Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

Kristina J. Allan; Douglas J. Mahoney; Stephen D. Baird; Charles A. Lefebvre; David F. Stojdl

doi:10.3791/56913

Artigo de método

Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

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DOI:

10.3791/56913

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3 de abril de 2018

Kristina J. Allan¹^,² , Douglas J. Mahoney¹^,⁴ , Stephen D. Baird¹ , Charles A. Lefebvre¹ , David F. Stojdl¹^,²^,³

¹Children's Hospital of Eastern Ontario (CHEO) Research Institute, ²Department of Biology, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, ³Department of Pediatrics, University of Ottawa, ⁴Department of Microbiology, Immunology and Infectious Diseases, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para descobrir destinos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos, especificamente a terapia rhabodvirus e vaccinia vírus, mas pode ser facilmente adaptado para outros Oncolíticos plataformas de vírus ou para descobrir genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus em geral.

Resumo

Tecnologia de rastreio do elevado-throughput todo o genoma RNAi (RNA de interferência) foi amplamente utilizada para descobrir os fatores do hospedeiro que afetam a replicação do vírus. Aqui apresentamos a aplicação desta tecnologia para descobrir destinos de host que modulam especificamente a replicação do vírus de Marabá, um Rhabdovírus Oncolíticos e vírus vaccinia, com o objetivo de reforçar a terapia. Enquanto o protocolo foi testado para uso com Oncolíticos Marabá vírus e vírus do vaccinia Oncolíticos, esta abordagem é aplicável a outros vírus Oncolíticos e também pode ser utilizada para identificar alvos de anfitrião que modulam a replicação do vírus em células de mamíferos em geral. Este protocolo descreve o desenvolvimento e validação de um ensaio para a seleção de RNAi da elevado-produção em células de mamíferos, as considerações-chave e as etapas de preparação importantes para a realização de uma tela de RNAi alta produtividade primária e um guia passo a passo para realização de uma tela de RNAi alta produtividade primária; Além disso, ele amplamente descreve os métodos para a realização de estudos terciários de validação e validação de ecrã secundário. O benefício do elevado-throughput RNAi triagem é que permite que um de catalogar, de forma ampla e imparcial, fatores do hospedeiro que modulam a qualquer aspecto da replicação do vírus para o qual se pode desenvolver um ensaio em vitro como infectividade, estourou o tamanho, e citotoxicidade. Tem o poder para descobrir bioterapêutico metas imprevistas, com base no conhecimento atual.

Introdução

Rastreio com throughput alto todo o genoma RNAi tem provado para ser uma ferramenta inestimável para revelando insights biológicas em diversas áreas de estudo, incluindo biologia de vírus. Ao longo da última década ou assim, numerosos grupos comprometeram-se baseada em célula em grande escala RNAi triagem para extensivamente identificar genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus (revisado em¹^,²^,³^,⁴ ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷). Curiosamente, um....