consulte Tabela de materiais) e configurar a porta USB para se comunicar em baud 57600.
  4. Diodos emissores de luz
    1. Executar o software de controlador de LED (veja a Tabela de materiais). Alterne para o modo de gatilho de 'Continuous' para 'Gated' e selecione canal gatilho 3' para ambos os LEDs 470 e 590 nm.
    2. Ligue e digite LED de potência de cada LED (por exemplo, conjunto a 470 nm LED para 20% e a 590 nm LED 40%).
  5. Execute o script 'XY-fase-final' em Bonsai (ver Tabela de materiais) de comunicação serial-palco30. Clique no nó cinzento 'CsvWriter' e selecione uma pasta para salvar o gravado X e Y palco informações (Figura 3). Pressione a seta verde da barra de ferramentas para inicializar o DAQ.
    Nota: O script começa a gravação a posição X e Y do palco, quando a câmara de fluorescência envia um sinal TTL. Este script produz quatro colunas de dados: frame número, X posição (µm), posição Y (µm) e o intervalo entre quadros (s).
  6. A câmera infravermelha, software de gravação (ver Tabela de materiais) em 'Modos de vídeo personalizado', selecione "Modo 1" (binning 2x2; 1.024 x 1.024 pixels), e "Pixel formato Raw 8". Sob ' gatilho / Strobe', defina a linha de entrada de gatilho (GPIO) "3", a polaridade de "Alta", o 'modo' para "14". Alternar 'Habilitar' parar aquisição de quadro até um sinal de gatilho TTL é recebido.
    1. Deixando a janela aberta, clique no botão "Record" vermelho na barra de ferramentas modo de exibição de câmera principal. Selecione a pasta para sequências de imagem ser salvo. Selecione o modo de gravação de 'Tampão' e 'Imagens' de salvar em formato JPEG. Clique em "Iniciar gravação" para inicializar a aquisição.
  7. Câmera e imagem divisor de fluorescência
    Nota: Os canais de fluorescência GCaMP5 e mCherry devem ser recolhidos simultaneamente para garantir o registro de imagem apropriada para quantificação de ratiometric. Um divisor de imagem permite a aquisição de dois canais de fluorescência GCaMP5 e mCherry em um sensor.
    1. Na aba 'Captura' do software de aquisição de imagem tempo de exposição definido (ver Tabela de materiais), a 10 ms, binning 4x, e profundidade de imagem de 16 bits. Selecione um subarray câmera centrada de 512 pixels de largura por 256 pixels de altura. Clique em 'Mostrar opções de gatilho de saída' e definir todos os gatilhos para 'Positivo'.
      Nota: O DAQ ocasionalmente pode perder TTL disparadores se eles são 10 ms ou menos.
    2. Certifique-se de que 'Gatilho 1' e 'Gatilho 2' estão definido como 'Exposição' enquanto 'Gatilho 3' é definida como 'Programável' com um 'período' de 25 MS. sob a aba 'Sequência', selecione 'Time Lapse' com um 'campo Delay1' de 50 ms para coletar imagens em 20 Hz. Select 'Salve Buffer temporário.'
  8. PGTO ganhar e intensidade de laser durante a imagem latente confocal canal três
    1. Defina o ganho de PGTO para a fluorescência de fundo está em um nível acima do mínimo (nível de preto). Aumente a potência de laser (verde) de nm 561 até um único saturado em 12 bits ou 16 bits de pixel é observado no terminal pré-sináptica no canal mCherry.
    2. Ajuste a intensidade de laser (azul) 488 nm para que GCaMP5 fluorescência é apenas visível no terminal pré-sináptica acima do fundo. Essa configuração baixa impede a saturação dos pixels GCaMP5 quando a fluorescência aumenta em resposta a transientes de Ca2 + fortes. Abra o pinhole confocal todo o caminho para maximizar a captura de luz.

3. Ratiometric Ca2 + imagens e gravação de comportamento

  1. Na guia 'Sequência' do software de aquisição de fluorescência, clique em "Start" para começar a gravação. Rastrear o verme com o joystick, mantendo a célula (s) e sinapses de interesse em foco e no centro do campo de visão (FOV). Clique no botão 'Stats' na janela de histograma para mostrar estatísticas de pixel de cada canal.
  2. Ajuste a potência do LED para garantir uma fluorescência máxima mCherry de single-pixel no terminal pré-sináptica de ≥ 8.000 contagens (~ 4.000 photoelectrons), dando um ~ 12 bits intervalo dinâmico acima de fundo (~ 100 photoelectrons). Sinais de GCaMP5 no terminal pré-sináptica durante o descanso (baixo) Ca2 + deve ser em torno de ~ 2.500 conta - apenas visível acima do fundo.
  3. Gravar até atingir uma postura estado ativo; Geralmente, isso ocorre a cada 20-30 min em um verme selvagem-tipo7. Salve um subconjunto de 10 min (12.001 frames), 6.000 quadros antes e após o primeiro evento de postura (quadro 6.001). Certifique-se de manter o mesmo subconjunto de brightfield imagens de worm comportamento e momentos de posição XY, ou a perfeita sincronização de fluxos de dados serão perdida.
  4. Usar o ImageJ e o plugin BioFormats (consulte a Tabela de materiais) para converter sequências de imagem para o formato de imagem padrão Cytometry (ICS) assim pode ser importado para o software de quantificação de Ratiometric.

4. segmentação e análise quantitativa de imagem

  1. Importar sequências de imagem para o software de quantificação de Ratiometric (ver Tabela de materiais). Clique em 'Auto contraste' no menu 'Ferramentas' e ajuste o contraste de cada canal para estabelecer adequado preto (~ 1.800) e branco níveis (10.000). Selecione 'Alterar cores...' no menu ' ferramentas ' para confirmar que mCherry e atribuições de cor GCaMP5 canal estão corretas (Figura 4A - C).
    1. Clique com o botão direito sobre a série de tempo na aba 'Sequência' e configurá-lo para 20 frames/s e 1,25 µm/pixel.
  2. Selecione 'Ratio' no menu 'Ferramentas' e selecione "GCaMP5" para 'Canal' e "mCherry" para 'Canal B'. Clique em "Calcular" ao lado de 'Limite' para subtrair o fundo de cada sequência de imagens. Selecione "Aplicar um arco-íris LUT para o canal de relação".
    Nota: Para uma gravação com uma relação de base média de 0,3 (baixa Ca2 +) e uma proporção máxima de 2-3 (alta Ca2 +), uma tabela de pesquisa adequado seria de 0 (azul) 1 (vermelho).
  3. Gere um canal de intensidade modulada proporção usando o canal de mCherry (Figura 4-D). O canal de intensidade modulada Ratio é uma imagem de milhões-de-cores onde a cor da relação é mapeada para o brilho do canal mCherry.
  4. Na guia 'Medidas', crie um protocolo de pesquisa de objeto, arrastando a ferramenta 'Encontrar objetos usando intensidade' no painel 'Protocolo'. Clique a 'engrenagem' para definir a janela de mCherry valores de intensidade e encontrar objetos.
    1. Selecione a intensidade valores ≥ 2 desvios padrão (SD) acima do plano de fundo (por exemplo, o limite inferior de ~ 2.500, limite máximo de 65.535). Verifique se o terminus pré-sináptica é detectado e que 'atualizar automaticamente feedback' é selecionada no menu de medições.
      Nota: O software também pode identificar objetos pelo seu desvio-padrão de fundo usando um protocolo relacionado 'SD intensidade.' No entanto, se um objeto especialmente brilhante entra o FOV, drasticamente muda a intensidade média durante esses momentos, que afectam as cortes de intensidade usados para localizar o HSN. Esta variabilidade não ocorrerá se os valores de intensidade crua são usados para localizar objetos.
  5. Adicione filtros adicionais visando apenas o canal de mCherry (tamanho, intensidade de Max, etc) se necessário excluir objetos indesejáveis como cabeça, cauda e estripá-fluorescência. Selecione 'Fazer medição Item' no menu de medições e escolha "Todos os momentos."
    Nota: Isto irá executar o protocolo, escrevendo todas as medições para um arquivo de valores separados por vírgula (. csv) que deve ser exportado usando o comando 'Exportar' no menu arquivo.
  6. Abra o arquivo exported.csv e copie o Commit, área (µm2), média (relação de canal), centroide X (µm) e dados de centroide Y (µm) em uma nova folha. Exporte arquivo de a.csv sem cabeçalhos de coluna. O software de quantificação de Ratiometric pode classificar uma célula de interesse, como um ou mais objetos por commit.
    1. Para recombinar esses objetos, use um script personalizado 'AnalzyeGCaMP_2017.m'.
      Nota: O script também identifica Ca2 + (ratio) picos nos dados e salva o arquivo de a.csv de seus momentos, amplitudes de pico e largura dos picos. Ele também gera arquivos postscript para os traços de proporção de matérias-primas e anotado. Com esta informação, devem ser determinadas a amplitude de Ca2 + transitória e intervalo inter transitório.
  7. Adicione a saída de X e Y valores de centroide de cada objeto de fluorescência para os valores X e Y, gravados pelo script XY-estágio de Bonsai. Use a posição líquida de XY para gerar um rastreamento de locomoção worm e para calcular o deslocamento da célula e velocidade que acompanham o comportamento de diferentes Estados31.
  8. Importe as imagens gravadas brightfield ImageJ como uma pilha virtual. Anote eventos de postura e outros comportamentos. Compare o calendário destes eventos de Ca2 + picos do rastreamento de relação.

Resultados

A técnica de montagem simples descrita aqui (Figura 1) provoca mínimas alterações no ambiente da cultura de L4 e adulto c. elegans , permitindo alta resolução gravação em comportamento de animais através de uma lamela de vidro (Figura 4). Sincronização de fontes de luz LED, controladores de fase e exposições de câmera permite para aquisição de dados de vários fluxos a 20 frames/s para cima de 1 h. intermediário ampliação (20 x) com objectivos de abertura numérica elevada (0,7-0,8) fornece boa resolução espacial da região sináptica no circuito de comportamento de postura, mesmo com 4 x 4 pixel binning (1,25 µm/pixel). Aquisição simultânea de sinais de fluorescência GCaMP5 e mCherry (Figura 4A, B) é usada para gerar um canal de relação pixel por pixel que compensa as alterações na circulação de animais e foco (Figura 4-D). O terminus pré-sináptica HSN é tão grande como muitos corpos celulares neuronais, em c. eleganse mudanças na pré-sináptica HSN Ca2 + podem ser visualizado claramente. O FOV grande da câmera infravermelho brightfield permite que o worm ser manualmente controlados durante a gravação (Figura 4E). Para cada animal, mudanças no intracelular Ca2 + podem ser correlacionadas com comportamentos evidentes na imagem brightfield, incluindo o lançamento de ovo e as alterações na locomoção (Figura 4E).

Quantificação de HSN Ca2 + e velocidade confirma que vermes mudam sua locomoção como eles transição para comportamento de oviposição. Existem diferenças significativas na velocidade de verme antes, durante e após o estado ativo de postura (Figura 5A). Isto não é causado pelo ruído inerente para a imagem ou o sistema de rastreamento. Zoom em uma postura evento, observamos uma forte mudança na fluorescência de GCaMP5 (ΔF/F) antes do evento de poedeiras, enquanto mCherry fluorescência é relativamente inalterada (Figura 5B). Medido mudanças na proporção de GCaMP5:mCherry (ΔR/R) mostram claramente uma HSN Ca2 + transitória ~ 4 antes do s lançamento do ovo (Figura 5B). Uma clara desaceleração de locomoção worm coincidente com a contração muscular vulval, ocorre que termina com ovo libera. Resultados anteriores mostraram que os neurônios colinérgicos de motor VC, que são inervados pelos HSNs, mostrar atividade de pico durante as contrações musculares vulval forte e ovo lançamento 8,10,27. Também mostramos que a optogenetic de ativação dos neurônios VC leva uma desaceleração imediata da locomoção, sugerindo que os neurônios VC podem ser ativados pela contração muscular vulval, assim retardando a locomoção até receber feedback de lançamento de ovo27 .

A imagem latente e rastreamento sistema descrito permite a visualização da organização espacial de comportamento de oviposição (Figura 5-C). Como anteriormente indicado, vermes entram execuções sustentadas de locomoção para a frente antes de ser o estado ativo de32. Vermes gastam a maioria de seu tempo forrageando em bactérias no centro do pedaço de ágar. Antes da entrada em estado ativo, vermes mover-se longe da comida, que é coincidente com a aparência de infrequente HSN Ca2 + transientes. Atividade HSN então as transições para disparar rajada, com vários espaçadas HSN Ca2 + transientes que sustentam a postura eventos. As minhocas então muitas vezes virem, retomar a locomoção para frente e desovar o caminho de volta para sua posição inicial perto as bactérias OP50. Presumimos que podem estar influenciando mudanças no local O2 e/ou concentração de CO2 , onde os vermes se decidir colocar ovos33,34.

figure-results-1
Figura 1. C. elegans montagem técnica para geração de imagens de alta resolução da atividade de circuito de postura e comportamento. Top, a montagem final do lado. No fundo, a montagem final como se fosse visto através do fundo da lamela grande. As setas indicam OP50 alimentar bacteriana, worms de c. elegans e ovos, imprensado entre o pedaço de ágar NGM e a lamela de grande 24 x 60 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2 . Widefield ratiometric Ca2 + imagem e comportamento de gravação em um microscópio de epifluorescência invertido. (A) posição de verme e comportamento é capturado em brightfield através um 20 x (0,8 NA) plano-Apochromat objetivo usando luz infravermelha (750-790 nm) (setas roxas) emitida por uma lâmpada de halogéneo através do pedaço NGM. Um joystick e palco motorizado controlador é usado para manter o verme no campo de visão durante a gravação. Posição de fase (Δx, Δy) é enviada para o PC pela porta serial. GCaMP5 e mCherry de proteínas expressadas no worm estão animadas usando 470 nm (setas azuis) e 590 nm (setas amarelas) diodos emissores de luz (LED). Emitido GCaMP5 (verde setas) e mCherry (setas laranja) fluorescência juntamente com a luz infravermelha passa através de um espelho dicroico multi-banda (ver Tabela de materiais). Um divisor de feixe de 80/20 envia 20% da luz através de um demagnifer x 0.63 para captura em uma câmera do CMOS infravermelho-sensíveis (seta roxa). Os restantes 80% da luz é enviado através da porta do lado do microscópio para um divisor de imagem que separa o GCaMP5 e mCherry de fluorescência para separar as metades de uma câmera de sCMOS enquanto retira a luz infravermelha brightfield. Dados de ambas as câmaras são transferidos para um PC via cabos USB3. As portas do disparador da câmera sCMOS fluorescência (azul) são usadas para enviar + 5V TTL aciona o sistema de iluminação LED, a câmera CMOS infravermelho brightfield e o dispositivo de aquisição Digital (DAQ). (B) gatilho 3 saída sinais TTL são detectados pelo DAQ no pino digital #8 e enviados para o PC através de uma conexão USB. Estas entradas digitais acionar um ' onde XY' comando serial de um roteiro de software de Bonsai (XY-fase-final) onde se lê o X e Y palco posição para cada imagem de fluorescência/infravermelho GCaMP5/mCherry capturada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3 : Layout do script de comunicação serial-estágio de Bonsai XY-fase-final. O top DigitalInput nó (rosa) lê TTL disparadores entrando pin #8 do DAQ. Para cada TTL tensão positiva (verde), o DAQ faz um timestamp (azul) e grava uma sequência de 'Onde XY?' (rosa) para o controlador de fase através da porta serial (cinza). O nó de SerialStringRead (rosa) lê que o X e Y coordenam a resposta do controlador de palco. Essa sequência é então convertida em mícrons e separada em X e Y coordenadas de palco. Finalmente, esses quatro fluxos são combinados usando um nó de fecho de correr (azul) e um arquivo de quatro column.csv está escrito: uma contagem de quadro dos sinais TTL recebido (nó de gama, rosa), as coordenadas X e Y e o intervalo entre momentos subsequentes (tipicamente ~ 50 ms quando gravação a 20 Hz). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4 : Micrografias representativas de fluorescência HSN e todo animal brightfield durante o comportamento de oviposição. (–D) Imagem de ratiometric simultânea de fluorescência GCaMP5 e mCherry nos HSNs apenas antes da liberação do óvulo. Termini pré-sináptica HSN é indicadas com setas. (C) fusão de GCaMP5 e mCherry de fluorescência. (D) intensidade modulada GCaMP5:mCherry ratio; um rácio elevado (vermelho) indica alta intracelular Ca2 + no terminal pré-sináptica. (E) Brightfield imagem do verme inteira apenas depois que os ovos foram colocados. Setas indicam as metades anteriores e posteriores da vulva da qual os ovos são postos. Barra de escala para todas as imagens é 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5 : Gravação do HSN Ca2 + e locomoção velocidade durante o comportamento de oviposição. (A) vestígios de mudanças de relação GCaMP5:mCherry em resposta a intracelular Ca2 + transientes (ΔR/R; vermelho) juntamente com a velocidade instantânea do worm (µm/s; azul). Eventos de desova são indicados por setas. (B) vestígios de fluorescência GCaMP5 HSN (verde; ΔF/F), mCherry de fluorescência (vermelho; ΔF/F), relação de fluorescência GCaMP5:mCherry (preto; ΔR/R) e worm velocidade (azul) em torno do momento da liberação do óvulo. (C) organização espacial dos comportamentos de postura e locomoção durante a gravação inteira de 10 min. A faixa de worm foi obtida a partir das informações de fase XY que foi adicionadas para a posição do centroide da HSN obtido a partir da gravação de fluorescência mCherry. O timing de transientes HSN (círculos vermelhos), eventos de postura (setas pretas) e o início e fim da gravação (diamantes de verdes e azuis) são indicados. Barra de escala é 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Transgenes:

Porque mCherry expressão foi melhorada através da inserção de códon-otimização e intrão (e mais disponível GCaMP repórteres não têm), injetar ~ 4 x a quantidade de GCaMP5-expressando de shRNA para assegurar níveis comparáveis de fluorescência GCaMP5 durante forte Ca 2 + transientes. Resgate da mutação lin-15(n765ts) permite a recuperação fácil dos animais transgénicos com efeitos mínimos na postura e outros comportamentos35. Transgenes deve ser integrado para garantir condições entre diferentes animais25de imagem e expressão uniforme. Marcadores selecionáveis, incluindo a resistência aos antibióticos36,37 e resgate de armas letais sensíveis à temperatura38 também devem funcionar, mas, porque os animais não-transgênicos são mortos, confirmação da integração do transgene e homozigotia é mais difícil comparado com marcadores que apresentam um fenótipo visível de25. Marcadores dominantes que perturbam o normal locomoção e diminuem a aptidão, tais como rol-6(dm), devem ser evitada39. Imagem latente na lite-1 fundo mutante é essencial para reduzir a fuga de luz azul respostas durante a imagem23,40,41. Mutação adicional de gur-3, que atua paralelamente à lite-1, pode minimizar ainda mais comportamento residual e alterações fisiológicas causadas pela luz azul42. Convenientemente, gur-3, 1-litee lin-15 estão todos situados na metade direita do cromossomo X, que deve simplificar a construção de novas estirpes de Ca2 + imagens e experiências optogenetic.

Porque os tempos de exposição são curtos e imagens são coletadas em 20 Hz, sinais GCaMP5 e mCherry devem ser brilhantes. A explicação mais provável para barulhento Ca2 + gravações é fluorescência fraca causada pela expressão repórter fraco. Os promotores também devem ser razoavelmente específicos para a região a ser fotografada. Porque o corpo celular HSN e sinapses para os músculos vulvares são no centro do corpo, expressão adicional do promotor de PNL-3 na cabeça e cauda é tipicamente fora do campo de visão e podem ser excluído usando filtros adicionais na Software de quantificação de Ratiometric. Para garantir que observado alterações no resultado de fluorescência GCaMP5 de mudanças reais no intracelular Ca2 +, controle transgenes expressando GFP em vez de GCaMP5 devem ser preparadas de forma independente e analisados26. Mais recente Ca2 + repórteres com diferentes Ca2 + sensibilidades, cinética, cores e expandiram a escolha das ferramentas disponíveis de imagem, mas cada novo repórter deve ser validado usando o Ca2 +-variante fluorescente insensível14 ,16.

Mídia:

Placas NGM para a imagem latente devem ser preparadas com ágar de alta qualidade. Ágar de qualidade inferior não irá dissolver completamente após a autoclavagem, deixando pequenas partículas essa dispersão de luz durante a imagem latente e aumento da fluorescência, plano de fundo. Biologia molecular agarose de grau pode ser usado em vez disso, mas a quantidade adicionada deve ser reduzida para manter a firmeza de placa equivalente.

Comparações com outros métodos de montagem:

Abordagens anteriores, a atividade de imagem no circuito de comportamento de oviposição utilizaram vermes imobilizadas com cola para uma almofada de agarose. Sob estas condições, atividade de circuito e postura de comportamento não é favorecidas sem redução em meios de cultura osmolaridade8,10,44,45. Recentes sugerem que vários comportamentos de worm são modulados por estado de locomoção, levantando questões sobre a relação da atividade das células observadas em animais imobilizados ao observado em livremente, comportando-se animais. Recentemente mostramos que a atividade de circuito de postura é inesperadamente progressivamente com locomoção26,27. Da mesma forma, compartimentada Ca2 + sinalização no interneurônio RIA integra a atividade de neurônios sensoriais e neurônios cabeça durante movimentos46de forrageamento. Comportamento de defecação é também acompanhado de uma mudança de precisa e estereotipada de locomoção que permite que os animais se afastar de seu lugar de forrageio antes de expelir resíduos47. Juntos, estes resultados sugerem que a breves gravações de atividade de circuito de animais imobilizados podem ser fundamentalmente diferentes dos obtidos em livremente, comportando-se animais.

Apesar de ser directamente por baixo de uma lamela, comportamento do worm é semelhante ao visto em placas padrão de NGM. Ovos descontraídos vai continuar a eclodir, e a pequena quantidade de comida depositada permite que as larvas L1 para se transformar em adultos (dados não mostrados). O tamanho de bloco de ágar grande permite a troca gasosa razoável e resiste a desidratação, embora muita comida aumentará a fluorescência de fundo. Enquanto este método funciona melhor para adultos, a técnica também pode ser usado para animais de L4 de imagem. No entanto, a espessura da camada aquosa entre o bloco e a lamela é tal que larvas menores têm dificuldade rastejando e muitas vezes podem ficar preso na sequência de um adulto em movimento.

Uma limitação dessa técnica de montagem é que a estimulação mecânica ou química direta para regiões precisas do corpo é difícil. Desenvolvimentos recentes em técnicas de iluminação modelado permitem a excitação separada da cabeça ou cauda-expresso opsins microbianas com iluminação separada e detecção de fluorescência GCaMP/mCherry da número48,49. Como resultado, pode ser possível superar este problema usando abordagens optogenetic.

Comparações com outro Ca 2 + Abordagens de imagem:

Este método funciona muito bem para gravar alterações no citoplasmática Ca2 + do único, resolvidas as células e as suas regiões sinápticas. Imagem em tempo real, volumétrica de neurônios na cabeça foi recentemente conseguida usando a posição do núcleo de células para a identificação da célula e para dosar alterações no auxílio de cálcio50,,51,52. A relação entre nuclear e sináptica Ca2 + permanece obscura. Nossos dados sugerem que as mudanças mais visíveis no HSN intracelular Ca2 + ocorrem na termini pré-sináptica longe a soma da célula (Figura 4). A termini pré-sináptica do HSN e os neurônios VC é incorporados os músculos vulvares pós-sináptica26. Não está claro se haveria resolução suficiente na dimensão Z mesmo com girando o disco ou técnicas de folha de luz de atribuem pré-sináptica Ca2 + sinais de células específicas, sem depender de alguma forma somático cálcio para identificação de célula . Usando as técnicas descritas aqui, cada 10 min, dois canais de gravação com 12.001 256x256 pixel 16-bit TIFF imagens é ~ 4 GB. Relação proporção e intensidade modulada canais o dobro do tamanho do arquivo para ~ 8 GB. Um experimento típico de gravação 10 animais de cada um dos dois genótipos (tipo selvagem e experimentais) gera cerca de 150 GB de dados primários e requer 20 h para coletar e analisar. Análises volumétrica com 10 fatias de Z por commit exigiria uma ordem de magnitude mais dados e tempo analítico, explicando por que tão poucos tais estudos foram concluídos.

Ferragem:

Podemos gravar e analisar sequências de imagem com alto desempenho, estações de trabalho dual processador placas de vídeo (por exemplo, jogos), 64 GB de RAM, e drives de estado sólido de alta performance (ver Tabela de materiais). Dados devem ser armazenados na rede matriz redundante de discos independentes (RAID) e backup para a nuvem em um centro de dados off-site.

Recomendamos que usando de alta potência colimado LEDs para a excitação da fluorescência pulsado sobre iodetos metálicos ou fontes de luz à base de mercúrio. Vários sistemas de LED multi cores disponíveis comercialmente estão disponíveis. Enquanto alguns desses sistemas de LED têm um custo inicial mais alto, eles têm uma longa vida (> 20.000 h), podem simultaneamente excitar quatro ou mais diferentes fluorophores e oferecem controle temporal preciso, usando um serial e/ou interface TTL com baixa latência (10-300 µs alternar tempo). Desencadeando garante que a amostra só acende quando na verdade estão sendo recolhidos. Normalmente usamos uma exposição de 10 ms cada 50 ms (20% taxa de serviço). Isso reduz a fototoxicidade e borrão de movimento durante a captura de imagem, como relatado anteriormente,43.

Utilizamos câmeras de sCMOS pela sua velocidade e grande matriz de pixels pequenos, sensíveis. Uma câmera do CCD-EM é uma alternativa mais cara, mas efeitos de 'flor' podem resultar em capturados photoelectrons derramando em pixels adjacentes. Nova sCMOS back-iluminado câmeras têm fotossensibilidade semelhante da EM-CCDs a custo significativamente reduzido. De qualquer maneira que sensor é usado, os canais GCaMP5 e mCherry devem ser obtidos simultaneamente. Captura sequencial em mover vermes vai levar a Mal registradas imagens impróprias para quantificação de ratiometric. Imagem de canal duplo pode ser realizada em uma única câmera após a divisão de canais usando um divisor de imagem (Figura 2) ou usando duas câmeras idênticas. Sobre imagens de 8 bits para quantificação exacta ratiometric, recomenda-se a gama dinâmica das imagens de 16 bits. Para imagens de brightfield do comportamento de worm, capturamos usando uma câmera de 1 pol. 4.1 MP infravermelho USB3 para capturar grandes sequências de imagem de 8 bits 1.024 x 1.024 binned de 2 x 2 após a compressão JPEG. O FOV maior disponível em modelos mais novos do microscópio permite um verme adulto ser visualizado em 20 x depois x 0.63 demagnification com apenas leve vinheta (Figura 4E).

Recomendamos usar os sinais de tensão padrão TTL para sincronizar a iluminação e a captura de quadro. Por latências potenciais em diferentes softwares, recomendamos aos usuários configurar a câmara de fluorescência com saídas de gatilho como mestre com saídas TTL, deixando todos os outros dispositivos. Desta forma, informações de posição brightfield e fase serão coletadas para cada medição de Ca2 + .

Fenda - ou ressonantes microscópios confocal ponto-digitalização, tipicamente encontrados em instalações confocal compartilhadas também dar excelente desempenho durante a ratiometric Ca2 + imagem latente. Tais instrumentos podem ser usados para capturar dois ou mais canais de fluorescência juntamente com brightfield24. Neste caso, o pinhole confocal deve ser aberto para seu diâmetro máximo, e um detector espectral deve ser usado para separar os sinais infravermelhos brightfield, mCherry e GCaMP5. Isso maximiza a luz coleção de uma espessa (~ 20 µm) fatia ao ainda permitir a rejeição da fluorescência fora de foco. Uma desvantagem é o FOV menor e mais restrições para personalização de hardware e software.

Software:

A maioria dos fabricantes do navio e instalar suas câmeras e microscópios com software proprietário, incluindo configuração de desencadeamento de entradas e saídas. Podem variar os recursos e desempenho deste software durante a gravação. Porque, movendo-se rápido vermes pode ser um desafio para rastrear, imagem exibir durante a gravação deve ser suave e estável a 20 Hz. Para melhorar o desempenho, sequências de imagem podem ser temporariamente salva na memória RAM com subconjuntos comportamentalmente relevantes, salvos no final do experimento. Esses arquivos de sequência de dois canais de imagem podem ser convertidos para o formato de imagem Cytometry padrão aberto (ICS) para importar para o software de quantificação de Ratiometric. OME-TIFF é um formato de imagem aberto mais recente, embora diferentes instalações podem ser incapazes de salvar sequências de imagem TIFF maior que 4 GB.

Uma característica fundamental do pipeline de quantificação é a geração do canal de relação e, em seguida, um procedimento de segmentação de imagem imparcial usando mCherry fluorescência para encontrar células de interesse. De cada objeto encontrado, o tamanho do objeto, posição do centroide XY e o mínimo, quer dizer, e calculam-se valores de intensidade de fluorescência máxima para cada canal (incluindo o canal de relação). Juntos, esses valores são usados para dosar alterações intracelulares Ca2 + em cada commit na gravação. Medições de objeto para cada commit são então exportadas como arquivo a.csv para análises subsequentes.

Uma limitação importante do protocolo descrito aqui é a dependência de mover os dados em diferentes formas, através de uma colcha de retalhos de produtos de software. Uma irritação adicional é que algum do software aberto e livre, enquanto os outros estão fechados, caro e desigualmente atualizado. Uma melhoria principal seria usar ou desenvolver uma parte de software (idealmente aberto) que fornece níveis semelhantes de desempenho e facilidade de uso de aquisição para análise. Conforme observado acima, análise ratiometric dobra o tamanho do arquivo e o tempo necessário para realizar um experimento. Geração de condutores de câmera que podem ser integrados em estruturas personalizável pelo usuário como Bonsai permitiria imagens e outros fluxos de dados sejam coletados e analisados em tempo real, melhora significativamente a taxa de transferência.

Perspectivas futuras:

Enquanto nós normalmente rastrear movimentos de worm manualmente, rastreamento de centroide worm detectado em gravações de infravermelho brilhante - ou campo escuro deve permitir para nós que fornecem loop fechado de ajuste da posição de palco e automatizados de processamento de imagem adicional rastreamento (Figura 3 e dados não mostrados). A maioria das gravações de fluorescência obtidos com este método é escuro e desprovida de biologicamente interessantes dados. No sensor ou em tempo real pós-aquisição processamento de imagem técnicas que sequências de imagem para objetos relevantes de culturas permitiria para aumento de resolução espacial e agilizar o pipeline de análise de dados, particularmente se Z-fatias adicionais são coletadas para cada Commit para visualizar a atividade dentro de todas as células pré e pós-sinápticas no circuito.

Divulgações

Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por uma concessão do NINDS para KMC (R01 NS086932). LMN foi apoiado por uma bolsa do programa de NIGMS IMSD (R25 GM076419). Estirpes utilizadas neste estudo c. elegans centro de genética, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Agradecemos a James Baker e Mason Klein para debates úteis.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
C. elegans crescimento, cultivo e montagem
Escherichia coli cepa bacteriana, OP50Centro Genético de CaenorhabditisOP50Alimento para C. elegans. Uracila auxotrófica. E. coli B. Nível de Biossegurança
1 HSN GCaMP5+mCherry cepa de vermeCaenorhabditis Genetic CenterLX2004Transgene integrado usando promotor nlp-3 para conduzir a expressão de GCaMP5 e mCherry em HSN.  Genótipo completo:  vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) cepa mutante para preparação de transgeneautorLX1832Cepa para recuperação de transgenes de alta cópia após microinjeção com pL15EK lin-15(n765ts) plasmídeo de resgate. Também possui a mutação ligada lite-1(ce314) que reduz a sensibilidade à luz azul. Disponível no autor mediante solicitação
pL15EK lin-15a/b plasmídeo de resgate genômicoautorpL15EKPlasmídeo de resgate para recuperação de animais transgênicos após injeção em LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X cepa. Disponível do autor por solicitação
plasmídeo pKMC299autorplasmídeo pKMC299Plasmídeo para expressão de mCherry nas HSNs do promotor nlp-3. Has nlp-3 3' região não traduzida
autor do plasmídeo pKMC300pKMC300para expressão de GCaMP5 nas HSNs do promotor nlp-3. Possui nlp-3 3' região não traduzida
Fosfato de Potássio MonobásicoSigmaP8281Para preparação de placas NGM
Fosfato de Potássio DibásicoSigmaP5655Para preparação de placas NGM
Sulfato de Magnésio HeptahidratadoAmresco0662Para preparação de placas NGM
Cloreto de Cálcio DihidratadoAlfa Aesar12312Para a preparação de placas NGM
PeptoneBecton Dickinson211820Para a preparação de placas NGM
Cloreto de SódioAmresco0241Para a preparação de placas NGM
ColesterolAlfa AesarA11470Para a preparação de placas NGM
Agar, Bacteriological Type A, UltrapureAffymetrix10906Para a preparação de placas NGM
Placas de Petri de 60 mmVWR25384-164 Para preparação de placas NGM
24 x 60 mm micro vidro de cobertura, #1.5VWR48393-251Vidro de cobertura através do qual os vermes são fotografados
22 x 22 mm micro vidros de cobertura, #1VWR48366-067Vidro de cobertura que cobre a parte superior do pedaço de ágar
Estereomicroscópio com base de luz transmitidaLeicaM50Microscópio de dissecação para manutenção, preparação e montagem de tensão de vermes
Fio de irídio de platina, (80:20), 0,2 mmALFA AESARAA39526-BWPara transferência de sem-fim
Microscópio de imagem de cálcio
Mesa de ar antivibraçãoTMC63-544Micro-g' Mesa de laboratório 30" x 48" mesa antivibração com 4" CleanTop M6 em 25mm superior
Microscópio composto invertidoZeiss431007-9902-000Axio Observer.Z1 invertido microscópio
Sideport L80/R100 (3 posições)Zeiss425165-0000-000Para desviar 20% da saída para a câmera de campo claro (CMOS), 80% para a câmera de fluorescência (sCMOS)
Suporte de iluminação inclinado para trásZeiss423920-0000-000Para infravermelho/imagem de comportamento
Caixa de lâmpada 12V/100W c/ ColetorZeiss423000-9901-000Para infravermelho/imagem de comportamento
Lâmpada de halogéneo 12V/ 100WZeiss380059-1660-000Para imagens infravermelhas/comportamentais. Os LEDs de luz branca não emitem luz infravermelha significativa, portanto, não permitem imagens de campo claro após o filtro passa-banda infravermelho
32 mm Filtro passa-banda infravermelho (750-790 nm) para lâmpada halógenaZeiss447958-9000-000BP 750-790; DMR 32mm, para iluminação infravermelha para campo claro e comportamento
do condensador de 6 filtros (LD 0,55 H/DIC/Ph), Zeiss motorizado424244-0000-000Para infravermelho/imagem de comportamento
Condensador & ObturadorZeiss423921-0000-000Para imagem infravermelha/comportamental
Ocular binocular com fototubo para câmera CMOS infravermelhaZeiss425536-0000-000Para imagem infravermelha/comportamental
Ocular 10x, 23mmZeiss444036-9000-000Para localização de vermes no pedaço de ágar
Adaptador C-Mount 2/3" 0.63x demagnificadorZeiss426113-0000-000Montagem para câmera CMOS infravermelha
Câmera CMOS para campo claro infravermelho e comportamento (sensor de 1")FLIR (anteriormente Point Grey Research)GS3-U3-41C6NIR-CCâmera para imagem de campo claro
USB 3.0 Host Controller CardFLIR (anteriormente Point Grey Research)ACC-01-1202Fresco FL1100, 4 Portas
8 pinos, Cabo GPIO de 1m, Conector Circular Hirose HR25 FLIR (anteriormente Point Grey Research)ACC-01-3000para acionamento TTL. O fio verde se conecta ao GPIO3 / Pin 4 e o fio marrom se conecta ao Terra / Pin 5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27Zeiss420650-9901-000Melhor combinação de ampliação, abertura numérica e distância de trabalho
Torre Refletora de 6 cubos, MotorizadaZeiss424947-0000-000Para imagens de fluorescência
Trem de Luz de Fluorescência, Zeiss Motorizado423607-0000-000Para imagens de fluorescência
Obturador de fluorescênciaZeiss423625-0000-000Para imagens de fluorescência
GFP e mCherry cubo de filtro de excitação dupla e emissão (para microscópio)Zeiss489062-9901-000FL Conjunto de filtros 62 HE BFP+GFP+HcRed para imagem de fluorescência
Sistema de iluminação LEDZeiss423052-9501-000Sistema LED Colibri.2 acionável para iluminação fluorescente
Módulo LED GFP (470 nm)Zeiss423052-9052-000Colibri.2 LED para excitação de fluorescência GFP
mMódulo LED Cherry (590 nm)Zeiss423052-9082-000LED Colibri.2 para excitação de fluorescência mCherry
Controle deslizante de parada de íris para equipamento de luz incidenteZeiss000000-1062-360Abertura de campo íris para limitar a iluminação LED ao campo de visão
da câmeraAdaptador C-Mount 1" 1.0xZeiss426114-0000-000Adaptador para divisor de imagem e câmera de fluorescência sCMOS
Divisor de imagemHamamatsuA12801-01Gemini W-View, outros divisores de imagem podem ser usados, mas podem não ser otimizados para o grande tamanho do sensor das câmeras sCMOS
Espelho dicróico GFP / mCherry (divisor de imagem)SemrockDi02-R594-25x36Dividindo GCaMP5 de mCherry e infravermelho sinais
Filtro de emissão GFP (divisor de imagem)SemrockFF01-525/30-25Capturando fluorescência GCaMP5
mCherry/filtro de emissão (divisor de imagem)SemrockFF01-647/57-25Este filtro é necessário para excluir a luz infravermelha usada para imagem de campo claro
câmera sCMOS para sensor de fluorescência (1")HamamatsuA12802-01 / C11440-22CUOrca FLASH 4.0 V2. Os modelos mais recentes permitem configurações separadas de aquisição de imagem em metades separadas do sensor, permitindo a aquisição de imagens de dois canais em combinação com um divisor de imagem
Motorizado XY StageMä rzhä usuárioSCAN IM 130 x 100Movimento de palco; a resolução XY deste estágio é 0.2µ m por passo 
Controlador de palco XY com joystickLUDLMAC6000, joystick XYRastreamento manual de vermes. MAC6000 controlador deve ser conectado ao PC através da porta serial (RS-232) configurada para 115200 baud
Placa de aquisição digital (DAQ)ArduinoUnoRecebendo gatilhos TTL da câmera sCMOS. O Uno deve ser carregado com o pacote padrão Firmata, e a porta USB do computador configurada para 57600 baud
BNC Macho para Cabo BNC Macho - 6 pésHOBB6da Hosa Technologyacionamento TTL
coaxial BNC macho banhado a ouro para SMA macho (8.8")uxcell608641773651Para conectar as saídas de disparo da câmera de fluorescência
Adaptador de cabeça giratória BNCHantekRRBNCTH21Adaptador BNC para Banana Plug (4mm)
Conector BNC fêmea para fêmeaDiageng20130530009Fêmea para fêmea Adaptador BNC para conectar a saída BNC da câmera ao Banana Plug
Fios jumper de placa de ensaio flexíveis sem soldaZ& TGK1212827Para conectar as saídas de disparo BNC ao Arduiono DAQ.  De homem para homem.
Estação de trabalho de alto desempenhoHPZ820Windows 7, 64GB RAM, processador Dual Xeon, unidade C: de estado sólido, porta serial (RS-232), vários slots PCIe3 para conectividade ethernet, cartões USB 3.0 e unidades de estado sólido
adicionais Unidade de estado sólido M.2SamsungMZ-V5P512BWStreaming de alta velocidade e análise de dados de imagem Adaptador de
unidade de estado sólido M.2 para estações de trabalhoLycomDT-120M.2 para PCIe 3.0 adaptador de 4 pistas
Armazenamento conectado à redeSynologyDS-2415+Armazenamento e análise de dados de imagem
Discos rígidosWestern DigitalWD80EFZXRED 8 TB, 5400 RPM Classe SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Polegadas. Armazenamento de dados de imagem (10 unidades + redundância de 2 unidades)
Software
Aquisição de fluorescênciaHamamatsuHCImage DIAGravação de sequências de imagens de fluorescência de dois canais (GCaMP5 e mCherry) a 20 fps
Aquisição de campo claroFLIR (anteriormente Point Grey Research)FlycaptureGravação de sequências
de imagens JPEG de campo claroStage Serial Port ReaderBonsaihttps://bitbucket.org/horizongir/bonsaiFacilita o rastreamento de worms durante o comportamento
Software do controlador de LEDZeissMicro Toolbox Test 2011Para configurar a intensidade e as entradas de gatilho para os diferentes LEDs na unidade Colibri.2
ImageJ NIHhttps://imagej.net/Fiji/DownloadsRevisão simples de sequências de imagens e alterações de formatação para importação para o software de quantificação raciométrica
ExcelMicrosoft  2002984-001-000001Para gerar subconjuntos de dados de valores separados por vírgula de Volocity para análise MATLAB
Peak FindingMATLABR2017aScript usado para cálculos de recursos de pico de proporção
Quantificação ratiométricaPerkin ElmerVolocity 6.3Facilita o cálculo de canais de imagem raciométrica, segmentação de imagem para localização de objetos e medição de proporção de objetos encontrados
Scripts
XY-stage-final.bonsaiBonsaiDAQ acionado por TTL e leitor de porta serial de posição do stageRegistra a posição do estágio X e Y (em mícrons) quando o Arduino conectado recebe um sinal TTL positivo da câmera sCMOS durante a exposição do quadro. O script grava um arquivo .csv com quatro colunas: número do quadro, posição X (mícrons), posição Y (mícrons) e o tempo decorrido entre os quadros (normalmente ~ 50 ms ao gravar a 20 fps).  A posição do estágio X e Y desta saída (colunas 2 e 3, respectivamente) é adicionada às posições do centróide X e Y do script MATLAB AnalyzeGCaMP_2017.m (colunas 4 e 5, respectivamente), para fornecer a posição X e Y final do objeto fluorescente para a gravação.
Plasmídeo Torre Cabo Conectores BNC para Cabo

Referências

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Phil Trans R. Soc. 314, 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome. Science. 282, 2028-2033 (1998).
  3. Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147, 922-933 (2011).
  4. Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. In vivo neuronal calcium imaging in C. elegans. J. Vis. Exp. JoVE. , (2013).
  5. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  6. Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
  7. Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
  8. Zhang, M., et al. A self-regulating feed-forward circuit controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 18, 1445-1455 (2008).
  9. Shyn, S. I., Kerr, R., Schafer, W. R. Serotonin and Go modulate functional states of neurons and muscles controlling C. elegans egg-laying behavior. Curr. Biol. CB. 13, 1910-1915 (2003).
  10. Zhang, M., Schafer, W. R., Breitling, R. A circuit model of the temporal pattern generator of Caenorhabditis egg-laying behavior. BMC Syst. Biol. 4, 81(2010).
  11. Kerr, R. A., Schafer, W. R. Intracellular Ca2+ imaging in C. elegans. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 351, 253-264 (2006).
  12. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
  13. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, (2016).
  14. Inoue, M., et al. Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2. Nat. Methods. 12, 64-70 (2015).
  15. Oheim, M., et al. New red-fluorescent calcium indicators for optogenetics, photoactivation and multi-color imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1843, 2284-2306 (2014).
  16. Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
  17. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 18, 222-235 (2017).
  18. Storace, D., et al. Toward Better Genetically Encoded Sensors of Membrane Potential. Trends Neurosci. 39, 277-289 (2016).
  19. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  20. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  21. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. JoVE. , (2008).
  22. Clark, S. G., Lu, X., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans locus lin-15, a negative regulator of a tyrosine kinase signaling pathway, encodes two different proteins. Genetics. 137, 987-997 (1994).
  23. Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6, 198(2008).
  24. Thapaliya, E. R., et al. Bioimaging with Macromolecular Probes Incorporating Multiple BODIPY Fluorophores. Bioconjug. Chem. 28, 1519-1528 (2017).
  25. Mariol, M. -C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J. Vis. Exp. JoVE. , e50773(2013).
  26. Collins, K. M., Koelle, M. R. Postsynaptic ERG Potassium Channels Limit Muscle Excitability to Allow Distinct Egg-Laying Behavior States in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 33, 761-775 (2013).
  27. Collins, K. M., et al. Activity of the C. elegans egg-laying behavior circuit is controlled by competing activation and feedback inhibition. eLife. 5, e21126(2016).
  28. Li, P., Collins, K. M., Koelle, M. R., Shen, K. LIN-12/Notch signaling instructs postsynaptic muscle arm development by regulating UNC-40/DCC and MADD-2 in Caenorhabditis elegans. eLife. 2, 00378(2013).
  29. Banerjee, N., Bhattacharya, R., Gorczyca, M., Collins, K. M., Francis, M. M. Local neuropeptide signaling modulates serotonergic transmission to shape the temporal organization of C. elegans egg-laying behavior. PLoS Genet. 13, 1006697(2017).
  30. Lopes, G., et al. Bonsai: an event-based framework for processing and controlling data streams. Front. Neuroinformatics. 9, 7(2015).
  31. Flavell, S. W., et al. Serotonin and the neuropeptide PDF initiate and extend opposing behavioral states in C. elegans. Cell. 154, 1023-1035 (2013).
  32. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. J. Neurobiol. 49, 303-313 (2001).
  33. Ringstad, N., Horvitz, H. R. FMRFamide neuropeptides and acetylcholine synergistically inhibit egg-laying by C. elegans. Nat. Neurosci. 11, 1168-1176 (2008).
  34. Hallem, E. A., et al. Receptor-type guanylate cyclase is required for carbon dioxide sensation by Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 254-259 (2011).
  35. Tanis, J. E., Moresco, J. J., Lindquist, R. A., Koelle, M. R. Regulation of serotonin biosynthesis by the G proteins Galphao and Galphaq controls serotonin signaling in Caenorhabditis elegans. Genetics. 178, 157-169 (2008).
  36. Giordano-Santini, R., et al. An antibiotic selection marker for nematode transgenesis. Nat. Methods. 7, 721-723 (2010).
  37. Semple, J. I., Garcia-Verdugo, R., Lehner, B. Rapid selection of transgenic C. elegans using antibiotic resistance. Nat. Methods. 7, 725-727 (2010).
  38. Granato, M., Schnabel, H., Schnabel, R. pha-1, a selectable marker for gene transfer in C. elegans. Nucleic Acids Res. 22, 1762-1763 (1994).
  39. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  40. Gong, J., et al. The C. elegans Taste Receptor Homolog LITE-1 Is a Photoreceptor. Cell. 167, 1252-1263 (2016).
  41. Liu, J., et al. C. elegans phototransduction requires a G protein-dependent cGMP pathway and a taste receptor homolog. Nat. Neurosci. 13, 715-722 (2010).
  42. Bhatla, N., Horvitz, H. R. Light and hydrogen peroxide inhibit C. elegans Feeding through gustatory receptor orthologs and pharyngeal neurons. Neuron. 85, 804-818 (2015).
  43. Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 4266-4273 (2013).
  44. Zang, K. E., Ho, E., Ringstad, N. Inhibitory peptidergic modulation of C. elegans serotonin neurons is gated by T-type calcium channels. eLife. 6, (2017).
  45. Branicky, R., Miyazaki, H., Strange, K., Schafer, W. R. The voltage-gated anion channels encoded by clh-3 regulate egg laying in C. elegans by modulating motor neuron excitability. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 34, 764-775 (2014).
  46. Hendricks, M., Ha, H., Maffey, N., Zhang, Y. Compartmentalized calcium dynamics in a C. elegans interneuron encode head movement. Nature. 487, 99-103 (2012).
  47. Nagy, S., Huang, Y. -C., Alkema, M. J., Biron, D. Caenorhabditis elegans exhibit a coupling between the defecation motor program and directed locomotion. Sci. Rep. 5, 17174(2015).
  48. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 147-152 (2011).
  49. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8, 153-158 (2011).
  50. Kato, S., et al. Global brain dynamics embed the motor command sequence of Caenorhabditis elegans. Cell. 163, 656-669 (2015).
  51. Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 113, 1074-1081 (2016).
  52. Toyoshima, Y., et al. Accurate Automatic Detection of Densely Distributed Cell Nuclei in 3D Space. PLOS Comput. Biol. 12, 1004970(2016).

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Rep rter GCaMP5Fluoresc ncia mCherryNeur nios HSNComportamento de Postura de OvosCampo Claro InfravermelhoAquisi o de Fluoresc nciaSegmenta o de ImagemAn lise de Raz o
Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.