Este protocolo descreve como estabelecer um sistema de cultura de enteroid de rato neonatal ou intestino humano prematuro, bem como um método eficiente para coletar leite de ratos.
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Artigo de método
O leite materno aumenta o crescimento de Enteroids: um modelo Ex Vivo da proliferação celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
Enteroids intestinais pequenos humanos derivam das criptas e quando cultivadas em um nicho de células-tronco contêm todos os tipos de células epiteliais. A capacidade de estabelecer sistemas de enteroid humana ex vivo cultura são importantes fisiopatologia intestinal modelo e estudar a resposta celular particular envolvido. Nos últimos anos, enteroids de camundongos e humanos estão sendo cultivadas, passadas e bancados afastado para uso futuro em vários laboratórios em todo o mundo. Esta plataforma de enteroid pode ser usada para testar os efeitos de vários tratamentos e drogas e os efeitos que são exercidos sobre diferentes tipos de células no intestino. Aqui, um protocolo para o estabelecimento principal células-tronco derivadas pequeno intestinal enteroids derivado de ratos Neonatais e intestino humano prematuro é fornecido. Além disso, este sistema de cultura de enteroid foi utilizado para testar os efeitos do leite materno espécie-específicos. O leite materno do mouse pode ser obtido com eficiência usando uma bomba de mama humano modificado e leite expressa do mouse pode ser usado para mais experiências de pesquisa. Podemos agora demonstrar os efeitos de mouse expressado, humano, e o leite materno doador sobre o crescimento e a proliferação de enteroids derivado de ratos neonatais ou prematuro intestino humano.
Introdução
Enterocolite necrosante (NEC) é a principal causa de morte por doença gastrintestinal em recém-nascidos prematuros, afetando quase 1 em cada 10 bebés nascidos antes de 29 semanas de gestação,1,2,3. Metade dos infantes com o progresso da NEC para a forma mais grave, onde a sobrevivência é apenas 10-30%4,5. Nos Estados Unidos, uma estimativa de USD 2 bilhões por ano são gastos para tratamento de lactentes com NEC6,7, no entanto, a taxa de sobrevivência, nem tera....
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Protocolo
Todos os procedimentos de animais neste estudo foram aprovados pelo também da Universidade de Washington em St. Louis institucional Animal cuidados uso Comité (protocolo 20160187) ou cuidados animais institucionais da Universidade de Pittsburgh e Comissão de utilização (protocolo 14103918). Humano intestino fetal em menos de 24 semanas de gestação foi obtido em conformidade com as diretrizes de aquisição de tecido anatômico Universidade de Pittsburgh após aprovação do Conselho de revisão institucional (protocolo PRO14100537) da Universidade de Pittsburgh saúde ciências banco de tecidos através de um sistema de corretor honesto. Leite materno de identificados ou o leit....
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Resultados
Primeiro procuramos investigar se expressou o leite materno ou leite pasteurizado doador teve um efeito na pequena enteroids intestinal. Na verdade, leite materno e leite materno de doadores aumentaram o crescimento de prematuro humana derivada enteroids (figura 1B) e rato neonatal (figura 1A).
Desde que o leite materno humano aumentou o crescimento de pequenas enteroid.......
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Discussão
O epitélio intestinal é composto de muitos subtipos celulares que são responsáveis por fornecer a defesa do hospedeiro contra patógenos, mantendo a integridade de barreira do intestino e podem ser rompidos na patogênese de diversas doenças. Enquanto modelos animais podem recapitular algumas facetas da doença, o modelo ex vivo de enteroids derivado do intestino de ratos e humanos fornece uma plataforma para testar os efeitos de vários tratamentos. A importância do modelo de enteroid permite que os pesquisadores d.......
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Divulgações
Os autores têm nada para divulgar e sem conflitos de interesse.
Agradecimentos
MG é apoiada por subsídios, K08DK101608 e R03DK111473 do Hospital o National Institutes of Health, março de Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-79, das crianças Discovery Institute de Washington University e St. Louis infantil e departamento de Pediatria Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL é suportado pelo R01DK104946 (PI: Silverman), Hospital Discovery Institute de Washington University infantil e St. Louis infantil.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/L de Glicose e L-Glutamina | Lonza | 12-604F | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulina) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco ( DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicina | Gibco | 15750-060 | |
| Anfotericina B | Gibco | 15290-026 | |
| 0,5 M Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8,0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM / F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamina | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hidroxietilpiperazina-N-2-Etano Ácido Sulfônico (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetilcisteína | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Suplemento | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Suplemento Menos Vitamina A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x Inibidor de ROCK Y-27632, Dicloridrato | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Camundongo Recombinante Wnt3a Proteína | R& D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Mouse Recombinante R-Spondin 1 | R& D Systems | 3474-RS | |
| Fator de Crescimento Epidérmico Murino Recombinante (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Fator de Crescimento Matriz de Membrana Basal Reduzida | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Placa de Petri de Cultura de Células | Eppendorf | 0030700112 | |
| de Cultura de Células de 24 Poços | Eppendorf | 0030722116 | |
| Célula de 48 Poços Placa de Cultura | Eppendorf | 0030723112 | |
| Sistema de Deslizamento de Câmara Nunc Lab-Tek II de 8 Poços | Thermo Scientific | 154534 | |
| Tubo Cônico de 50 mL | Corning | 352070 | |
| 100 μ M Filtro de Células Estéreis | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μ Filtro de Células Estéreis M | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldeído (PFA)Ciências de | Microscopia Eletrônica | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Burro Normal Soro (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Vidro de Cobertura do Microscópio | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Microscópio Confocal Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G Agulha de 1,5 Polegada | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurano | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxitocina | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Lansinoh | 044677530163 | ||
| Tubo de Ensaio de Fundo Redondo de 5 mL | Rolhas de Borracha 352058 | ||
| Frey | Scientific 560761 | ||
| Ki67 Anticorpo | Abcam | AB15580 | |
| Humano Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'Integrated | DNA Technologies | N/A |
Referências
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence? Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts i....
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Reimpressões e permissões
