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Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

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DOI:

10.3791/56913

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3 de abril de 2018

 ,  ,  ,  , 
1Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, 2Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 3Department of Pediatrics, University of Ottawa, 4Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para descobrir destinos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos, especificamente a terapia rhabodvirus e vaccinia vírus, mas pode ser facilmente adaptado para outros Oncolíticos plataformas de vírus ou para descobrir genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus em geral.

Resumo

Tecnologia de rastreio do elevado-throughput todo o genoma RNAi (RNA de interferência) foi amplamente utilizada para descobrir os fatores do hospedeiro que afetam a replicação do vírus. Aqui apresentamos a aplicação desta tecnologia para descobrir destinos de host que modulam especificamente a replicação do vírus de Marabá, um Rhabdovírus Oncolíticos e vírus vaccinia, com o objetivo de reforçar a terapia. Enquanto o protocolo foi testado para uso com Oncolíticos Marabá vírus e vírus do vaccinia Oncolíticos, esta abordagem é aplicável a outros vírus Oncolíticos e também pode ser utilizada para identificar alvos de anfitrião que modulam a replicação do vírus em células de mamíferos em geral. Este protocolo descreve o desenvolvimento e validação de um ensaio para a seleção de RNAi da elevado-produção em células de mamíferos, as considerações-chave e as etapas de preparação importantes para a realização de uma tela de RNAi alta produtividade primária e um guia passo a passo para realização de uma tela de RNAi alta produtividade primária; Além disso, ele amplamente descreve os métodos para a realização de estudos terciários de validação e validação de ecrã secundário. O benefício do elevado-throughput RNAi triagem é que permite que um de catalogar, de forma ampla e imparcial, fatores do hospedeiro que modulam a qualquer aspecto da replicação do vírus para o qual se pode desenvolver um ensaio em vitro como infectividade, estourou o tamanho, e citotoxicidade. Tem o poder para descobrir bioterapêutico metas imprevistas, com base no conhecimento atual.

Introdução

Rastreio com throughput alto todo o genoma RNAi tem provado para ser uma ferramenta inestimável para revelando insights biológicas em diversas áreas de estudo, incluindo biologia de vírus. Ao longo da última década ou assim, numerosos grupos comprometeram-se baseada em célula em grande escala RNAi triagem para extensivamente identificar genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus (revisado em1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). Curiosamente, um grande número dessas telas foram realizado em células cancerosas e diversas com vírus que são candidatos de vírus Oncolíticos atual incluindo vaccinia vírus8,9,10 , De vírus mixoma11, herpes simplex vírus12, estomatite vesicular vírus13,14e Marabá vírus15. Embora o foco da maioria desses estudos foi na identificação de fatores do hospedeiro que influenciam a algum aspecto da replicação do vírus e não na identificação de alvos bioterapêutico para reforçar a terapia de vírus Oncolíticos, dados valiosos poderiam ser extraídos esses conjuntos de dados em Neste contexto. É claro que o potencial poderoso para identificar alvos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos não foi totalmente explorado.

Uma infinidade de plataformas de vírus Oncolíticos... estão a ser testadas em estudos pré-clínicos e clínicos incluindo herpes simplex vírus, reovírus e vaccinia vírus, que têm tido sucesso demonstrável em experimentações clínicas do tarde-estágio. Para a maioria destas plataformas, esforços tem sido direcionados para alterar a genoma do vírus para melhorar a terapia. Por exemplo, para aumentar a especificidade do tumor, genes de vírus específicos foram excluídos ou uma mutação para restringir significativamente a replicação viral em células normais, mas não em células tumorais. Em alguns casos, transgenes foram adicionados como GM-CSF (fator estimulante de colônia de macrófagos granulócitos) para potencializar a resposta imune ou NIS (iodeto de sódio symporter) para permitir que vivo em imagem e absorção celular radioiodide para terapêutica fins. No entanto, tem havido muito pouco trabalho focado em genes do hospedeiro/tumor a manipular e explorar o impacto dos genes do hospedeiro/tumor na replicação de vírus Oncolíticos. Com o advento da tecnologia de rastreio com throughput alto, agora é possível sondar interações hospedeiro-vírus à escala do genoma e a decifrar as oportunidades para manipular o genoma do hospedeiro para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos (revisado em16, 17,,18).

Nós relatamos o primeiro estudo demonstrando prova de conceito para a utilização da elevado-produção genética de rastreio para identificar alvos de anfitrião que podem ser manipulados para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos. Para descobrir genes de anfitrião que modulam Marabá vírus oncolysis, um Rhabdovírus Oncolíticos atualmente está sendo testado em fase I e ensaios II, realizamos telas de RNAi todo o genoma em três linhas de células de tumor diferente em duplicado com um siRNA (RNA de interferência curto) biblioteca de direcionamento de genes 18.12015. Caminho análise de acertos identificados nas telas revelou enriquecimento de membros das vias resposta stress ER (retículo endoplasmático). Nós selecionamos 10 sucessos dentro destes caminhos para validação secundário usando siRNA com sequências alvos diferentes da tela principal. Como parte da validação do terciária, foi realizado um experimento de resgate com IRE1α (inositol-requerendo alfa de enzima 1) para confirmar que o hit foi no alvo. In vitro e em vivo testando usando um inibidor de pequena molécula de IRE1α resultaram em eficácia Oncolíticos dramaticamente melhorada.

Workenhe et al . 12 também conduziu a uma tela de RNAi genoma-larga usando um pool particulas de Lentivirus shRNA (curto grampo do RNA) biblioteca visando 16.056 genes para identificar fatores do hospedeiro restringindo o vírus humano herpes simplex tipo 1 (HSV-1) mutante mediada por KM100 oncolysis da mama. células cancerosas. Na tela principal, eles identificaram 343 genes o nocaute de que levam ao aprimorado citotoxidade de células infectadas KM100 sobre células infectadas por simulação; Eles selecionaram 24 destes genes para validação secundária. Fora os 24 genes, 8 genes foram confirmados na tela secundária com um deles sendo SRSF2 (arginina e serina-rich splicing factor 2), que foi posteriormente confirmada usando um experimento genético de resgate durante a validação terciária. O grupo passou a identificar um DNA topoisomerase inibidor de quimioterápicos que reduziu a fosforilação de SRSF2 e mostrou que o tratamento de combinação de HSV-1 KM100 com essa pista de inibidor de sobrevivência prolongada dos ratos de tumor-rolamento do TUBO.

Nos estudos acima mencionados, seguiu-se um fluxo de trabalho semelhante. Cada um começou com uma tela de RNAi genoma-largo principal seguida por uma tela secundária em um seleto número de sucessos identificados na tela principal. Este foi seguido por estudos de validação terciária, que incluía confirmando que o acerto no alvo realizando genética resgatar experimentos in vitro com final validação executada manipulando o alvo gene produto em vivo. Neste artigo, nós primeiro fornecer um protocolo geral para o desenvolvimento e validação de um ensaio de siRNA-rastreio de alto rendimento, que envolve determinar as condições ideais de transfeccao, quantidade de vírus e comprimento de infecção. Oferecemos também um protocolo detalhado para a realização de uma primária, uma tela de siRNA de alto rendimento, bem como uma descrição geral do método para executar validação de tela secundária e terciária validação.

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Protocolo

1. desenvolvimento e validação de um siRNA elevado-throughput do ensaio de triagem

Nota: Para todos os experimentos, use tampão Hepes crescimento mídia adequada para cada linha de celular. Veja a Figura 1 para uma visão geral do fluxo de trabalho de otimização de ensaio para validação terciária.

  1. Determinação das condições ideais do transfection
    1. Selecione uma linha de células de tumor ou idealmente tumor Múltiplo células linhas com o qual deseja otimizar as condições de transfeccao (por exemplo, 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20S; ver discussão para mais informações sobre a seleção de linhagens celulares).
    2. Selecione um reagente de transfeccao ou vários para testar. Pode ser necessário testar vários reagentes de transfecção, como alguns podem ser mais tóxicos ou mais eficiente do que outro em uma linha de determinada célula. Além disso, mantenha em mente que alguns podem impactar na infecção pelo vírus ou podem gerar o sinal de fundo elevado em cima da imagem.
    3. Decidir sobre positivo [e. g. siRNA direcionamento do mRNA PLK-1(Polo Like Kinase 1), que induz a morte celular] e negativo de controles de transfeccao (por exemplo, não-direcionamento siRNA).
    4. Siga o protocolo do transfection inversa para o reagente de transfeccao particular, mas variar a quantidade de reagente de transfeccao (por exemplo, 0.05, 0.1, 0,15 e 0,2 μL/poço) e celular (por exemplo, 625, 1250, 2500 células/poço) densidades de semeadura. Incluem repetições das seguintes condições: não tratada células, simulado transfectadas células (ou seja, as células mais reagente de transfeccao) e células transfectadas com positivos e negativos do transfection controle siRNA (ver Figura 2A por um prato de amostra layout).
      1. Em geral, preparar diluições de nM 80 de cada siRNA para uma concentração final no poço de 10 nM (dependendo da biblioteca, uma maior concentração de siRNA pode ser necessária). A menos que especificado de outra forma, dilua o siRNA com o reagente de Transfeccao de diluente. Prepare diluições de reagente de transfeccao.
      2. Pipetar 5 μL de siRNA por alvéolo, seguido de 5 µ l de reagente de transfeccao diluídos. Para facilitar este passo, distribua ao longo de uma coluna de uma placa de fundo U 96, as misturas de siRNA e o diluente de siRNA sozinho (para células transfectadas não tratadas e simulação). Distribua ao longo de uma segunda coluna, o reagente de transfeccao diluídos e diluente de reagente de transfeccao sozinho (para células não tratadas).
        1. Usar uma pipeta eletrônica, pipetar 5 μL/poço do conteúdo da primeira coluna contendo siRNA ou diluente de siRNA para os correspondentes poços da placa 384-bem seguido por 5 μL/poço do reagente de transfeccao diluído ou reagente de transfeccao diluente do segunda coluna.
      3. Centrifugar as placas a 1026 x g por 1 min à temperatura ambiente e incubar durante o tempo prescrito para o reagente de transfeccao (por exemplo, 5-20 min).
      4. Enquanto as placas estão incubando, prepare suspensões celulares de diferentes densidades. Pipeta 30 μL da suspensão de células por poço. Antes de colocar as placas na incubadora, deixe as placas descansar por 45-60 min à temperatura ambiente para permitir o ajuste uniforme de células19.
        Nota: Se o período de incubação prescrito para o reagente de transfeccao com siRNA for curto, prepare as suspensões celulares antes da incubação.
      5. Incube durante 48 a 72 h, dependendo do comprimento desejado do knockdown escolhido para a tela.
    5. Prepare uma fixação e coloração de solução consiste em formaldeído, Hoechst 33342 e PBS (tampão fosfato salino) para uma concentração final em cada poço de formol 4% e 5 µ g/mL de Hoechst 33342. Conforme necessário, tente um mais elevado (por exemplo, 7,5 ug/mL) ou concentração mais baixa (por exemplo, 2 ug/mL) de Hoechst se o sinal é fraco ou forte demais, respectivamente.
    6. Dispense a 30 μL da solução de fixação e coloração diretamente em todos os poços. Incubar as placas durante 30 min a 37 ° C. Armazenar as placas a 4 ° C. Se usando um microscópio confocal-não, lave as placas com PBS usando uma máquina de lavar prato; na maioria dos casos, a lavagem é desnecessária quando usando um microscópio confocal.
    7. Desenvolva um script para quantificar o número de células por poço.
      Nota: Existem vários pacotes de software disponíveis para esta finalidade e, enquanto cada um pode ter diferentes formas de geração de scripts, que todos geralmente têm um meio de identificação de núcleos, células e regiões de interesse, bem como calcular intensidades e Propriedades morfológicas. Ao desenvolver um script de triagem, é importante considerar o tempo necessário para executar o script por placa e talvez incluir medições só essenciais para minimizar o tempo de processamento. Por exemplo, para quantificar o número de telemóvel, um pode calcular a área de Hoechst por bem acima uma intensidade especificada; e para quantificar a propagação de vírus, pode-se calcular área GFP (proteína verde fluorescente), por bem acima uma intensidade especificada. O script "pared para baixo" vai precisar ser comparado com o script mais elaborado para garantir que nenhuma informação essencial é perdida.
    8. Analisar os resultados para determinar as condições de transfeccao ideal, que é a quantidade de reagente de transfeccao e a célula semeadura densidade que resulta em morte celular significativa (0-30% sobrevivência da pilha) e é minimamente tóxico para as células (por exemplo, 90-100% sobrevivência da pilha). Nota: Pode levar mais tempo para observar o fenótipo de morte celular em linhagens celulares com tempo de duplicação vezes. Ver Figura 2B e 2C para resultados representativos. Além disso, que sejam as células transfectadas com siRNA direcionamento-aproximadamente 90-100% de confluencia aquando da fixação como mais tarde um vai querer infectar células que são desta confluência.
  2. Determinação do comprimento de infecção e a quantidade ideal de vírus
    1. Siga as mesmas etapas de transfeccao inversa, conforme descrito anteriormente (ver 1.1.4.1 para 1.1.4.4); no entanto, usar somente as condições ideais de transfeccao (ver 1.1.8) (por exemplo, para as células de 786-O: 1500 células/poço e 0,05 μL/poço de RNAiMAX) e, além disso, incluem poços extras para ser infectado com vírus [por exemplo, poços com células não tratadas, simulação células transfectadas, células transfectadas com direcionamento-siRNA e células transfectadas com controles positivo vírus se aqueles são conhecidos (ou seja, alvejando genes do hospedeiro que irão inibir ou aumentar a replicação de siRNA)].
      1. Ver Figura 3A para um layout de placa de amostra. Incube durante 48-72 h.
    2. Infectar os poços adicionais de vírus com um vírus Oncolíticos expressar uma proteína fluorescente repórter (por exemplo, GFP) com uma gama de multiplicidades de infecção (MOIs) (por exemplo: 0,001 a 10; O intervalo escolhido ser dependerá do nível de resistência ou susceptibilidade da linha celular.). Incluem poços não infectados também. Pipetar 40 µ l de cada diluição de vírus por alvéolo para um volume final de 80 μL. Centrifugar cada placa a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente.
    3. Seguir de infecção, a imagem que as células vivem com um alto teor, automatizado microscópio em intervalos regulares (por exemplo, cada 4-8 h). Ver Figura 3B e 3C.
    4. Desenvolver um script para quantificar a propagação de vírus (por exemplo, área GFP por alvéolo) (ver 1.1.7). Analisar as imagens e selecione um ponto de tempo e um MOI que permitem a detecção de aumentos e diminuições em propagação. Certifique-se o ponto do tempo e a queda MOI dentro de uma escala linear para facilitar a detecção de pequenas mudanças na propagação. Estimar o fator Z (ou Z') para o ponto de tempo determinado e MOI.
      Nota: Estima-se fator de Z = 1-3 (σp + σn) / | μ - μ depn|, onde σp é o desvio padrão de amostra dos controles positivo vírus e σn é o desvio padrão de amostra do vírus negativo controles; e μp é a média de amostra dos controles positivo vírus e μn a amostra média dos controles negativos. Um Z-fator estimado de 0.5 - 1.0 é considerado para ser um excelente ensaio e apropriado para triagem de20,21.
    5. Confirme que o vírus negativo controle siRNA não tem impacto sobre a replicação do vírus, comparando-o aos poços simulados transfectados e não tratados. Muitas vezes é necessário testar vários controles negativos como alguns negativo siRNA controles podem impactar na replicação do vírus.
  3. Validação final do ensaio do elevado-throughput screening
    1. Repita as etapas 1.2.1 e 1.2.2 acima, mas só este tempo infectar as células com o MOI ideal. Em vez de imagens ao vivo, corrigir e mancha a placa (conforme descrito em 1.1.5 e 1.1.6) no ideal-ponto do tempo (ver 1.2.4).
    2. A placa de imagem. Analisar os resultados usando o mesmo script que será usado para a tela (consulte 1.1.7 e 1.2.4). Confirme as condições de transfeccao (ou seja, bom nocaute em poços transfected com controle positivo do transfection e toxicidade mínima em poços transfectadas com controle de transfeccao negativo). Estimar o Z-fator para determinar a robustez do ensaio (ver 1.2.4).
  4. Novos testes e considerações para a realização de seleção da elevado-produção
    1. Teste a durabilidade das placas de microtitulação como algumas placas podem rachar durante a centrifugação, especialmente quando as tampas são mantidas e várias placas são centrifugadas imediatamente. Para reduzir rachaduras, centrifugar sem as tampas (desde que as placas têm selos), ou diminuir o número de placas centrifugadas por balde.
    2. Teste a estabilidade da mistura de reagente de transfeccao ao longo do tempo. Uma vez que o reagente de transfeccao é adicionado às placas, pode haver um atraso significativo antes da adição de células; Portanto, é importante saber o período de tempo para que a mistura de reagente de transfeccao permanecerá eficaz. Para a tela, pode ser necessário preparar as células antes de adicionar a mistura de reagente de Transfeccao para as placas.
    3. Prepare-se para usar o líquido dispensador. Determinar os volumes necessários para dispensar o reagente de transfeccao, células, vírus e fixar tendo em conta o volume que as preensões da tubulação, o volume perderam para pré-rotulagem (se a unidade tiver esse recurso) e o volume residual exigido nas garrafas usadas para de distribuição.
      1. Definir e testar os programas que serão usados para distribuir vírus, células e reagente de transfeccao. Para minimizar a perda de reagente de transfeccao, limite, se possível, o número de pre-dispensa. Estabelece um protocolo para calibrar o dispensador de líquidos e testar sua exatidão e precisão.
    4. Prepare-se para a distribuição em massa de vírus, células e reagente de transfeccao
      1. Primeiro, determine o número de pratos para serem processados em um lote, considerando o número de placas de células que viável podem ser trypsinized ao mesmo tempo, o número de placas de microtitulação que podem ser centrifugadas ao mesmo tempo, o período de tempo necessário para processar um lote de placas com o distribuidor de líquido e também o tempo necessário para a imagem latente. Nota: Geralmente, o processamento de aproximadamente 30 placas cada vez é bastante viável e 3 lotes de placas de processamento é controlável em um dia.
      2. Empiricamente, verifique se o volume de reagente de transfeccao necessário para processar um lote de placas. Teste que este volume é adequada por aplicadora 5 μL de água destilada várias vezes através de uma placa equivalente número de vezes que será necessário para processar um lote.
      3. Para garantir a distribuição uniforme de células, estime o tempo necessário para dispensar as células através de um lote de placas. Preparar um frasco contendo o volume de células necessárias para um lote e dispense as células em várias colunas de um prato de cada vez, em intervalos regulares ao longo do tempo que levará para dispensar em um lote de placas mesmo. Teste quantas vezes será necessário misturar as células para manter uma distribuição uniforme de células.
      4. Para garantir a distribuição uniforme do vírus, repita o mesmo procedimento acima (ver 1.4.4.3), mas desta vez a distribuição de vírus para poços confluentes. Se o vírus não é distribuído uniformemente, considere preparando o vírus nos tubos cónicos e num Vortex cada tubo antes da dispensação.
    5. Acompanhar o crescimento de células para determinar a linha do tempo para o cultivo de células suficientes para a tela. Além disso, determine o número médio de células que podem ser colhidas por placa de células crescendo na fase de registro, a fim de ser capaz de estimar o número exigido para a tela.
  5. Etapas de preparação final para a seleção da elevado-produção
    1. Até um mês antes do início do rastreio, determine todos os materiais necessários para a tela. Ordem qualquer reagentes necessários (ver materiais). Garantir a quantidade necessária de vírus está na mão (de preferência, use o mesmo material que foi usado durante a otimização.).
    2. A duas semanas antes do início do rastreio, descongelar e crescer as células necessárias para a tela. Garanta a disponibilidade do centrifugador e cubetas da centrífuga quadrados.
    3. Durante a semana antes do início do rastreio, preparar garrafas de mídia a transfeccao reverso e infecção, um estoque de etanol a 70%, 2 diluente de reagente de Transfeccao de X (por exemplo, 2 X Opti-MEM), se necessário (por exemplo, se a biblioteca de siRNA é diluída em RNase-free de água, um vai querer usar 2 X ao transfect células) e alíquotas de vírus (uma por lote de placas). Verifique a condição das células.
      1. Prepare uma solução stock de Hoechst 33342 mancha (por exemplo, 5 mg/mL). Prepare um prato de equilíbrio se um será necessário para centrifugação.
      2. Certifique-se de que máquina de lavar a placa está em bom estado de funcionamento se será usado. Certifique-se do que líquido dispensador é aplicadora e devidamente calibrado com precisão e precisamente. Certifique-se também, que os programas são definidos corretamente sobre o dispensador de líquidos.

2. realização de tela principal alto throughput

Nota: Antes de iniciar a tela de RNAi, placas de microtitulação (por exemplo, placas de 384-boas) precisam ser dispostos com a biblioteca de siRNA e controles de triagem. As etapas a seguir são melhor conduzidas por duas pessoas com uma pessoa (ou seja, A pessoa), sendo principalmente responsável para o fornecimento do reagente de transfeccao e células através das placas e a segunda pessoa (ou seja, pessoa B) sendo responsável pela centrifugação as placas imediatamente antes do transfection e para preparar as células. Incluído entre parênteses são alguns detalhes para o processamento de um lote de 33 placas (ou seja, metade da biblioteca) com a linha 786-O celular.

  1. Preparação para transfeccao reversa
    1. Pessoa r: Coloque a mídia, tripsina e PBS suficiente necessário para processar um lote de chapas em banho maria a 37 ° C. Opcional: Trypsinize um prato de células e contar o número de células por placa, a fim de fornecer uma estimativa em tempo real do número de placas necessárias por lote.
    2. Obter um lote de placas (por exemplo, 33 placas) do congelador e espere 20-30 min para permitir que as placas descongelar. Enquanto as placas são de degelo, continue com as etapas a seguir.
      1. Pessoa r: tubos de pipeta no Erlenmeyer de 50 mL a quantidade de diluente de reagente de transfeccao necessário para o processamento de um lote de placas (por exemplo, 2 x 37.125 mL) e colocá-los em banho maria a 37 ° C. Encha duas garrafas com etanol a 70% (por exemplo, garrafas de 250-500 mL). Preencha dois tubos cônicos de 50 mL com PBS e outro com água destilada.
      2. Pessoa r: Mergulhe o líquido dispensador de tubulação em um frasco de etanol a 70%. Se todas as pontas não serão usadas para distribuir o reagente de transfeccao (por exemplo, se os poços exteriores da placa não estão sendo usados), desanexe a tubagem desnecessários primeiro. Coloque um pedaço de fita adesiva ao redor da tubulação para marcar o ponto abaixo do qual a tubulação pode ser considerada estéril. Primeiro com cerca de 25 mL. Despeje o frasco para substituir o volume perdido etanol adicional. Deixe o tubo de sentar-se em etanol por um período mínimo de 5 min.
      3. Pessoa b: preparar-se para trypsinize células. Pulverize o capuz de cultura de tecidos (TC) com etanol a 70%. Spray e coloque as pipetas necessárias, dicas, garrafas e tubos de microcentrífuga para a preparação de células de capuz (ver 2.2.1.1 e 2.2.1.2). Centrifugar as placas seladas em conjuntos a 1026 x g por 2 min à temperatura ambiente. Remova as tampas das placas em uma capa de TC, se previamente determinado que as placas se zangue durante a centrifugação quando as tampas são mantidas na (ver 1.4.1).
    3. Pessoa r: Retire os selos as chapas. Antes, durante ou após os selos foram removidos (dependendo da duração da incubação necessária), pipetar a quantidade necessária de reagente de transfeccao (por exemplo, 375 μL/tubo para uma concentração final de 0,05 μl de RNAiMAX/poço) para os tubos cônicos contendo o diluente de reagente de transfeccao previamente aquecido (por exemplo, 37.125/tubo mL).
    4. Misture pipetando acima e para baixo 10 vezes. Incube à temperatura ambiente durante o tempo prescrito para o reagente de transfeccao sendo usado (por exemplo, 0-10 min).
  2. Reversa do transfection
    1. Ter a pessoa B conclua as seguintes tarefas.
      1. Begin trypsinizing as células (por exemplo, 3 placas de células 786-O). Aspire os meios de comunicação de cada prato. Enxaguar com 9 mL de PBS. Pipetar 3 mL de tripsina por placa. Incube a 37 ° C por aproximadamente 5 min. Ressuspender as células com 22 mL de mídia. Pipetar acima e para baixo 10 vezes.
      2. Combine a suspensão de células de cada placa de cultura de tecido em um frasco estéril. Misture a suspensão de eritrócitos por inversão. Alíquotas de 1 mL pipeta da suspensão celular em dois tubos de microcentrífuga separado. Retire uma amostra de cada tubo de microcentrífuga e contar as células. Calcular o volume da suspensão de células necessária para a densidade necessária (por exemplo, 1500 células/poço) e preparar o suficiente suspensão diluída de células (por exemplo 500ml) para dispensar em um lote de placas.
    2. Tem pessoa conclua as seguintes tarefas em paralelo à pessoa B.
      1. Esvaziar o recipiente do líquido tubulação de etanol. Prime o tubo com aproximadamente 25 mL de PBS e em seguida, esvaziar o tubo. Tenha cuidado ao manusear o tubo para garantir que a seção do tubo abaixo da fita adesiva que vai ser imerso no reagente de transfeccao e mais tarde na suspensão de célula é mantida estéril. Separar as placas que podem ser feitas com segurança com um tubo cónico de solução reagente de transfeccao.
      2. Pipetar as soluções de reagente de transfeccao cima e para baixo 10 vezes. Encha o tubo com a solução de reagente de transfeccao. Para minimizar a perda de reagente de transfeccao, prime com suficiente solução para limpar mal as dicas. Selecione o programa correto sobre o líquido dispensador e dispensar 5 µ l de reagente de transfeccao por bem.
        Cuidado: Acompanhar de perto o nível de reagente de Transfeccao para que ele é reabastecido antes que se esgote. A conclusão das placas que são separados do conjunto deve fornecer uma indicação para adicionar mais solução de reagente de transfeccao.
      3. Centrifugar as placas a 1026 x g por 1 min à temperatura ambiente. Desta vez as tampas será, então, pode ser necessário centrifugar menos placas de cada vez para evitar rachaduras (por exemplo, 2 placas por balde). Incubar as placas à temperatura ambiente durante o tempo prescrito para o reagente de transfeccao sendo usado (por exemplo, 10-20 min).
      4. Durante a incubação, esvaziar o tubo da solução reagente de transfeccao e colocá-lo em um tubo cônico cheio de 50 mL contendo PBS. Lave o tubo com aproximadamente 25 mL de PBS por escorva e esvaziamento.
        1. Se mais das dicas vão ser utilizados para dispensar as células que foram usados para o fornecimento do reagente de transfeccao, re-anexar o tubo não utilizado e re-esterilizar todos os tubos com etanol a 70% antes de enxaguar o tubo com PBS (ver 2.1.2.2).
      5. Misture o frasco contendo a suspensão de células, uma vez que ele foi preparado. Colocar o tubo na suspensão de célula e prime o suficiente para ver que cada ponta é dispensar corretamente. Dispense a 30 μL por poço da suspensão celular através de todos os pratos. Se necessário, misture a suspensão de eritrócitos em intervalos regulares para evitar a sedimentação.
        Cuidado: Às vezes as gotas de suspensão contendo mídia podem aderir aos lados das dicas. Quando este é observado, logo que possível, Aspire ou limpe com fiapos de tecido encharcado em etanol a 70%.
      6. Esvazie o tubo da suspensão celular. Lave o tubo com aproximadamente 25 mL de PBS, seguido por cerca de 50 mL de água destilada.
    3. Permitir que as placas se sentar por 45-60 min, desde o tempo da célula semeadura à temperatura ambiente antes de retornar as placas para a incubadora. Incubar as placas na incubadora intacta para o comprimento desejado do gene silencioso (por exemplo, 48 h) (ver 1.1.4.5).
  3. Infecção
    1. Para poupar tempo, o dia antes de infectar as células, pipetar em estéril garrafas a quantidade precisa de meios de comunicação necessários para infectar cada lote de placas, incluindo meios para poços não infectados (por exemplo, 2 x 350 mL e 2 x 50 mL para 33 placas). Além disso, teste o líquido dispensador de precisão e exatidão e re-calibrar se necessário.
    2. Aquecer a mídia a 37 ° C. Encha duas garrafas com 70% de etanol, dois tubos de 50ml cónico com PBS e outro com água destilada. Verifique se a centrífuga à temperatura ambiente.
    3. Esterilizar o tubo com etanol a 70% e enxágue com PBS, como descrito anteriormente (ver 2.1.2.2 e 2.2.2.1). Enquanto a tubulação está sentado o etanol, pipetar o volume exato de vírus necessários para o frasco contendo a mídia anteriormente preparado para infecção (ver 2.3.1). Enxague o tubo com PBS pela escorva com 25 mL e em seguida esvaziar.
    4. Retire as placas da incubadora e colocá-los ao subúrbio de TC. Prime o tubo com a mídia. Dispense a 40 μL de mídia em poços de controle não infectados. Esvaziar o tubo de mídia e enxágue com 25 mL de PBS. (consulte 2.2.2.5 para precaução)
    5. Depois de misturar o vírus, coloque o tubo no frasco contendo o vírus. Dispense a 40 μl de vírus entre as placas. Centrifugar as placas por 30 min a 400 x g, à temperatura ambiente. Entregue as chapas para a incubadora. Incubar as placas para o previamente determinado período de tempo (por exemplo, 24 h) (ver 1.2.4).
  4. Fixação e coloração de células
    1. Para poupar tempo, o dia antes da fixação, prepare uma garrafa de fixação e coloração de solução contendo formaldeído e PBS (por exemplo, 179 mL de formol 37% e 270 mL de PBS para uma concentração final de 4% de formaldeído) para cada lote de placas, mas omitir o Mancha da Hoechst. Armazenar em armário longe da luz do inflamável.
    2. Lave o tubo com etanol a 70% e PBS como descrito anteriormente (ver 2.1.2.2 e 2.2.2.1). Adicionar o volume necessário de Hoechst (EG. mL 2,5 a 5 mg/ml de Hoechst para uma concentração final no poço de 7,5 μg/mL) para a fixação e coloração de solução e mix.
    3. Dispense a 30 μL de fixação e coloração de solução através de todos os pratos. Coloca as placas na incubadora durante 30 min. Após incubação, aplicam-se os selos para as placas e armazenar as placas a 4° C, protegido da luz. Lavar as placas, se necessário (ver 1.1.6).
  5. Geração de imagens e análise de imagem
    1. As placas da imagem com um microscópio automatizado de alto teor. Use as configurações previamente determinadas, mas primeiro testar as configurações para garantir que não há ajustes precisam ser feitos.
    2. Quantificar a GFP (ou outro repórter fluorescente) área e Hoechst por bem utilizando o script anteriormente desenvolvido (ver 1.3.2). Teste o script com um punhado de placas primeiro para determinar se quaisquer pequenas modificações precisam ser feitas antes de lote, analisando todas as placas.
    3. Identifica bate. Nota: O método robusto de Z-score/MAD (desvio absoluto mediano) é um método que é frequentemente usado para este fim. Normalmente, os escores de > 2 ou < -2 são definidas como cortes. Este método é melhor usado quando as amostras de siRNA são distribuídas aleatoriamente entre as placas e não, por exemplo, agrupadas por função como as amostras são usadas como controles negativos de fato . Filtre os siRNAS citotóxicos como estas seria esperadas não especìfica diminuir vírus se espalhar (veja discussão para mais detalhes sobre filtragem de sucessos citotóxicos).

3. validação de tela secundária de hits com a biblioteca de shRNA TRC (o RNAi Consortium)

Nota: Consulte a discussão para obter detalhes sobre como selecionar hits para validação secundária e possíveis tecnologias de rastreio. Se tecnologia siRNA é selecionada para validação secundária, o mesmo protocolo de desenvolvimento e validação do ensaio pode ser usado como foi usado para a tela principal (ver 1).

  1. Obter uma biblioteca de shRNA TRC personalizada visando os genes candidatos de interesse como estoques de glicerol.
  2. Prepare a transfeccao qualidade Plasmídeo das existências glicerol. Nota: Um protocolo Detalhado (ou seja, "ShRNA/sgRNA/ORF glicerol e preparação de DNA de plasmídeo") pode ser encontrado aqui: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  3. Produzir lentivírus expressam shRNA alvo os genes de interesse com o plasmídeo de DNA. Nota: Um protocolo detalhado para a produção de lentivirus em placas de 96 poços [ou seja, "shRNA/sgRNA/ORF alto Throughput produção Viral (96 bem)"] pode ser encontrada aqui: http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols.
  4. Infectar células com os lentivírus. Nota: Um protocolo detalhado para Lentivirus infecção em placas de 96 poços (ou seja, "Infecção Lentivirus") está disponível online em http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/dir/download?dirpath=protocols/production&filename=TRC%20viral % 20infection%20200909.pdf.
  5. Infectar células com vírus Oncolíticos ou seguir puromicina (ver 3.4 para o protocolo de seleção) de células transduzidas com êxito ou transdução imediatamente seguinte (sem puromicina). Para determinar a quantidade ideal de vírus e o comprimento da incubação com vírus, use o mesmo método usado para a tela principal.

4. terciária validação

Nota: O propósito de validação terciária é principalmente confirmar que o acerto no alvo, tumor específico e aumenta a eficácia in vivo. Um pode também testar se modula propagação através de um espectro de linhas de células de tumor

  1. Confirmação ou knockdown do gene candidato está no alvo
    1. Primeiro, confirme que existe uma correlação entre o fenótipo e o silenciamento de genes. Use o mesmo ensaio que foi desenvolvido para a tela ou modificá-lo para um formato 6-poços avaliar o reforço ou inibição da propagação em um formato maior. Realizar um curso de tempo com células transfectadas com siRNA alvejando os genes de interesse mais e menos vírus.
    2. Imagem dos poços contendo células infectadas por vírus e coletar os lisados celulares dos poços não infectados em intervalos de tempo regulares. Determine se há uma correlação entre o silenciamento de genes e reforço ou inibição da propagação. Avalie o silenciamento de genes quantitativos Polymerase Chain Reaction (qPCR) e/ou mancha ocidental.
    3. Execute um experimento de resgate genético para confirmar o acerto no alvo. Nota: Em um experimento típico de resgate, o gene candidato é knocked-down com RNAi enquanto ao mesmo tempo as células são transfected transitoriamente com cDNA RNAi resistente (por exemplo, ortholog do gene) expressa o gene candidato para determinar se o fenótipo do gene é restaurado ou "resgatado". Linhas de célula estável superexpressão RNAi resistente do cDNA do gene candidato de interesse também podem ser empregadas.
    4. Alternativamente, em vez de um experimento genético de resgate, use vários ensaios ortogonais para confirmar que o sucesso está no alvo [por exemplo, determinar se o mesmo fenótipo é obtido após o nocaute do gene alvo com siRNAs múltiplas, após a derrubada de o gene alvo em várias linhas de célula estável que expressam shRNA contra o gene alvo e após o nocaute com CRISPR (Clustered regularmente intercalada curta palíndromo repetição)-Cas9 tecnologia em várias linhas de célula...
  2. Confirmação de que o sucesso é específico do tumor e modula espalhados em uma gama de linhas de células de tumor
    1. Realizar um ensaio similar como em 4.1.1, mas com as células normais, bem como com outras linhas de células de tumor.
  3. Confirmação de que a manipulação do gene candidato aumenta eficácia na vivo
    Nota: Descritos abaixo é três métodos possíveis para manipular o gene alvo na vivo.
    1. Encontre uma droga para manipular o gene alvo. Se houver uma droga como um inibidor de molécula pequena que tem como alvo o mesmo gene, administrá-lo com o de vírus Oncolíticos em vivo. É importante determinar o momento ideal para administrar a droga.
    2. Engenheiro do vírus para inibir ou overexpress o alvo gene dependendo se um deseja inibir ou reforçar o alvo do gene. Para inibir o gene, engenheiro o vírus Oncolíticos para expressar uma posição dominante negativa do gene ou para expressar shRNA alvo o gene. Para aumentar a expressão do alvo gene, clone o vírus Oncolíticos com um transgene superexpressão do gene.
    3. Engenheiro de linhas de células com o gene knocked-down ou usando shRNA ou CRISPR-Cas9 tecnologia, respectivamente eliminado. Implante a linha celular projetado e o selvagem-tipo célula linha na vivo e posteriormente infectar com o vírus Oncolíticos. Nota: Esse método serve como um prova de princípio e pode ajudar a determinar se a investir mais tempo e recursos para desenvolver um medicamento para manipular o gene na vivo, por exemplo, valeria a pena.

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Resultados

Uma visão geral do fluxo de trabalho para identificar alvos de anfitrião para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos é apresentada na Figura 1.

Conforme ilustrado na Figura 1, o primeiro passo fundamental para a condução de uma tela de RNAi elevado-throughput é desenvolvimento de ensaio. Figura 2A fornece um layout de placa de amostra para...

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Discussão

Aqui nós apresentamos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para identificar alvos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos. Isso foi testado com sucesso com Oncolíticos Marabá vírus e vírus do vaccinia Oncolíticos, mas, como foi observado, pode ser adaptado para uso com outros vírus Oncolíticos ou outros vírus geralmente para identificar genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus. O protocolo de triagem também é projetado para identificar genes que...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto de Ontário para pesquisa do câncer, a Fundação do Canadá para a inovação, o Ottawa Regional Cancer Foundation e o Instituto de pesquisa do Terry Fox. K.J.A. foi apoiado por uma bolsa graduação Canadá Vanier, um Instituto canadense de saúde pesquisa-mestrado Award e uma bolsa de pós-graduação de Ontário.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Consumíveis
siRNA bibliotecaGE DharmaconG-005005-02
Corning placa de 384 poçosCorning3985
Falcon placa de 384 poçosBecton Dickinson353962
Water SigmaW4502
siGenome SMARTpool PLK1GE DharmaconM-003290-01
AllStars Controle Negativo siRNAQiagenSI03650318
siGenome SiRNA não direcionado Pool # 2GE DharmaconD-001206-14-20
DMEM / GLICOSE ALTAGE Healthcare Life SciencesSH30022.01
Soro Fetal BovinoSigmaF15051-500ML
Solução HEPES (1M)SigmaH3535-100ML
Solução de penicilina-estreptomicina 100XGE Healthcare Life SciencesSV30010
Tripsina-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific2500056
DPBS/ModificadoGE Healthcare Life SciencesSH30028.02
Lipofectamina RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778100
OligofectaminaThermo Fisher Scientific1225011
Opti-MEMThermo Fisher Scientific22600-050
Sal de sódio ResazurinSigmaR7017-5G
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH21492
Formaldeído (37% em peso)Fisher ScientificF79-4
Garrafas de 500 mlCorning
vedação adesivo 430282 para microplacasExcel Scientific361006007
Folha de selagem a quente destacávelThermo Fisher ScientificAB-3720
BioTek MicroFlo Select DispenserFisher Scientific11-120-625
NomeEmpresa<strong>Catálogo NúmeroComentários
Equipamento
MicroFlo Select (dispensador de líquidos)Fisher Scientific11120621
BioTek Synergy HT leitor de placasBiotekN/A
Opera Imaging and Analysis InstrumentPerkinElmerHH10000115
KiNEDx Braço RobóticoAnálise e Automação de Pico (anteriormente Peak Robotics)KX-300-660
Incubadora Automatizada Cytomat Série 24CThermo Fisher Scientific50080227
JANUSPerkinElmerAJI4M01
Carrosselde Placas Análise e Automação de Pico (anteriormente Peak Robotics)Selador
Alps 3000Thermo Fisher ScientificAB-3000
Filme de Estação de Trabalho Automatizada de placas N/A

Referências

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