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Artigo de método

O leite materno aumenta o crescimento de Enteroids: um modelo Ex Vivo da proliferação celular

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DOI:

10.3791/56921

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15 de fevereiro de 2018

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1Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine, 2Washington University, 3Division of Newborn Medicine, Department of Pediatrics, University of Pittsburgh School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve como estabelecer um sistema de cultura de enteroid de rato neonatal ou intestino humano prematuro, bem como um método eficiente para coletar leite de ratos.

Resumo

Enteroids intestinais pequenos humanos derivam das criptas e quando cultivadas em um nicho de células-tronco contêm todos os tipos de células epiteliais. A capacidade de estabelecer sistemas de enteroid humana ex vivo cultura são importantes fisiopatologia intestinal modelo e estudar a resposta celular particular envolvido. Nos últimos anos, enteroids de camundongos e humanos estão sendo cultivadas, passadas e bancados afastado para uso futuro em vários laboratórios em todo o mundo. Esta plataforma de enteroid pode ser usada para testar os efeitos de vários tratamentos e drogas e os efeitos que são exercidos sobre diferentes tipos de células no intestino. Aqui, um protocolo para o estabelecimento principal células-tronco derivadas pequeno intestinal enteroids derivado de ratos Neonatais e intestino humano prematuro é fornecido. Além disso, este sistema de cultura de enteroid foi utilizado para testar os efeitos do leite materno espécie-específicos. O leite materno do mouse pode ser obtido com eficiência usando uma bomba de mama humano modificado e leite expressa do mouse pode ser usado para mais experiências de pesquisa. Podemos agora demonstrar os efeitos de mouse expressado, humano, e o leite materno doador sobre o crescimento e a proliferação de enteroids derivado de ratos neonatais ou prematuro intestino humano.

Introdução

Enterocolite necrosante (NEC) é a principal causa de morte por doença gastrintestinal em recém-nascidos prematuros, afetando quase 1 em cada 10 bebés nascidos antes de 29 semanas de gestação,1,2,3. Metade dos infantes com o progresso da NEC para a forma mais grave, onde a sobrevivência é apenas 10-30%4,5. Nos Estados Unidos, uma estimativa de USD 2 bilhões por ano são gastos para tratamento de lactentes com NEC6,7, no entanto, a taxa de sobrevivência, nem terapia tem mudado ao longo dos últimos 30 anos. A patogênese da NEC é caracterizada por lesões intestinais e deficientes auditivos da mucosa cura8,9,10,11, no entanto, as vias de sinalização levando a uma exacerbada resposta inflamatória e mecanismos para reverter a inflamação permanecem incompletamente compreendidos.

A administração de leite materno foi encontrada para ser a estratégia apenas proteção contra NEC para prematuros. Mostramos anteriormente que o leite materno protege contra o desenvolvimento da NEC através da inibição do receptor tipo toll receptor imune inata 4 (TLR4) no epitélio intestinal através do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) sinalização via11. Suplementação do leite materno para uma fórmula de NEC experimental atenuado a resposta inflamatória, vista no NEC, como demonstrado por inibição da apoptose enterócito e restauração do enterócito proliferação de uma forma que era dependente de crescimento epidérmico factor (EGF) e EGFR11. Em outro estudo, foi demonstrado que o nitrato, outro componente do leite materno, contribui para sua natureza protetora, modulando a perfusão intestinal, em comparação com a fórmula infantil, que é desprovido de nitrato e pode contribuir para o aumento da frequência do NEC em Fórmula alimentados infantes12,13. Outros compostos presentes no leite materno que foram mostrados para ser envolvido na proteção contra NEC incluem oligossacarídeos do leite humano, L-arginina, glutamina e lactoferrina14,15,16, 17,18,19. Estes elementos benéficos do leite materno revelam a necessidade de seu uso na prevenção da NEC, mas também salientam a importância de se estudar os mecanismos, sinalização de caminhos e efeitos celulares envolveram em como o leite materno é mediar a proteção contra NEC .

Em ordem para um estudo mais aprofundado as propriedades protetoras do leite materno em um modelo do rato da NEC, desenvolvemos uma técnica de novela, fácil de usar por que mouse leite materno pode ser extraído de uma barragem anestesiada usando um elétrico materno bomba11,12 . Esta estratégia de aquisição de leite materno de rato é vantajosa, não só porque as bombas de mama humano são prontamente disponível e eficiente na aquisição de leite materno, mas também porque este método permite análises de leite materno espécie-específicos. Como resultado, nós podemos comparar os efeitos do leite materno de rato com os do leite materno humano bem como pasteurizado o leite humano doador de um banco de leite em modelos espécie-específicos. Esta técnica permite o estudo dos componentes do leite materno em relação à sua contribuição para a prevenção da NEC. Outros investigadores têm desenvolvido métodos de extração de leite materno, no entanto, essas técnicas são manuais e geralmente exigem mais do que um laboratório membro20,21,22. Aqui apresenta-se uma técnica fácil que pode ser utilizada, modificando uma bombinha elétrica humana para coletar leite de um rato. Esta técnica também pode ser aplicada a outras espécies.

Para interrogar adequadamente as vias de sinalização envolvidas com NEC, sistemas modelo são necessários para avaliar todos os tipos de célula diferente, conhecidos por ser afetados no processo de doença. Aqui, vamos discutir um tal sistema de modelo - enteroids - e o seu estabelecimento de rato e o intestino delgado humano. Enteroids intestinais humanas (HIEs), em particular, fornecer promessa significativa, porque eles oferecem um inovador, geneticamente diversos ex vivo modelo humano para auxiliar no estudo de processos fisiopatológicos que ocorrem no trato gastrointestinal 23. Enteroids foram encontrados para ser cultivadas a longo prazo e pode ser congelados para posterior utilização23, e ao contrário de Organoids Intestinal humana (HIOs), cujas culturas são desenvolvidas a partir de células-tronco pluripotentes inducible, enteroids são gerados a partir de células-tronco dentro de criptas intestinais isoladas24. Enteroids exigem menos manutenção, pode ser infectado rapidamente25e pode ser facilmente estabelecido desde criptas intestinais são mais diferenciadas que HIOs23. Portanto, HIEs oferecem muitas vantagens sobre as técnicas existentes, porque eles podem ser desenvolvidos para exibem propriedades de composição e funcionais específicas da região o epitélio gastrointestinal humano23. O uso de enteroids é uma opção altamente eficaz quando precisar de um modelo humano do intestino, com aderência às limitações específicas da região e a facilidade de uso. Aqui vamos demonstrar a técnica de isolar e manutenção primária células-tronco derivadas pequeno intestinal enteroids de camundongos e humanos prematuros.

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Protocolo

Todos os procedimentos de animais neste estudo foram aprovados pelo também da Universidade de Washington em St. Louis institucional Animal cuidados uso Comité (protocolo 20160187) ou cuidados animais institucionais da Universidade de Pittsburgh e Comissão de utilização (protocolo 14103918). Humano intestino fetal em menos de 24 semanas de gestação foi obtido em conformidade com as diretrizes de aquisição de tecido anatômico Universidade de Pittsburgh após aprovação do Conselho de revisão institucional (protocolo PRO14100537) da Universidade de Pittsburgh saúde ciências banco de tecidos através de um sistema de corretor honesto. Leite materno de identificados ou o leite materno pasteurizado doador foi obtido com uma dispensa de consentimento da Universidade de Pittsburgh Conselho de revisão institucional.

1. a cripta isolamento e estabelecimento de Enteroids de ratos Neonatal ou prematuro intestino humano

  1. Preparação de meios de comunicação
    Nota: Mídia deve ser preparada no bairro no dia anterior o isolamento da cripta.
    1. Prepare meios de cultura 1,11 L. Começar com 1 L médio modificado águia de Dulbecco (DMEM) com glicose de 4,5 g/L e L-glutamina e adicionar 110 mL soro Fetal bovino (FBS) (10% de concentração final), 11 mL penicilina-estreptomicina (concentração final 1%) e 1,1 mL insulina estéril (final concentração 0,1%).
    2. Prepare a mistura de 500 mL de PBS-antibiótico. Começar com 500 mL 1 x fosfato salino de Dulbecco (DPBS) com 10% FBS e adicionar 5 mL de gentamicina (concentração final 1%), 1 mL de anfotericina B (0,2% de concentração final) e 5 mL de penicilina-estreptomicina (concentração final 1%).
    3. Prepare 30 mL célula rompimento Media #1. Primeiro prepare 30 mL de meio de cultura. Adicionar 600 µ l 0,5 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (concentração final 10 mM), 300 µ l gentamicina (concentração final 1%) e 60 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final).
    4. Prepare 30 mL célula rompimento Media #2. Primeiro prepare 30 mL de meio de cultura. Adicionar 300 µ l EDTA de 0,5 M (concentração final 5 mM), 300 µ l gentamicina (concentração final 1%) e 60 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final).
    5. Prepare meios de cultura de cripta 50ml sem fatores de crescimento. Medir a 33,4 mL 1 x Advanced DMEM/F-12 e adicionar 10 mL FBS (20% de concentração final).
      1. Adicionar 500 µ l penicilina-estreptomicina (concentração final 1%), 500 µ l L-glutamina (concentração final 1%), 500 µ l 100 µ l de anfotericina B (0,2% de concentração final), gentamicina (concentração final 1%), 2,5 µ l 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane ácido sulfônico (HEPES) (concentração final 0,05 mM), 500 µ l 100 mM N-acetilcisteína (concentração final 1 mM), 500 µ l 100 x N-2 suplemento, 1 mL 50 x suplemento isento de soro (por exemplo, B-27) menos vitamina A e 500 µ l 1 mM 100 x Y-27632.
    6. Prepare meios de cultura de cripta de 1 mL com fatores de crescimento. Primeiro Prepare-se 1 mL da cripta meios de cultura sem fatores de crescimento. Adicionar 2,5 µ l 40 µ g/mL Wnt3a (concentração final de 100 ng/mL), 1 µ l 100 µ g/mL Noggin (concentração final de 100 ng/mL), 2 µ l 250 µ g/mL R-Spondin (concentração final 500 ng/mL) e 0,5 µ l 100 µ g/mL EGF (concentração final de 50 ng/mL).
  2. Isolamento da cripta
    1. Lugar solubilizado extrato de membrana basal (ver Tabela de materiais) no gelo para descongelar antes de começar.
      Nota: Mantenha membrana basal em gelo ou irá polimerizar.
    2. Em conformidade com o protocolo institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização para os ratos maiores que 14 dias de idade, eutanásia em ratos com dois métodos de eutanásia com o segundo sendo um processo físico para velar a morte.
      Nota: Para os ratos menos de 14 dias de idade, decapitação é o procedimento padrão, usando a tesoura.
    3. Usando uma tesoura e pinça, faça uma incisão vertical para baixo da linha média do abdômen, através da pele e peritônio, para todo o comprimento do abdômen. Excisar o intestino do estômago ao ceco com tesoura e remover o mesentério com fórceps.
      Nota: Duas semanas de idade masculinos e femininos C57BL/6J rato filhotes, cada pesagem g 5.5-7, foram utilizados para isolamento de cripta. Qualquer idade ou tamanho do mouse pode ser usado para a isolação de cripta.
    4. Para preparar o intestino recém-colhidas para isolamento de cripta, posicione o intestino reto e corte o intestino longitudinalmente ao longo de toda a sua extensão com uma tesoura.
      Nota: Mouse e intestino humano podem ser preparados da mesma forma.
    5. Limpa fezes do intestino, agitando suavemente o intestino e para trás em um prato de Petri cheia de PBS-antibiótico mistura usando fórceps.
    6. Adicione 30 mL de célula rompimento Media #1 para um tubo cónico de 50 mL. Corte o intestino em pedaços de comprimento 0,5 cm diretamente no tubo. Definir o tubo em um balde de gelo e agitar suavemente agitador na velocidade mais baixa por 15 min.
    7. Enquanto os tecidos são o agitador, obter placas de 24 ou 48-boas para crescer criptas se o enteroids está a ser usado para o isolamento de proteínas, DNA ou RNA. Slides de câmara de 8 poços uso crescer criptas se o enteroids está a ser usado para toda a montam imagem latente confocal.
    8. No capô, adicione 15 µ l de membrana basal para o fundo de cada poço da placa de 24 ou 48-bem. Se usando slides câmara, adicione 9 µ l da membrana basal à parte inferior de cada câmara.
      Nota: Ajuste de volume da membrana basal de acordo com o tamanho da placa se necessário.
    9. Espalhou-se rapidamente a membrana basal com a ponta da pipeta para que a membrana basal forma uma camada fina no fundo do poço. Coloque a placa a 37 ° C numa incubadora por 30 min permitir que a membrana basal polimerizar.
      Nota: As criptas não irão anexar se membrana basal não é uma fina camada ou membrana basal contém bolhas de ar.
    10. Depois de 15 min em uma coqueteleira, filtre o tecido através de um filtro de 100 µm. Descarte a fluir.
    11. Adicione 30 mL de célula rompimento Media #2 para um novo tubo cónico de 50 mL. Remover tecido do filtro e adicionar ao tubo.
    12. Definir o tubo em um balde de gelo e agitar suavemente agitador na velocidade mais baixa por 15 min.
    13. Depois de 15 min no agitador, filtro tecido através de um filtro de 100 µm. Manter o fluxo através da este passo, no caso de rendimento é baixo em etapas posteriores.
      Nota: Todo o fluxo através de tubos deve ser mantido no gelo.
    14. Adicione 15 mL DMEM com glicose de 4,5 g/L e L-glutamina para um novo tubo cónico de 50 mL. Remover tecido do filtro e adicionar ao tubo. Agitar o tubo com a mão para 10 filtro s. através de um filtro de 100 µm e coletar o fluxo através de vigorosamente. Repita até que flua através de contém sem partículas.
    15. No capô, filtre o fluxo através da etapa anterior em um novo tubo cônico de 50 mL usando 70 µm de filtros para tecido de rato ou 100 µm filtros de tecido humano.
      Nota: Têm filtros extras no modo de espera e despeje lentamente como filtros vão entupir com detritos.
    16. Centrifugar o tubo a x 200 g por 8 min a 4 ° C e lugar diretamente em um balde de gelo no bairro. Remova o sobrenadante com uma pipeta sem perturbar o sedimento. Resuspenda o pellet com total quantidade desejada de cripta meios de cultura sem fatores de crescimento.
      Nota: As criptas enriquecidas são a camada 'areia' da pelota. Bem, cada um exige 250 µ l de cripta meios de cultura sem fatores de crescimento.
  3. Estabelecimento de enteroids
    1. A mistura de mídia cripta directamente sobre a membrana basal da placa.
    2. Verifique criptas com um microscópio para garantir o processo de isolamento foi bem-sucedido.
      Nota: As células e bolas de células são desejadas. Aproximadamente 100 criptas individuais são banhadas por bem.
    3. Incube a placa a 37 ° C por 3 h permitir criptas de aderir a membrana basal.
      Nota: Esta incubação é com cripta meios de cultura sem fatores de crescimento.
    4. Remova lentamente a mídia e criptas em excesso que falharam ao conectar usando uma pipeta de P-200.
      Nota: Não perturbe a membrana basal como criptas anexadas podem tornar-se desalojado.
    5. Lentamente, adicione 250 µ l de cripta meios de cultura com fatores de crescimento para cada poço.
      Nota: Para 24-, 48-bem placas, ou câmara desliza, 250 µ l de cripta meios de cultura com fatores de crescimento é suficiente.
    6. Substitua os meios de comunicação a cada 2 dias com fresco cripta meios de cultura com fatores de crescimento durante 5 dias antes de tratamentos para permitir o crescimento e o acessório ideal.

2. Mouse recolha de leite materno

  1. Separe uma barragem de C57BL/6J lactante no pós-parto 7-12 dias seus filhotes para 6 h antes da ordenha.
  2. Anestesiar a barragem lactante com isoflurano através de um cone de nariz e administrar uma injeção subcutânea de ocitocina em 0,15 UI/kg de peso. Espere 3 minutos antes de tentar o procedimento de ordenha.
  3. Limpar os tetos com etanol a 70% antes do procedimento de ordenha e deixe secar.
  4. Extrai leite de tetinas, um de cada vez usando uma bomba de mama humano elétrico com tubo de silicone de tamanho para caber as tetinas de rato em um tubo de coleta de 5 mL.
    Nota: As bombas de mama ideal tem duas configurações, um para a velocidade e outro para a sucção. É melhor começar com o menor configurações de cada um e aumentar ambos lentamente até leite é extraído. Idealmente, o rendimento total será ~ 500 µ l - 1 mL de leite materno de rato por barragem lactante.
  5. O leite materno imediatamente alíquota e loja a-80 ° C.
    Nota: Evite congelar/descongelar ciclos.
  6. Tratar enteroids no dia 5 com 50 µ l/mL de leite materno de rato por mL de meio de cultura de cripta com fatores de crescimento por 24 h a 37 ° C.

3. toda montagem coloração de Enteroids

  1. Preparação dos reagentes
    1. Prepare-se 16 mL 1X PBS por 8 poços.
    2. Prepare o paraformaldeído 4% de 2 mL (PFA) em 1X PBS por 8 poços.
    3. Prepare-se 2 mL 0,1% Triton X-100 em PBS 1x por 8 poços.
    4. Preparar 24 mL PBS Tween (PBST é 0.1% Tween 20 em 1X PBS) por 8 poços.
    5. Preparar o soro de burro normal de 10% 2 mL (NDS) em 0,1% PBST (10% NDS/PBST) por 8 poços.
    6. Preparar 4 mL 1% NDS em 0,1% PBST (1% NDS/PBST) por 8 poços.
  2. Dia 1 de coloração
    1. Aspire o tratamentos e lavar enteroids com PBS. Adicionar 250 µ l 4% PFA por bem. Coloque no rotator para 1-2 h a 4 ° C. Remover 4% PFA com pipeta.
    2. Lave 4 vezes com 250 µ l/poço 1 x PBS. Coloque no rotator durante 10 minutos à temperatura ambiente (RT).
      Nota: É possível armazenar a placa por 1-2 dias a 4 ° C, se necessário.
    3. Adicionar 250 µ l/poço 0.1% Triton X-100. Incubar durante 1 h em RT. Remove 0,1% Triton X-100 com pipeta.
    4. Lave 4 vezes com 250 µ l/poço 1 x PBS. Coloque no rotador por 15 min no RT
    5. Adicionar 250 µ l/poço 10% NDS/PBST. Incubar durante 45 min no RT. Remove 10% NDS/PBST com pipeta.
    6. Adicionar 250 µ l/poço primário anticorpo, 1/250 diluídos em 1% NDS/PBST e incubar durante a noite a 4 ° C.
      Nota: A diluição de anticorpo ideal varia de acordo com o fabricante.
  3. Dia 2 de coloração
    1. Lave pelo menos 5 vezes para 4-5 h com 250 µ l/poço PBST. Coloque no rotator a 4 ° C entre cada lavagem.
    2. Adicione 250 µ l/poço secundário anticorpo, diluído 1/1.000 em 1% NDS/PBST. Embrulhe o prato em folha e incubar durante a noite a 4 ° C.
  4. Dia 3 de coloração
    1. Adicione 250 µ l/poço nuclear mancha 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) por 15 min.
      Nota: Manter a placa no escuro.
    2. Lavar 6 vezes com 250 µ l/poço PBST. Coloque no rotator durante 10 minutos a 4 ° C entre cada lavagem.
    3. Monte lamela na câmara deslize com meios de montagem.
    4. Captar imagens com um microscópio confocal objetivo de 40x e igualmente processar em um editor de gráficos raster (ver Tabela de materiais).

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Resultados

Primeiro procuramos investigar se expressou o leite materno ou leite pasteurizado doador teve um efeito na pequena enteroids intestinal. Na verdade, leite materno e leite materno de doadores aumentaram o crescimento de prematuro humana derivada enteroids (figura 1B) e rato neonatal (figura 1A).

Desde que o leite materno humano aumentou o crescimento de pequenas enteroid...

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Discussão

O epitélio intestinal é composto de muitos subtipos celulares que são responsáveis por fornecer a defesa do hospedeiro contra patógenos, mantendo a integridade de barreira do intestino e podem ser rompidos na patogênese de diversas doenças. Enquanto modelos animais podem recapitular algumas facetas da doença, o modelo ex vivo de enteroids derivado do intestino de ratos e humanos fornece uma plataforma para testar os efeitos de vários tratamentos. A importância do modelo de enteroid permite que os pesquisadores d...

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Divulgações

Os autores têm nada para divulgar e sem conflitos de interesse.

Agradecimentos

MG é apoiada por subsídios, K08DK101608 e R03DK111473 do Hospital o National Institutes of Health, março de Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-79, das crianças Discovery Institute de Washington University e St. Louis infantil e departamento de Pediatria Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL é suportado pelo R01DK104946 (PI: Silverman), Hospital Discovery Institute de Washington University infantil e St. Louis infantil.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) com 4,5 g/L de Glicose e L-GlutaminaLonza12-604F
Soro Fetal Bovino (FBS)Gibco26140-079
Penicilina-EstreptomicinaGibco15140-122
Humulin N (Insulina)Eli Lilly And Company0002-8315
1x Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco ( DPBS)Sigma-AldrichD8537
GentamicinaGibco15750-060
Anfotericina BGibco15290-026
0,5 M Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8,0Invitrogen15575-020
1x Advanced DMEM / F-12Invitrogen12634-028
200 mM L-GlutaminaGibco25030-081
1 M N-2-Hidroxietilpiperazina-N-2-Etano Ácido Sulfônico (HEPES)Sigma-AldrichH3537
N-AcetilcisteínaSigma-AldrichA9165
100x N-2 SuplementoGibco17502-048
50x B-27 Suplemento Menos Vitamina AGibco08-0085SA
100x Inibidor de ROCK Y-27632, DicloridratoSigma-AldrichY0503
Camundongo Recombinante Wnt3a ProteínaR& D Systems1324-WN
Murine NogginPeproTech250-38
Mouse Recombinante R-Spondin 1R& D Systems3474-RS
Fator de Crescimento Epidérmico Murino Recombinante (EGF)PeproTech315-09
Matrigel Fator de Crescimento Matriz de Membrana Basal ReduzidaCorning356231
35 x 10 mm Placa de Petri de Cultura de CélulasEppendorf0030700112
de Cultura de Células de 24 PoçosEppendorf0030722116
Célula de 48 Poços Placa de CulturaEppendorf0030723112
Sistema de Deslizamento de Câmara Nunc Lab-Tek II de 8 PoçosThermo Scientific154534
Tubo Cônico de 50 mLCorning352070
100 μ M Filtro de Células EstéreisFisher Scientific22-363-549
70 μ Filtro de Células Estéreis MFisher Scientific22-363-548
1x Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7.2Invitrogen20012-027
16% Paraformaldeído (PFA)Ciências deMicroscopia Eletrônica15710
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Burro Normal Soro (NDS)Sigma-AldrichD9663
4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato (DAPI)InvitrogenD1306
Vidro de Cobertura do MicroscópioFisher Scientific12-544-D
Microscópio Confocal Leica TCS SP8 XLeica MicrosystemsN/A
Photoshop CS6Adobe SystemsN/A
18 G Agulha de 1,5 PolegadaBecton Dickinson305196
IsofluranoSigma-Aldrich792632
OxitocinaSigma-AldrichO3251
Lansinoh044677530163
Tubo de Ensaio de Fundo Redondo de 5 mLRolhas de Borracha 352058
FreyScientific 560761
Ki67 AnticorpoAbcamAB15580
Humano Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A
Placa Bomba de Mama Elétrica Dupla Humana Corning

Referências

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