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Rastreio de RNAi todo o genoma para identificar fatores do hospedeiro que modulam o vírus Oncolíticos terapia

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DOI:

10.3791/56913

3 de abril de 2018

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para descobrir destinos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos, especificamente a terapia rhabodvirus e vaccinia vírus, mas pode ser facilmente adaptado para outros Oncolíticos plataformas de vírus ou para descobrir genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus em geral.

Resumo

Tecnologia de rastreio do elevado-throughput todo o genoma RNAi (RNA de interferência) foi amplamente utilizada para descobrir os fatores do hospedeiro que afetam a replicação do vírus. Aqui apresentamos a aplicação desta tecnologia para descobrir destinos de host que modulam especificamente a replicação do vírus de Marabá, um Rhabdovírus Oncolíticos e vírus vaccinia, com o objetivo de reforçar a terapia. Enquanto o protocolo foi testado para uso com Oncolíticos Marabá vírus e vírus do vaccinia Oncolíticos, esta abordagem é aplicável a outros vírus Oncolíticos e também pode ser utilizada para identificar alvos de anfitrião que modulam a replicação do vírus em células de mamíferos em geral. Este protocolo descreve o desenvolvimento e validação de um ensaio para a seleção de RNAi da elevado-produção em células de mamíferos, as considerações-chave e as etapas de preparação importantes para a realização de uma tela de RNAi alta produtividade primária e um guia passo a passo para realização de uma tela de RNAi alta produtividade primária; Além disso, ele amplamente descreve os métodos para a realização de estudos terciários de validação e validação de ecrã secundário. O benefício do elevado-throughput RNAi triagem é que permite que um de catalogar, de forma ampla e imparcial, fatores do hospedeiro que modulam a qualquer aspecto da replicação do vírus para o qual se pode desenvolver um ensaio em vitro como infectividade, estourou o tamanho, e citotoxicidade. Tem o poder para descobrir bioterapêutico metas imprevistas, com base no conhecimento atual.

Introdução

Rastreio com throughput alto todo o genoma RNAi tem provado para ser uma ferramenta inestimável para revelando insights biológicas em diversas áreas de estudo, incluindo biologia de vírus. Ao longo da última década ou assim, numerosos grupos comprometeram-se baseada em célula em grande escala RNAi triagem para extensivamente identificar genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus (revisado em1,2,3,4 , 5 , 6 , 7). Curiosamente, um....

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Protocolo

1. desenvolvimento e validação de um siRNA elevado-throughput do ensaio de triagem

Nota: Para todos os experimentos, use tampão Hepes crescimento mídia adequada para cada linha de celular. Veja a Figura 1 para uma visão geral do fluxo de trabalho de otimização de ensaio para validação terciária.

  1. Determinação das condições ideais do transfection
    1. Selecione uma linha de células de tumor ou idealmente tumor Múltiplo células linhas com o qual deseja otimizar as condições de transfeccao (por exemplo, 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20S; ver discussão para mais inf....

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Resultados

Uma visão geral do fluxo de trabalho para identificar alvos de anfitrião para melhorar a terapia de vírus Oncolíticos é apresentada na Figura 1.

Conforme ilustrado na Figura 1, o primeiro passo fundamental para a condução de uma tela de RNAi elevado-throughput é desenvolvimento de ensaio. Figura 2A fornece um layout de placa de amostra para.......

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Discussão

Aqui nós apresentamos um protocolo para empregar o rastreio com throughput alto RNAi para identificar alvos de host que podem ser manipulados para aumentar a terapia de vírus Oncolíticos. Isso foi testado com sucesso com Oncolíticos Marabá vírus e vírus do vaccinia Oncolíticos, mas, como foi observado, pode ser adaptado para uso com outros vírus Oncolíticos ou outros vírus geralmente para identificar genes de anfitrião que modulam a replicação do vírus. O protocolo de triagem também é projetado para identificar genes que.......

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Instituto de Ontário para pesquisa do câncer, a Fundação do Canadá para a inovação, o Ottawa Regional Cancer Foundation e o Instituto de pesquisa do Terry Fox. K.J.A. foi apoiado por uma bolsa graduação Canadá Vanier, um Instituto canadense de saúde pesquisa-mestrado Award e uma bolsa de pós-graduação de Ontário.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Consumíveis
siRNA bibliotecaGE DharmaconG-005005-02
Corning placa de 384 poçosCorning3985
Falcon placa de 384 poçosBecton Dickinson353962
Water SigmaW4502
siGenome SMARTpool PLK1GE DharmaconM-003290-01
AllStars Controle Negativo siRNAQiagenSI03650318
siGenome SiRNA não direcionado Pool # 2GE DharmaconD-001206-14-20
DMEM / GLICOSE ALTAGE Healthcare Life SciencesSH30022.01
Soro Fetal BovinoSigmaF15051-500ML
Solução HEPES (1M)SigmaH3535-100ML
Solução de penicilina-estreptomicina 100XGE Healthcare Life SciencesSV30010
Tripsina-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific2500056
DPBS/ModificadoGE Healthcare Life SciencesSH30028.02
Lipofectamina RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778100
OligofectaminaThermo Fisher Scientific1225011
Opti-MEMThermo Fisher Scientific22600-050
Sal de sódio ResazurinSigmaR7017-5G
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH21492
Formaldeído (37% em peso)Fisher ScientificF79-4
Garrafas de 500 mlCorning
vedação adesivo 430282 para microplacasExcel Scientific361006007
Folha de selagem a quente destacávelThermo Fisher ScientificAB-3720
BioTek MicroFlo Select DispenserFisher Scientific11-120-625
NomeEmpresa<strong>Catálogo NúmeroComentários
Equipamento
MicroFlo Select (dispensador de líquidos)Fisher Scientific11120621
BioTek Synergy HT leitor de placasBiotekN/A
Opera Imaging and Analysis InstrumentPerkinElmerHH10000115
KiNEDx Braço RobóticoAnálise e Automação de Pico (anteriormente Peak Robotics)KX-300-660
Incubadora Automatizada Cytomat Série 24CThermo Fisher Scientific50080227
JANUSPerkinElmerAJI4M01
Carrosselde Placas Análise e Automação de Pico (anteriormente Peak Robotics)Selador
Alps 3000Thermo Fisher ScientificAB-3000
Filme de Estação de Trabalho Automatizada de placas N/A

Referências

  1. Cherry, S. What have RNAi screens taught us about viral-host interactions? Curr. Opin. Microbiol. 12 (4), 446-452 (2009).
  2. Panda, D., Cherry, S. Cell-based genomic screening: elucidating virus-host interactions. Curr. Opin. Virol. 2 (6), 784-....

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