Descrevemos a estratégia de produção de vetores de Lentivirus integrase deficiente (IDLVs) como veículos para a entrega CRISPR/Cas9 para as células. Com uma capacidade de mediar a edição de gene rápido e robusto nas células, IDLVs apresentar um mais seguro e plataforma de vector igualmente eficazes para a entrega do gene comparado com vetores integrase-competentes.
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Artigo de método
Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células
Neste artigo
Resumo
Resumo
Particulas de Lentivirus vetores são uma escolha ideal para a entrega de componentes de edição de gene de células devido à sua capacidade para estàvel transducing uma ampla variedade de células e mediando a altos níveis de expressão gênica. No entanto, sua capacidade de integrar o genoma celular do hospedeiro aumenta o risco de mutagenicidade insercional e assim gera preocupações de segurança e limita o seu uso em situações clínicas. Além disso, a expressão persistente de gene-editando componentes entregues por estes aumentos de integração-competente Lentivirus vetores (ICLVs) a probabilidade de promíscuo gene alvejar. Como alternativa, foi desenvolvida uma nova geração de vetores de Lentivirus integrase deficiente (IDLVs) que aborda muitas dessas preocupações. Aqui o protocolo de produção de uma nova e melhorada plataforma IDLV para edição de genes mediada por CRISPR e lista as etapas envolvidas na purificação e concentração de tais vetores é descrita e sua transdução e gene-edição eficiência usando HEK-293T demonstrou-se células. Este protocolo é facilmente escalável e pode ser usado para gerar IDLVs foram capazes de transducing células in vitro e in vivo. Além disso, este protocolo pode ser facilmente adaptado para a produção de ICLVs.
Introdução
Edição de gene preciso constitui a pedra angular das grandes avanços biomédicos que envolvem o desenvolvimento de novas estratégias para combater doenças genéticas. Na vanguarda das tecnologias de edição de gene é o método baseando-se no uso do cabrilhantado regularly -eunterspaced short palindromic repeats (CRISPR) / sistema de Cas9 que foi inicialmente identificado como um componente da imunidade bacteriana contra a invasão de material genético viral (revisto em referências1,2). Uma grande vantagem do sistema CRISPR/Cas9 sobre outras ferramentas de edição....
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Protocolo
1. cultivo de células HEK-293T e propagação de células para transfeccao
Nota: Rim embrionário humano 293T (HEK-293T) as células são cultivadas em DMEM, mídia de alta glicose suplementada com soro 10% bezerro suplementado com promotores de crescimento e de ferro e 1 x solução de antibiótico antimicótico (100 x de solução contém 10.000 penicilina unidades estreptomicina 10 mg e 25 µ g anfotericina B por mL). A mídia também é complementada com piruvato de sódio 1 x, 1 x mix de aminoácidos não-essenciais e 2 mM L-glutamina (dipeptídeo de estoque 200 mM L-alanil-L-glutamina em 0,85% NaCl). As células são cultivadas em placas de cultura de tecidos ....
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Resultados
Validação da nocaute-eficiência dos vetores de IDLV-CRISPR/Cas9
Usamos as células GFP-expressando 293T como um modelo para validar a eficiência de nocaute de gene CRISPR/Cas9-mediada. Células GFP + foram geradas pela transdução de células HEK-293T com pLenti-GFP (vBK201a) em um MOI de 0.5 (Figura 3b, painel de "no-virus"). A fita de sgRNA-para-GFP/Cas9 tudo-em-um vetor foi empacotada em partículas IDLV ou ICLV e a eficiência da produção fo.......
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Discussão
IDLVs começaram a emergir como o veículo de escolha para na vivo gene-edição, especialmente no contexto de doenças genéticas, devido em grande parte para o baixo risco de mutagênese associado a estes vetores, em comparação com a integração de plataformas de entrega22 , 28. no manuscrito atual, nós procuramos detalhar o protocolo associado com a produção do sistema melhorada para a IDLV-CRISPR/Cas9 tudo-em-um que foi recentemente desenvolvido em nosso lab.......
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Divulgações
Patente da USC-499-P (1175) foi arquivado pela Universidade da Carolina do Sul em relação ao trabalho descrito neste manuscrito.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer o departamento de neurobiologia, Duke University School of Medicine e gabinete do reitor para a ciência básica, Duke University. Agradecemos também a membros do núcleo do vetor Viral Duke para comentários sobre o manuscrito. Plasmídeo pLenti CRISPRv2 foi presente do Feng Zhang (Broad Institute). O sistema de LV-embalagem, incluindo o psPAX2 de plasmídeos, VSV-G, pMD2.G e pRSV-Rev foi um presente tipo de Didier Trono (EPFL, Suíça). Apoio financeiro para este trabalho foi fornecido pela Universidade de Carolina do Sul escola de medicina, conceda RDF18080-E202 (Rafaella).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
| Centrífuga de mesa Allegra 25R | Beckman Coulter | 369434 | |
| xMark Microplate Leitor de placas de absorbância | Bio-Rad | 1681150 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Microscópio de fluorescência invertida | Leica | DM IRB2 | |
| 0.45-μ m unidade de filtro, 500mL | Corning | 430773 | |
| Tubos de ultracentrifugação de fundo cônico | Seton Scientific | 5067 | |
| Adaptadores de tubo cônico | Seton Scientific | PN 4230 | |
| SW32Ti rotor de caçamba oscilante | Beckman Coulter | 369650 | |
| 15 mL tubos de centrífuga cônicos | Corning | 430791 | |
| 50mL cônicos tubos de centrífuga | Corning | 430291 | |
| placas de 96 poços de alta ligação | Corning | 3366 | |
| Placas de cultura de células tratadas com TC de 150 mm com grade de 20 mm | Placa de cultura tratada com 353025 | ||
| de 100 mm | Corning | 430167 | |
| 0,22 μ Unidade de filtro M, 1L | Corning | 430513 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Pipetas de cultura de tecidos, 5 mL | Corning | 4487 | |
| Pipetas de cultura de tecidos, 10 mL | Corning | 4488 | |
| Pipetas de cultura de tecidos, 25 mL | Corning | 4489 | |
| Hemacitômetro com lamínulas | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Reagentes de cultura de células | |||
| Rim embrionário humano 293T (HEK 293T) células | |||
| 293FT | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| DMEM, meio de alta glicose | Gibco | 11965 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| Solução antibiótica, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| Piruvato de sódio | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| Aminoácido não essencial (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| RPMI 1640 mídia | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Tripsina-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| BES (N, N-bis (ácido 2-hidroxietil) -2-amino-etanossulfônico) | Sigma Aldrich | B9879 - Gelatina BES | |
| Sigma Aldrich | G1800-100G | ||
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| p24 Reagentes ELISA | |||
| Monoclonal anti-p24 anticorpo | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Padrões de HIV-1 | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Policlonal coelho anti-p24 anticorpo | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| Goat anti-rabbit horseradish peroxidase | IgG Sigma Aldrich | 12-348 | Concentração de trabalho 1:1500 |
| Soro de camundongo normal, Estéril, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Soro de cabra, Estéril, 10mL | Sigma | G9023 | Concentração de trabalho 1:1000 |
| Substrato de peroxidase TMB | KPL | 5120-0076 | Concentração de trabalho 1:10.000 |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Plasmídeos | |||
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| lentiCRISPR v2 | Addgene | 52961 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Enzimas de restrição | |||
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
Referências
- Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nat Rev Genet. 11 (3), 1....
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Reimpressões e permissões
