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Chemistry

क्लिक रसायन विज्ञान के साथ पौधों में Lignification गतिशीलता visualizing: दोहरी लेबलिंग आनंद है!

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56947
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1UGSF – Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, CNRS, UMR 8576, Université de Lille

Summary

आनंद, lignification गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक दोहरी लेबलिंग प्रोटोकॉल विकसित किया गया था । सिंथेटिक monolignol पत्रकारों और SPAAC और CuAAC bioorthogonal क्लिक करें प्रतिक्रियाओं का एक अनुक्रमिक संयोजन का उपयोग करना, इस पद्धति के लिए कारक है कि lignins मेंplanta की उत्पत्ति को विनियमित के गहराई से विश्लेषण करने के लिए मार्ग प्रशस्त ।

Abstract

लिग्निन ग्रह और lignocellulosic बायोमास का एक प्रमुख घटक पर सबसे प्रचलित के एक पॉलिमर है । इस phenolic बहुलक विकास और उच्च पौधों के जीवन में एक महत्वपूर्ण संरचनात्मक और सुरक्षात्मक भूमिका निभाता है । हालांकि जटिल vivo में lignification प्रक्रियाओं को विनियमित तंत्र दृढ़ता से कई संयंत्र व्युत्पंन उत्पादों के औद्योगिक valorization प्रभाव, वैज्ञानिक समुदाय अभी भी एक लंबा रास्ता तय करने के लिए उंहें समझने जाना है । एक साधारण तीन कदम कार्यप्रवाह में, दोहरी लेबलिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत इस के साथ साथ संयंत्र के ऊतकों के सक्रिय रूप से lignifying क्षेत्रों के लिए सक्षम बनाता है । पहला कदम दो स्वतंत्र रासायनिक पत्रकारों, दो देशी monolignols कि लिग्निन एच और जी इकाइयों को जंम देने के किराए के चयापचय निगमन में होते हैं । लिग्निन पॉलिमर बढ़ती में शामिल करने के बाद, प्रत्येक रिपोर्टर तो विशेष रूप से bioorthogonal SPAAC/CuAAC क्लिक प्रतिक्रियाओं के एक अनुक्रमिक संयोजन के माध्यम से अपनी फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल है । लिग्निन autofluorescence के साथ संयुक्त, इस दृष्टिकोण तीन की पीढ़ी की ओर जाता है-रंग संयंत्र सेल दीवारों के भीतर लिग्निन के स्थानीयकरण के नक्शे फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा और उपस्थिति या अनुपस्थिति पर सटीक स्थानिक जानकारी प्रदान करता है सक्रिय संयंत्र के ऊतकों, कोशिकाओं और अलग सेल दीवार परतों के पैमाने पर lignification मशीनरी ।

Introduction

पिछले दो दशकों में, रासायनिक रिपोर्टर रणनीति के रूप में एक शक्तिशाली दो कदम पद्धति के रूप में उभरा है गैर आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग जैव अणुओं की गतिशीलता और कार्यों की जांच । 1 , 2 , 3 इस रणनीति में एक छोटे मॉडुलन के साथ ब्याज की जैव अणु के एक सिंथेटिक एनालॉग- केमिकल रिपोर्ट र-पहले जीवित जीव द्वारा metabolized है, और फिर एक रासायनिक जांच (जैसे, प्रतिदीप्ति के लिए एक fluorophore फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग) covalently bioorthogonal क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से शामिल रिपोर्टर से जुड़ा हुआ है । जांच तेजी से और विशेष रूप से शुरू की रासायनिक संशोधन के साथ प्रतिक्रिया करना चाहिए, जबकि रहने वाले सिस्टम में मौजूद किसी भी जैव अणुओं को निष्क्रिय किया जा रहा है । कई मायनों में, इस विधि अत्यधिक विशिष्ट क्लिक रसायन विज्ञान के उपयोग के माध्यम से आम bioconjugation तकनीकों की सीमाओं पर काबू पा ligations जिससे चयापचयों या biomacromolecules कि पहले से दुर्गम थे ट्रैक करने का अवसर प्रदान लिविंग सिस्टम में4,5,6.

जीवाणु और पशु कोशिकाओं में इस शक्तिशाली विधि की तेजी से बढ़ती लोकप्रियता के बावजूद, संयंत्र जीव विज्ञान में इसके उपयोग का वर्णन रिपोर्ट आश्चर्यजनक रूप से कुछ और दूर के बीच7,8,9,10, 11,12. हम विशेष रूप से पौधों में इस रणनीति को लागू करने में रुचि रखते थे लिग्निन के गठन का अध्ययन, एक ग्रह पर सबसे प्रचलित और बायोमास के एक प्रमुख घटक के lignocellulosic । 13 , 14 लिग्निन एक phenolic बहुलक है कि विकास और उच्च पौधों के जीवन में एक महत्वपूर्ण संरचनात्मक और सुरक्षात्मक भूमिका निभाता है ।

यह आम तौर पर तीन 4-hydroxyphenylpropanoid moieties: एच (पी-hydroxyphenyl), जी (guaiacyl) और एस (syringyl) इकाइयों से क्रमशः तीन ' monolignols ' (पी-coumaryl, coniferyl और sinapyl अल्कोहल) से प्राप्त की जाती है जो कोशिका के कोशिका में phenylpropanoid मार्ग के माध्यम से संश्लेषित (चित्रा 1). सेल दीवार को निर्यात किया जा रहा है के बाद, monolignols peroxidases या laccases के बाद जो वे विशुद्ध रूप से रासायनिक कट्टरपंथी युग्मन प्रतिक्रियाओं से गुजरना करने के लिए polymerize लिग्निन पॉलिमर, एक प्रक्रिया lignification द्वारा कण के लिए ऑक्सीकरण हो जाता है । 15 , 16 हालांकि lignins दृढ़ता से कई संयंत्र-व्युत्पंन उत्पादों के औद्योगिक valorization प्रभाव, वैज्ञानिक समुदाय अभी भी एक लंबा रास्ता तय करने के लिए जटिल lignification विनियमन तंत्र को समझने की है ।

Figure 1
चित्रा 1: संयंत्र कोशिकाओं में lignification प्रक्रिया. Monolignols cytosol में फेनिलएलनिन से विश्लेषित होते हैं. सेल दीवार को निर्यात किया जा रहा है के बाद, monolignols peroxidases या laccases के बाद जो वे विशुद्ध रूप से रासायनिक कट्टरपंथी युग्मन प्रतिक्रियाओं से गुजरना करने के लिए polymerize लिग्निन पॉलिमर, एक प्रक्रिया lignification द्वारा कण के लिए ऑक्सीकरण हो जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

हालांकि glycan विश्लेषण के लिए bioorthogonal प्रतिक्रियाओं के उपयोग पर रिपोर्टों के कई हैं,2,3,17 उनके अंय प्रकार के अणुओं के लिए आवेदन उदाहरण कम कर रहे हैं । लिग्निन इमेजिंग प्रयोजनों के लिए bioorthogonal रसायन विज्ञान का उपयोग हाल ही में Tobimatsu एट अल द्वारा अग्रणी था । 8 Arabidopsis थालियाना में लिग्निन बहुलक में coniferyl शराब किराए के शामिल करने के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए जहां यह जी इकाइयों,8रूपों,9 इस प्रकार की अवधारणा का सबूत है कि प्रदर्शन इस संदर्भ में केमिकल रिपोर्टर रणनीतियाँ लागू होती हैं. CuAAC का उपयोग भी एक अलग coniferyl शराब व्युत्पंन का उपयोग कर एक कुछ महीने बाद Bukowski एट अलद्वारा सचित्र था । 9 तथापि, लिग्निन भी एच और एस इकाइयों और lignification प्रक्रिया की एक गहरी समझ शामिल है कैसे monolignols के सभी बहुलक में शामिल कर रहे है और क्या कारकों अपनी संरचना को नियंत्रित कर सकते है के बारे में अधिक ज्ञान की आवश्यकता है । इस क्षेत्र में नई अग्रिम वर्तमान में रहने वाले सिस्टम में एक साथ कई रासायनिक पत्रकारों को ट्रैक करने के लिए कुशल तरीके के विकास पर निर्भर करते हैं । हालांकि glycans पर कुछ लेख हाल के वर्षों में नींव रखी है18,19,20,21,22, दोहरी लेबलिंग दृष्टिकोण में एक बड़ी चुनौती रह bioorthogonal केमिस्ट्री. यदि एक प्रतिलिपि एकल लेबलिंग क्लिक करें प्रोटोकॉल को विकसित करने के लिए कठिन है, तो दोहरी लेबलिंग दृष्टिकोण है कि दो अलग रासायनिक पत्रकारों पर पारस्परिक रूप से संगत bioorthogonal प्रतिक्रियाओं के मिलकर में अनुकूलन की आवश्यकता है और भी कठिन है । कुछ उदाहरण है कि इस पहलू का बीड़ा उठाया तनाव का एक संयोजन-पदोंनत azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) और alkene-tetrazine व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉनिक मांग Diels-Alder (DAinv) के लिए पशु कोशिकाओं में glycans का अध्ययन प्रतिक्रियाओं का इस्तेमाल किया । हालांकि, हमने सोचा था कि DAinv प्रतिक्रिया के bioorthogonality लिग्निन की संरचनात्मक सुविधाओं के कारण इस अनुप्रयोग में गारंटी नहीं हो सकता है (जो इलेक्ट्रॉन अमीर प्रतिस्थापित cinnamyl-प्रकार मोनोमर कि इलेक्ट्रॉन के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं-गरीब dienes जैसे tetrazine जांच DAinv प्रतिक्रियाओं में उपयोग किया जाता है) और यह गैर-विशिष्ट लेबलिंग उत्पन्न कर सकता है । इसके अलावा, दाinv प्रतिक्रिया रासायनिक संभालती है कि कृत्रिम रूप से उपयोग करने के लिए मुश्किल है की आवश्यकता है, साथ ही भारी और lipophilic जा रहा है जिससे संभावना है कि शामिल करने की दर, परिवहन और/ रिपोर्टर वीवो में प्रभावित हो सकता है । जैसा कि हमने माना है कि बाद पहलू lignification अध्ययन के लिए एक क्लिक रसायन विज्ञान दृष्टिकोण के मामले में विशेष रूप से प्रासंगिक था, हम एक अलग दिशा चुना और एक Bioorthogonal बंधाव इमेजिंग अनुक्रमिक रणनीति (आनंद) का विकास एक का उपयोग vivo में तनाव-संवर्धित Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) और कॉपर उत्प्रेरक Azide-Alkyne Cycloaddition (CuAAC) का संयोजन । 23

इन दो प्रतिक्रियाओं वास्तव में दो मुख्य bioorthogonal क्लिक करें प्रतिक्रियाओं कि तारीख करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और अधिक विशेष रूप से लिग्निन इमेजिंग के कुछ उदाहरण है कि हाल ही में प्रकाशित किए गए थे में हैं । 8 , 9 हमारे दोहरी लेबलिंग रणनीति एक monolignol रिपोर्टर और दूसरे पर एक टर्मिनल alkyne पर एक azide moiety के उपयोग में सक्षम बनाता है, दो रासायनिक संभालती है कि मैं कर रहे हैं) जैविक रूप से प्रासंगिक संरचनाओं और द्वितीय के प्रति प्रतिक्रिया) आकार में बहुत छोटा (चित्रा 2 ). एक परिणाम के रूप में, इन सिंथेटिक संशोधनों के अध्ययन के तहत भौतिक के गुणों पर इस प्रकार के प्रभाव को कम करने और परिवहन के मामले में अप्राकृतिक और प्राकृतिक monolignol सब्सट्रेट के बीच संभव विसंगतियों को कम करने है चयापचय निगमन कदम के दौरान metabolization दरों । हालांकि SPAAC और CuAAC के संयोजन पहली नज़र में बहुत सहज ज्ञान युक्त लगता है, यह हमारे ज्ञान के लिए केवल इस रणनीति और glycans के अलावा अंय संरचनाओं पर पहली आवेदन का उपयोग दोहरी अंकन का दूसरा उदाहरण है । 12 , 23

Figure 2
चित्रा 2: आनंद दोहरी लेबलिंग रणनीति । रासायनिक पत्रकारों एचAZ और जीALK देशी एच और जी monolignols के अनुरूप टैग कर रहे हैं । वे पहले exogenous खिला (चरण 1) द्वारा सेल दीवारों के बढ़ते लिग्निन पॉलिमर में शामिल कर रहे हैं । Cyclooctyne-और azide कार्यात्मक फ्लोरोसेंट जांच कर रहे है तो क्रमिक रूप से bioorthogonal क्लिक करें रसायन विज्ञान द्वारा शामिल पत्रकारों को ligated: SPAAC प्रतिक्रिया (चरण 2) HAZ इकाइयों के अत्यधिक विशिष्ट है और एक CuAAC प्रतिक्रिया के बाद ( चरण 3) कि जीALK इकाइयों (चरण 3) के विशिष्ट है, इस प्रकार दोनों पत्रकारों के विशिष्ट स्थानीयकरण की अनुमति एक ही नमूने में स्वतंत्र रूप से । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

हम सबसे पहले डिजाइन और azide-टैग monolignol रिपोर्टर hAZ ( पीके किराए-coumaryl शराब और लिग्निन एच इकाइयों के अग्रदूत साबित), और फिर आनंद दोहरी लेबलिंग रणनीति है जिसमें यह मिलकर में प्रयोग किया जाता है ईजाद पहले alkyne की सूचना दी-टैग की गईं जीALK,9 (coniferyl शराब के किराए और लिग्निन जी इकाइयों के अग्रदूत) । इस प्रतिलिपि प्रोटोकॉल में विकसित और सन में परीक्षण किया, एक आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण प्रजातियों के पौधे, एचAZ और जीALK के दोहरी चयापचय निगमन में लिग्निन पहली अनुक्रमिक SPAAC से पहले प्राप्त की है/CuAAC लेबलिंग. यहां, टैग की गईं एचAZ इकाइयों पहले विशेष रूप से एक cyclooctyne-कार्यात्मक fluorophore के SPAAC बंधाव के माध्यम से लेबल कर रहे हैं, CuAAC के बाद, टैग जीपर एक दूसरे फ्लोरोसेंट जांच की मध्यस्थता बंधावALK इकाइयां हैं । इस विधि संयंत्र सेल दीवारों के भीतर lignification प्रक्रियाओं की गतिशीलता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया और पार वर्गों स्टेम करने के लिए vivo में लागू किया जा सकता है, रहने के साथ ही विभिन्न प्रजातियों के पौधों के अंकुरों.

Protocol

नोट: तरल और ठोस ½ एमएस मीडिया पहले से तैयार किया जाना चाहिए के रूप में पूरक तालिका 1में वर्णित ।

1. पादप संस्कृति

  1. 2 महीने पुराने सन संयंत्रों की संस्कृति
    1. प्लास्टिक बर्तन में बोना सन (Linum usitatissimum एल) बीज पॉटी खाद का उपयोग कर ।
    2. वृद्धि कक्षों में 22 डिग्री सेल्सियस में सन photoperiod 16 ज/8 ज दिन रात/
    3. 1 महीने के बाद ऊर्ध्वाधर समर्थन के साथ पौधों से लैस है और जब तक वे 2 महीने पुराने हो जाना ।
  2. 2 सप्ताह पुराने सन अंकुरों की संस्कृति
    1. पनीर के कपड़े के एक टुकड़े में 12 सन बीज लपेटें और एक बंडल बनाने के लिए एक रबर बैंड के साथ तय ।
      नोट: एक लामिना प्रवाह धुएं हूड के तहत बाँझ शर्तों के तहत अगले कदम बाहर ले ।
    2. एक पहले से autoclaved २५० मिलीलीटर कांच की बोतल में बीज बंडल प्लेस ।
    3. बोतल में ७०% ेतोः की ७० मिलीलीटर जोड़ें और धीरे 1 मिनट के लिए हलचल ।
    4. बोतल में बंडल छोड़ते समय सावधानी से ेतोः को हटा दें ।
    5. 2% सोडियम हाइपोक्लोराइट की १०० मिलीलीटर जोड़ें और 10 मिनट के लिए धीरे हलचल ।
    6. बोतल में बंडल छोड़ते समय खिचड़ी के द्वारा सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान निकालें ।
    7. दोहराएँ चरण 1.2.5-1.2.6.
    8. बाँझ ultrapure पानी की १०० मिलीलीटर जोड़ें और 1 मिनट के लिए हलचल ।
    9. दोहराएं चरण 1.2.8 3 बार, प्रत्येक कुल्ला (5, 10 और 15 मिनट) के लिए धोने का समय बढ़ाने पर ।
    10. गर्म ठोस ½ एमएस माध्यम, यह एक बाँझ संयंत्र संस्कृति बॉक्स में 2 सेमी की ऊंचाई पर डालो और इसे solidification तक शांत हो जाओ ।
    11. नाजुक बाँझ संदंश का उपयोग ठोस माध्यम पर प्रत्येक बीज जगह.
    12. बाँझ बॉक्स बंद करें ।
    13. 16 घंटे के एक photoperiod के साथ 22 डिग्री सेल्सियस पर एक विकास कक्ष में बॉक्स स्थानांतरण/रात और 2 सप्ताह के लिए सन अंकुरित हो जाना ।

2. रासायनिक पत्रकारों के चयापचय निगमन

नोट: तीन प्रयोगात्मक मॉडल नीचे प्रस्तुत कर रहे हैं: i) स्टेम क्रॉस वर्गों के चयापचय लेबलिंग, ii) साबुत उपजा और iii) पौध अंकुर । प्रत्येक प्रोटोकॉल एक जैविक दोहराने और मात्रा आवश्यक जैविक प्रतिकृति की संख्या के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के लिए प्रस्तुत किया है । monolignol समाधान स्टॉक समाधानों से तैयार किए जाते है जो प्रयोग करने से पूर्व तालिका 2 में बताए गए अनुसार किए जाते हैं । स्टॉक समाधान-20 डिग्री सेल्सियस पर कई महीने संग्रहीत किया जा सकता है । HAZ: GALK या H:G अनुपात सभी कस्टम निर्मित प्रयोगात्मक डिजाइन फिट करने के लिए समायोजित किया जा सकता है ।

  1. रासायनिक रिपोर्टर में 2 महीने पुराने सन स्टेम पार वर्गों
    1. एक ३०० µ एल केमिकल रिपोर्टर समाधान तैयार करें जिसमें 10 µ m की GALK और 10 µ m की HAZ की लिक्विड बाँझ ½ MS मीडियम में होती है ।
    2. भंवर HAZ/जीALK समाधान और यह एक micropipette के साथ एक ४८ अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से हस्तांतरण ।
    3. एक ३०० µ l नेगेटिव कंट्रोल सॉल्यूशन तैयार करें जिसमे 10 µ m का G और 10 µ m का H लिक्विड बाँझ ½ MS मीडियम में हो ।
    4. भंवर एचजी समाधान और यह एक ही ४८-अच्छी तरह से प्लेट की एक दूसरी अच्छी तरह से हस्तांतरण ।
    5. एक नया उस्तरा ब्लेड का उपयोग मिट्टी के स्तर से ऊपर 10 सेमी में एक 2 महीने पुराने सन संयंत्र के स्टेम कट ।
    6. नाजुक ५० मुक्तहस्त आड़ा पार के तने के वर्गों के रेजर ब्लेड (लगभग 150-250 µm मोटी) का उपयोग कर तैयार करते हैं ।
    7. तुरंत एक घड़ी गिलास में तरल बाँझ ½ एमएस माध्यम में पार वर्गों जगह है ।
    8. नेत्रहीन का निरीक्षण और बरकरार पूरे पार वर्गों का चयन करें और बेतरतीब ढंग से एचAZ/GALK समाधान के साथ अच्छी तरह से भरा में उनमें से 10 वितरित ।
    9. H/G समाधान (ऋणात्मक नियंत्रण के रूप में) के साथ अच्छी तरह से भरे जाने के लिए चरण 2.1.8 दोहराएं ।
    10. दोहराएं एक तिहाई अच्छी तरह से ½ एमएस माध्यम के ३०० µ एल के साथ भरा के लिए कदम 2.1.8 (पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों के बाद के डेटा प्रोसेसिंग के दौरान प्रतिदीप्ति आधार रेखा को समायोजित करने के लिए) ।
    11. 20 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर एक विकास कक्ष में निरंतर प्रकाश में थाली मशीन
    12. एक micropipette के साथ एक अच्छी तरह से monolignol समाधान निकालें ।
    13. ½ एमएस माध्यम के ५०० µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से, 10 मिनट के लिए धीरे हलचल और एक micropipette के साथ इस कुल्ला समाधान निकालें । दोहराएँ 4 बार और तुरंत लेबलिंग आनंद के लिए आगे बढ़ना (धारा 3).
  2. केमिकल रिपोर्टर में शामिल 2 महीने पुराने सन पूरे उपजा
    1. एक 5 मिलीलीटर केमिकल रिपोर्टर समाधान तैयार करें जिसमें 10 µ m के GALK और 10 µ m के HAZ के तरल बाँझ ½ MS माध्यम में है ।
    2. भंवर एचAZ/जीALK समाधान और यह एक पिपेट के साथ एक 20 सेमी-उच्च ग्लास टेस्ट ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    3. 5 मिलीलीटर ऋणात्मक नियंत्रण समाधान तैयार करें जिसमें 10 µ एम ऑफ जी और 10 µ एम के एच के लिक्विड बाँझ ½ एमएस मीडियम में हों ।
    4. भंवर एचजी समाधान और यह एक 20 सेमी-उच्च ग्लास टेस्ट ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    5. ½ एमएस मीडियम के 5 मिलीलीटर (पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों के बाद के डेटा प्रोसेसिंग के दौरान प्रतिदीप्ति आधारभूत समायोजित करने के लिए) के साथ एक तीसरे ग्लास टेस्ट ट्यूब तैयार करें ।
    6. एक नया उस्तरा ब्लेड का उपयोग मिट्टी के स्तर से ऊपर 10 सेमी में एक 2 महीने पुराने सन संयंत्र के स्टेम कट । जड़ प्रणाली और स्टेम के निचले हिस्से को त्यागें और संयंत्र स्टेम के ऊपरी भाग के साथ अगले कदम के लिए आगे बढ़ना ।
    7. HAZ/GALK समाधान युक्त ट्यूब में पूरे कट स्टेम के आधार विसर्जित कर दिया । यह सुखाने से रोकने के क्रम में जड़ प्रणाली को हटाने के तुरंत बाद इसकी मशीन समाधान में स्टेम प्लेस ।
      नोट: यदि विधि छोटी/पुराने पौधों और/या अन्य प्रजातियों के लिए लागू किया जाता है, monolignol समाधान की मात्रा संयंत्र के आकार/आयु और इसके स्टेम के व्यास के अनुसार समायोजित करना होगा ।
    8. इसे सीधे रखने के लिए एक अनुलंब समर्थन में स्टेम अनुलग्न करें ।
    9. parafilm के साथ कांच ट्यूब सील समाधान के वाष्पीकरण से बचने के लिए ।
    10. H/G समाधान के साथ ऋणात्मक नियंत्रण नमूने के लिए चरण 2.2.6-2.2.9 दोहराएं ।
    11. ½ MS माध्यम युक्त प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि नियंत्रण नमूने के लिए चरण 2.2.6-2.2.9 दोहराएँ ।
    12. एक नीयन रोशनी का उपयोग सतत प्रकाश में 20 एच के लिए प्रत्येक स्टेम मशीन ।
    13. चयापचय निगमन के 20 घंटे के बाद, hAZ/GALK समाधान में मशीन स्टेम निकालने और ½ एमएस माध्यम के साथ कुल्ला ।
    14. कट और एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर स्टेम के नीचे 1 सेमी त्यागें और फिर शेष स्टेम के आधार से एक 1 सेमी उच्च सिलेंडर तैयार करते हैं ।
    15. सावधानी से 20 मुक्तहस्त अनुप्रस्थ पार वर्गों (लगभग 150-250 µm मोटी) इस सिलेंडर से तैयार है और उंहें एक घड़ी ½ एमएस माध्यम से भरे गिलास में तुरंत जगह है ।
    16. एक ४८ अच्छी तरह से थाली के एक कुआं में ½ एमएस मीडियम के ५०० µ एल रखो ।
    17. नेत्रहीन का निरीक्षण और बरकरार पूरे पार वर्गों का चयन करें और बेतरतीब ढंग से ½ एमएस समाधान के साथ अच्छी तरह से भरा में उनमें से 10 वितरित ।
    18. दोहराएँ चरण 2.2.13-2.2.17 नकारात्मक नियंत्रण के लिए H/G समाधान के साथ मशीन स्टेम ।
    19. दोहराएँ चरण 2.2.13-2.2.17 प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि नियंत्रण ½ एमएस माध्यम के साथ मशीन स्टेम के लिए.
    20. सावधानी से एक micropipette के साथ एक अच्छी तरह से समाधान निकालें ।
    21. ½ एमएस माध्यम के ५०० µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से, 10 मिनट के लिए धीरे हलचल और एक micropipette के साथ इस कुल्ला समाधान निकालें । दोहराएँ 4 बार और तुरंत लेबलिंग आनंद के लिए आगे बढ़ना (धारा 3).
  3. 2 सप्ताह पुराने सन अंकुरों में रसायन रिपोर्टर निगमन
    नोट: निंनलिखित चरणों सभी बाँझ शर्तों के तहत किया जाता है ।
    1. एक 2 मिलीलीटर केमिकल रिपोर्टर समाधान तैयार करें जिसमें 10 µ m के GALK और 10 µ m के HAZ के तरल बाँझ ½ MS माध्यम में है ।
    2. भंवर एचAZ/जीALK समाधान और यह एक पिपेट के साथ एक 20 सेमी-उच्च ग्लास टेस्ट ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    3. 2 मिलीलीटर ऋणात्मक नियंत्रण समाधान तैयार करें जिसमें G के 10 µ m और H के 10 µ m तरल बाँझ ½ MS माध्यम में ।
    4. भंवर एचजी समाधान और यह एक 20 सेमी-उच्च ग्लास टेस्ट ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
    5. ½ एमएस मीडियम के 2 मिलीलीटर (पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों के बाद के डेटा प्रोसेसिंग के दौरान प्रतिदीप्ति बेसलाइन को समायोजित करने के लिए) एक तिहाई 20 सेमी-उच्च ग्लास टेस्ट ट्यूब तैयार करें ।
    6. नाजुक चिमटी (धारा १.२. ऊपर) की एक लंबी जोड़ी का उपयोग ठोस ½ एमएस माध्यम से एक 2 सप्ताह पुराने सन अंकुर को हटा दें ।
    7. धीरे से HAZ/GALK समाधान युक्त ट्यूब करने के लिए अंकुर हस्तांतरण, सुनिश्चित करना है कि अपनी जड़ों के समाधान में डूब रहे हैं ।
    8. वाष्पीकरण से बचने के लिए प्लास्टिक कैप के साथ ग्लास ट्यूब बंद करें ।
    9. एच/जी समाधान के साथ नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब के लिए कदम 2.3.6-2.3.8 दोहराएँ ।
    10. ½ एमएस मीडियम युक्त प्रतिदीप्ति बैकग्राउंड कंट्रोल ट्यूब के लिए स्टेप्स 2.3.6-2.3.8 को दोहराएँ.
    11. 20 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए एक विकास कक्ष में सतत प्रकाश में प्रत्येक अंकुर मशीन ।
    12. नाजुक HAZ/GALK समाधान और ½ एमएस माध्यम के साथ कुल्ला में मशीन अंकुर हटा दें ।
    13. नाजुक 20 मुक्तहस्त पार वर्गों (approximatively 150-250 µm मोटी) hypocotyl की तैयारी ।
    14. एक ४८ अच्छी तरह से थाली के एक कुआं में ½ एमएस मीडियम के ५०० µ एल रखो ।
    15. नेत्रहीन का निरीक्षण और बरकरार पूरे पार वर्गों का चयन करें और बेतरतीब ढंग से ½ एमएस समाधान के साथ अच्छी तरह से भरा में उनमें से 10 वितरित ।
    16. दोहराएँ चरण 2.3.12-2.3.15 नकारात्मक नियंत्रण के लिए H/G समाधान के साथ मशीन अंकुर ।
    17. दोहराएं चरणों 2.3.12-2.3.15 प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि नियंत्रण ½ एमएस माध्यम के साथ की मशीन के लिए ।
    18. सावधानी से एक micropipette के साथ एक अच्छी तरह से समाधान निकालें ।
    19. ½ एमएस माध्यम के ५०० µ एल जोड़ें एक अच्छी तरह से, 10 मिनट के लिए धीरे हलचल और एक micropipette के साथ इस कुल्ला समाधान निकालें । दोहराएँ 4 बार और तुरंत लेबलिंग आनंद के लिए आगे बढ़ना (धारा 3).

3. SPAAC और CuAAC द्वारा संयंत्र क्रॉस-खंड नमूनों की दोहरी प्रतिदीप्ति लेबलिंग

नोट: आनंद लेबलिंग प्रोटोकॉल सभी 3 प्रयोगात्मक मॉडल (खंड 2) के लिए समान है ।

  1. तनाव-संवर्धित Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) लेबलिंग
    1. DBCO-खूंटी4-5/6-carboxyrhodamine ११० तरल बाँझ ½ एमएस माध्यम में की 5 µ मीटर युक्त एक SPAAC समाधान की 1 मिलीलीटर तैयार करें । हल भंवर और अंधेरे में रहते हैं ।
    2. चयापचय निगमन प्रोटोकॉल के अंतिम धुलाई कदम के बाद [2.1.13, 2.2.21 या 2.3.19 चुना प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है], ½ एमएस मध्यम निकालें और µ के साथ एक SPAAC समाधान के प्रति अच्छी तरह से ३०० micropipette एल जोड़ें ।
    3. एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर या एक बॉक्स में रखकर द्वारा प्रकाश से ४८ अच्छी तरह से थाली ढाल ।
    4. धीरे परिवेश के तापमान पर अंधेरे में 1 एच के लिए एक यांत्रिक शेखर पर थाली हलचल ।
  2. कॉपर-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition (CuAAC) लेबलिंग
    1. एक अच्छी तरह से 4 बार धोने के रूप में कदम 2.1.13 में वर्णित है, जबकि अंधेरे में थाली रखते हुए ।
    2. २.५ मिमी सोडियम ascorbate, ०.५ mm CuSO4 और 5 µ मीटर के 5-तमृ-खूंटी3-azide में तरल बाँझ ½ एमएस मीडियम युक्त एक CuAAC समाधान की 1 मिलीलीटर तैयार करें । हल भंवर और अंधेरे में रहते हैं ।
      नोट: इस CuAAC समाधान का उपयोग करने से पहले नए सिरे से तैयार होना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ दिनों से अधिक संग्रहित नहीं किया जा सकता है ।
    3. एक अच्छी तरह से ½ एमएस माध्यम निकालें और सीधे CuAAC समाधान के ३०० µ एल जोड़ने के प्रति अच्छी तरह से एक micropipette का उपयोग कर ।
    4. धीरे परिवेश के तापमान पर अंधेरे में 1 एच के लिए एक यांत्रिक शेखर पर थाली हलचल ।
    5. किसी micropipette का उपयोग कर CuAAC समाधान निकालें ।
    6. एक micropipette का प्रयोग, ½ MS के ५०० µ एल जोड़ें, 10 मिनट के लिए अंधेरे में हलचल तो इस धुलाई समाधान निकालें । दोहराएं दो बार ।
    7. Add ५०० µ l a 7:3 MeOH/जल समाधान, अंधेरे में 1 ज के लिए हलचल तो समाधान निकालें
      चेतावनी: मेथनॉल त्वचा से संपर्क करें या सांस लेना विषाक्त है, और एक मानव यलो के रूप में नामित है । इसके उपयोग रासायनिक धुएं डाकू और दस्ताने की आवश्यकता है ।
    8. जोड़ें ५०० µ ½ MS के एल, 10 मिनट के लिए अंधेरे में हलचल तो समाधान निकालें । 4 बार दोहराएं ।

4. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर नमूने के बढ़ते

  1. एक गिलास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बढ़ते माध्यम के 5 बूंदें प्लेस ।
  2. प्रत्येक HAZ/GALKस्लाइड पर क्रॉस-अनुभाग चिह्नित ध्यान से जमा ।
  3. स्लाइड के दो विपरीत पक्षों पर नेल पॉलिश लागू करें ।
  4. एक coverslip के साथ स्लाइड कवर । हवा के बुलबुले से बचने के लिए सावधान रहें ।
  5. अतिरिक्त बढ़ते मध्यम एक कागज तौलिया का उपयोग कर निकालें ।
  6. सभी 4 पक्षों पर नेल पॉलिश के साथ नमूना सील । चलो नाखून वार्निश कमरे के तापमान पर शुष्क (लगभग 30 मिनट) ।
  7. ऋणात्मक नियंत्रण H/G क्रॉस-अनुभागों के लिए चरण 4.1-4.6 को दोहराएं ।
  8. दोहराएँ चरण 4.1-4.6 प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि नियंत्रण क्रॉस-अनुभागों के लिए ।
  9. एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन तक अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड की दुकान.
    नोट: तैयार स्लाइड कई हफ्तों के लिए तैयारी की गुणवत्ता पर निर्भर करता है कई महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । यदि कोई नया निरीक्षण भंडारण के बाद किया जाना है, सुनिश्चित करें कि नमूनों सूख नहीं किया है ।

5. प्रतिदीप्ति फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि अधिग्रहण

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार सही क्रम में फोकल माइक्रोस्कोपी प्रणाली के सभी आवश्यक इकाइयों को चालू करें ।
  2. अधिकतम संख्यात्मक एपर्चर और अनुकूलित उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ वांछित उद्देश्य का चयन करें (जैसे, obj. 60x, एनए १.२ । Autofluorescence चैनल: λex ४०५ एनएम, λem ४५० एनएम/ SPAAC HAZ चैनल: λपूर्व ४८८ एनएम, λem ५२५ एनएम/ CuAAC जीALK चैनल: λex ५६१ एनएम, λem ५९५ एनएम/ अनुक्रमिक मोड) ।
  3. सॉफ्टवेयर में छवियों के उत्पादन के लिए वांछित मापदंडों का चयन करें (12-या 16 बिट की आवश्यकता, पिक्सेल आकार Nyquist कसौटी पर अनुकूलित).
  4. खुर्दबीन स्टेज पर एचAZ/GALK स्लाइड प्लेस और उद्देश्य लेंस के तहत नमूना स्थिति ।
  5. निरीक्षण और संयंत्र ऊतक के वांछित क्षेत्र का पता लगाएं ।
  6. उच्च गुणवत्ता के फोकल छवियां प्राप्त दोहरीकरण लेबल HAZ/GALK नमूना ।
    1. Z-अक्ष में सबसे फ्लोरोसेंट विमान का चयन करें ।
    2. प्रत्येक चैनल (autofluorescence, HAZ और GALK) के लिए पूरे धूसर स्तर सीमा के साथ इष्टतम संकेत वितरण प्राप्त करने के लिए लाभ, ऑफसेट और लेजर शक्ति को समायोजित करें । सभी निम्न प्राप्ति के लिए एक ही पैरामीटर लागू किया जाना चाहिए ।
    3. चयनित छवि का अधिग्रहण लॉंच करें और फ़ाइल सहेजें । नमूना के प्रत्येक संबंधित क्षेत्र के लिए दोहराएँ ।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो 3d Z-स्टैक पुनर्निर्माण भी प्राप्त किया जा सकता है ।
  7. एक ही सेटिंग्स का उपयोग करना, untagged नमूना की छवियों को केवल ½ MS में autofluorescence स्तर निर्धारित करने के लिए (प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि नियंत्रण खंड 2 में वर्णित के रूप में) का अधिग्रहण ।
  8. एक ही सेटिंग का प्रयोग, नकारात्मक नियंत्रण देशी monolignols H/जी के साथ मशीन नमूने के लिए गैर विशिष्ट fluorophore आसंजन निर्धारित करने के लिए नमूनों के लिए छवियों को प्राप्त.
  9. अधिग्रहीत छवियों के लिए डेटा उपचार लागू करें दोनों एच/जी नकारात्मक नियंत्रण छवियां और एचAZ/GALK छवियों में पृष्ठभूमि autofluorescence संकेतों घटाना करने के लिए ।

Representative Results

प्रस्तुत परमानंद सिंथेटिक monolignol अनुरूप और bioorthogonal क्लिक रसायन शामिल प्रोटोकॉल का उपयोग करके, यह रहने वाले पौधों में lignification प्रक्रिया की गतिशीलता कल्पना संभव है । लिग्निन दृश्य के लिए स्थापित तकनीकों के विपरीत (जैसे histochemical धुंधला, immunolocalization या autofluorescence के रूप में), इस ' डबल क्लिक ' प्रोटोकॉल विशेष रूप से चयापचय निगमन के दौरान डी नोवो उत्पादित लिग्निन लक्ष्य कदम और यह ट्रिपल के साथ नमूना के मौजूदा लिग्निन से अंतर चैनल सेलुलर इमेजिंग द्वारा फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3). ज AZ-इकाइयों DBCO के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग पता चला रहे है-खूंटी4-5/6-carboxyrhodamine ११० कि विशेष रूप से SPAAC कदम के दौरान शामिल एचAZ अणुओं के azide कार्यों पर क्लिक किया है (λex ५०१ एनएम/λem ५२६ एनएम, ग्रीन चैनल), जबकि जीALK-इकाइयों इसी तरह azidefluor ५४५ जांच की विशेषता तरंग दैर्ध्य पर पाया जाता है कि विशेष रूप से शामिल किया टर्मिनल alkyne टैग पर क्लिक किया है जी ALK के दौरान CuAAC चरण (λex ५४६ एनएम/λem ५६५ एनएम, लाल चैनल); तीसरे चैनल पूर्व मौजूदा लिग्निन, जो ४०५ एनएम (ब्लू चैनल) पर अपनी आंतरिक autofluorescence का उपयोग कर पाया जाता है से मेल खाती है । यह दृष्टिकोण तीन रंग संयंत्र सेल दीवारों के भीतर लिग्निन के स्थानीयकरण नक्शे कि उपस्थिति या एक अंग के विभिंन ऊतकों के बीच सक्रिय lignification मशीनरी के अभाव पर सटीक स्थानिक जानकारी प्रदान की पीढ़ी की ओर जाता है (3 ए चित्र ), एक ही ऊतक (चित्रा 3 बी-सी) के भीतर और एक ही सेल (चित्रा 3d) के विभिन्न दीवार परतों के भीतर विभिन्न प्रकार के सेल के बीच. दूसरे शब्दों में, इस पद्धति हमें प्रकाश डाला और विशेष रूप से ' सक्रिय ' lignification साइटों (एचAZ और जीALK चैनल) उंहें क्षेत्रों जहां लिग्निन एक पूर्व में गठन किया गया था से अंतर से स्थानीयकृत करने की अनुमति देता है संयंत्र विकास (autofluorescence चैनल) के मंच । इसके अलावा, तकनीक की संवेदनशीलता नाटकीय रूप से जब autofluorescence की तुलना में बढ़ाया है, और हौसले से संश्लेषित लिग्निन की बहुत छोटी मात्रा का पता लगाया जा सकता है (चित्र बी) ।

Figure 3
चित्रा 3: सन में शामिल monolignol रासायनिक पत्रकारों की इमेजिंग उपजा है. (क) आधे से एक हाथ से बना आड़ा धारा एक सन स्टेम का, खंगाला चित्र । (B) जाइलम के अंतर की पहली परतों का क्लोज-अप । बायां पैनल: लिग्निन autofluorescence (नीला, ४०५ एनएम), मध्य पैनल: मर्ज किए गए लिग्निन autofluorescence (नीला) और HAZ प्रतिदीप्ति (हरा, ५२६ एनएम) चैनल, दायां पैनल: विलयित लिग्निन autofluorescence (नीला) और जीALK प्रतिदीप्ति (लाल, ५६५ एनएम) चैनल । तीर autofluorescence के साथ तुलना में आनंद की वृद्धि की संवेदनशीलता illustrating केंबियम से पहले लेबल सेल दीवार इंगित करता है । (C) द्वितीयक जाइलम के विभिंन कक्ष प्रकारों में लेबलिंग और (D) द्वितीयक जाइलम कक्षों पर बंद करें जो एक ही कक्ष दीवार की विभिंन परतों में लेबलिंग भिंनताएं दिखाता है । बाएं पैनल: विलय लिग्निन autofluorescence (नीला) और एचAZ प्रतिदीप्ति (ग्रीन, ५२६ एनएम) चैनल, मध्य पैनल: विलय लिग्निन autofluorescence (नीला) और जीALK प्रतिदीप्ति (लाल, ५६५ एनएम) चैनल, सही पैनल: विलय लिग्निन autofluorescence (नीला), एचAZ (हरा) और जीALK (लाल) प्रतिदीप्ति चैनल । HAZ और जीALK सह स्थानीयकरण पीले रंग में दर्शाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इस तरह के आनंद विधि के रूप में रासायनिक रिपोर्टर रणनीतियों यहां प्रस्तुत या एकल-लेबलिंग पहले Tobimatsu एट अल द्वारा प्रकाशित प्रक्रियाओं । 8 इसलिए bliss के रूप में पहले से सुलभ तरीकों से एक बहुत महीन अध्ययन की अनुमति कर सकते है-या histochemical धुंधला जबकि बहुत लागू करने के लिए सरल जा रहा है । उदाहरण के लिए, चित्रा 4 दिखाता है कि HAZ/GALK के लिए सिग्नल की तीव्रता फाइबर tracheids में (FT) सन माध्यमिक जाइलम के केंबियम से पहले कुछ सेल दीवारों में बहुत अधिक है, लेकिन पुरानी कोशिकाओं में उत्तरोत्तर घट जाती है. यह प्रोफ़ाइल autofluorescence के विपरीत है और यह इंगित करता है कि अधिकतम lignification बहुत तेजी से केंबियम से पहले दो से तीन फुट की कोशिका परतों में पहुंच जाता है । इसके विपरीत, रे (नि.) कोशिकाओं को अपने विकास के बहुत बाद के चरणों के लिए lignification जारी रखने के रूप में एचAZ/जीALK शामिल करने के लिए केंबियम से सभी कोशिकाओं की दीवारों में बहुत अधिक स्थिर है मज्जा को दिखाई देते हैं । यह आश्चर्य की बात नहीं है कि एफटी और आर सेल प्रकार lignification गतिशीलता विषम प्रदर्शन, के बाद से इन सेल प्रकार उनके विकास कार्यक्रम में जुड़े मतभेदों के साथ विभिंन जैविक भूमिकाओं है । FTs वास्तव में लंबी ट्यूब कि परिपक्व और तेजी से मर रहे हैं, मोटी lignified दीवारों के साथ मृत खाली कोशिकाओं है कि दोनों यांत्रिक समर्थन और पानी और खनिजों के ऊर्ध्वाधर परिवहन में आवश्यक भूमिका निभा रहा है, जबकि आर कोशिकाओं की संकीर्ण पंक्तियों कि रचना जाइलम किरणों मोटी lignified दीवारों के बिना उनके परिपक्व और कार्यात्मक राज्य में जीवित हैं ।

Figure 4
चित्र 4: सन जाइलम में सेल-विशिष्ट monolignol रिपोर्टर शामिल है । उज्ज्वल-क्षेत्र फोकल माइक्रोस्कोपी दृश्य (एक) एक सन स्टेम से एक मुक्तहस्त पार अनुभाग के भाग के । गुलाबी (रे पैरेन्काइमा कोशिकाओं, आर) और पीला (फाइबर tracheid कोशिकाओं, फुट) तीर मज्जा की ओर cambial क्षेत्र से फैले वैक्टर संकेत मिलता है और ४०५ एनएम (बी), एचAZ autofluorescence में ५२६ एनएम (सी) और जी पर स्कैन लिग्निन प्रतिदीप्ति के लिए ५६५ एनएम (डी) पर ALK प्रतिदीप्ति । (E) द्वितीयक जाइलम का दृश्य । बाएं पैनल: विलय लिग्निन autofluorescence (नीला), एचAZ (हरा), और जीALK (लाल) प्रतिदीप्ति चैनल । HAZ और जीALK सह स्थानीयकरण पीले रंग में दर्शाया गया है । दायां फलक: द्वितीयक जाइलम संरचना का सन स्टेम में योजनाबद्ध चित्रण । V, पोत; फुट, फाइबर tracheid; आर, रे पैरेन्काइमा सेल । इस आंकड़े को लॉयन एट अल से संशोधित किया गया है । 23 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इसके अलावा, दो विशिष्ट रसायन एच के लिए इसी रिपोर्टर का उपयोग करें और जी-आनंद प्रोटोकॉल में दो bioorthogonal प्रतिक्रियाओं के साथ इकाइयों और अधिक मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने की अनुमति देता है । मल्टीप्लेक्स जैसी लेबलिंग रणनीतियों का आनंद विभिंन स्थितियों में monolignol के अनुपात के नियंत्रण पर अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है और मायावी lignification प्रक्रिया को समझने में योगदान दे सकता है । यदि एच, जी और lignins में एस monolignols के सापेक्ष प्रतिशत वास्तव में प्रजातियों, ऊतक, आयु या संयंत्र के पर्यावरणीय शर्तों के अनुसार बहुत चर रहे हैं, जटिल तंत्र है कि इस संरचना को विनियमित अभी भी पूरी तरह से समझ नहीं रहे हैं । दोहरी लेबलिंग प्रौद्योगिकी लिग्निन संरचना को विनियमित करने वाले कुछ मापदंडों की जांच का एक शक्तिशाली तरीका का प्रतिनिधित्व करता है । उदाहरण के लिए, HAZबदलती: आनंद के साथजीALK अनुपात हमें प्रदर्शन करने के लिए कि माध्यमिक जाइलम ऊतकों में लिग्निन संरचना सीधे सेल दीवारों के भीतर monolignol उपलब्धता पर निर्भर है, बजाय पर अनुमति दी peroxidase/laccase विशिष्टता (चित्र 5) ।

Figure 5
चित्रा 5: एचAZ और जीALKके विभिंन प्रतिशत अनुपात के साथ सन स्टेम वर्गों की मशीन का प्रभाव । HAZ: GALK% अनुपात आंकड़े के प्रत्येक कॉलम के ऊपर दिया जाता है । शीर्ष: विलय एचAZ और जीALK चैनल । नीचे: विभिंन% अनुपात के लिए HAZ और जीALK के औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता का संकेत हिस्टोग्राम । मान ग्रे स्तर ± एसडी में मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता का मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । स्केल बार = १०० µm. यह आंकड़ा लॉयन एट अल से संशोधित किया गया है । 23 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सन अपने bast फाइबर (BF) है कि वस्त्र, लक्जरी कागजात या पर्यावरण के अनुकूल समग्र सामग्री का निर्माण करने के लिए उपयोग किया जाता है के लिए उगाया जाता है । उनके औद्योगिक valorization का एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि वे अपने सेल दीवारों में लिग्निन के बहुत कम स्तर होते हैं, जो एक अत्यंत मोटी S2/जी माध्यमिक परत19,24की विशेषता है । आनंद एक ही सेल दीवार के विभिंन परतों के बीच lignification गतिशीलता मतभेदों को उजागर कर सकते हैं । चित्रा 6A से पता चलता है कि एचAZ और जीALK रिपोर्टर निगमन सेल कोनों और मध्य lamella के लिए सीमित है/ मोटी bast फाइबर माध्यमिक कोशिका दीवार परत में lignification की कुल अनुपस्थिति भी जब monolignol रासायनिक पत्रकारों exogenously आपूर्ति कर रहे है पता चलता है कि उनके hypolignified राज्य के लिए उपयुक्त एक आणविक वातावरण के अभाव से उठता है enzymatically-मध्यस्थता ऑक्सीकरण और monolignols के एक बढ़ती बहुलक श्रृंखला में शामिल है, और है कि यह सिर्फ monolignol का transcriptional विनियमन के कारण नहीं है संश्लेषण जीन के रूप में पहले की रिपोर्ट25। इस निरीक्षण भी तथ्य यह है कि सन peroxidase जीन ऊपर है-सन रासायनिक lbf1 उत्परिवर्ती कि lignified bast फाइबर के पास के बाहरी स्टेम ऊतकों में विनियमित के साथ अच्छी तरह से संबद्ध26।

Figure 6
चित्रा 6: आनंद सेल दीवार उपसंरचना पर प्रकाश डाला गया-या परत विशेष मतभेद । (क) बाएं पैनल: उज्ज्वल एक सन स्टेम अनुभाग के क्षेत्र छवि । वृत्त एक फाइबर बंडल इंगित करता है । दायां पैनल: बंद ऊपर bast फाइबर पर । विलय एचAZ और जीALK चैनल (के साथ और उज्ज्वल के बिना क्षेत्र) दिखा रहा है कि lignification सेल कोनों तक ही सीमित है () और मध्य lamella/Equation BF, bast फाइबर; Par, पैरेन्काइमा सेल; मी, मध्य lamella; P, प्राथमिक सेल वॉल; एस सी, माध्यमिक सेल दीवार की पहली परत; S2/जी, माध्यमिक कोशिका दीवार के माध्यमिक परत/ (ख) 2 डी टुकड़ा और सन रूट endodermis क्षेत्र के फोकल जेड-स्टैक ज़ूम के 3 डी पुनर्निर्माण । Casparian पट्टी () केवल autofluorescence को प्रदर्शित करता है और इसमें HEquationAZ या GALKशामिल नहीं है । एसोसिएटेड fluorogram एक जीALK/HAZ विरोधी सहसंबंध से पता चलता है: उच्च हरी प्रतिदीप्ति कम लाल संकेत (प्रांतस्था) और प्रतिकूल (endodermis) के लिए जुड़ा हुआ है । Pericycle (P), Endodermis (E), प्रांतस्था (C). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अंत में, यह दो रंग पद्धति विभिन्न विकासात्मक चरणों में और तने के अलावा अन्य पादप अंगों में कोशिका दीवार उपसंरचनाओं के ' lignification राज्य ' पर बहुमूल्य जानकारी भी प्रदान कर सकती है. उदाहरण के लिए, सन जड़ों के endodermis विकास के प्रारंभिक दौर के दौरान अपने रेडियल और अनुप्रस्थ सेल दीवारों में एक Casparian बैंड के अस्तित्व की विशेषता है । hydrophobic के इस बैंड, उपआयलैंड और/या लिग्निन के बने, पानी रोकता है और solutes apoplast के माध्यम से निष्क्रिय में प्रवेश करने से जड़ द्वारा उठाए गए और उंहें एक symplastic मार्ग के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से पारित करने के लिए जिससे योगदान को बलों पौधों की जड़ों के चुनिंदा तीनो क्षमताएं । जब सन जड़ों को लागू किया, हमारी रणनीति से पता चला कि एचAZ और जीALK endodermal कोशिकाओं के स्पर्श दीवारों में शामिल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रेडियल दीवारों के कुछ हिस्सों में जहां Casparian बैंड अनुपस्थित है (आंकड़ा घमण्ड) । हालांकि, Casparian बैंड में monolignol रिपोर्टर निगमन की कुल अनुपस्थिति ही इंगित करता है कि यह इस विकास के चरण में परिपक्व है, जबकि अंय दीवारों अभी भी आगे और अधिक बहुलक जमाव की साइट हैं । एक जेड-टैक का खंगाला हुआ 3d दृश्य स्पष्ट रूप से Casparian बैंड को प्रकाश में लाता है । दिलचस्प है, कुछ cortical endodermis से सटे कोशिकाओं की दीवारों को भी एचAZ तरजीह (जिससे सन रूट प्रांतस्था में लिग्निन/उपआयलैंड की उपस्थिति का संकेत) शामिल करने में सक्षम साबित कर दिया, लेकिन नहीं जीALK। सह स्थानीयकरण विश्लेषण ने HAZ और GALKके बीच एक विरोधी सहसंबंध दिखाया, जो इन दो सन्निकट कक्ष प्रकारों में सेल-विशिष्ट दीवार संरचना/एंजाइमी मशीनरी के अस्तित्व का सुझाव देता है ।

पूरक तालिका 1: ठोस ½ एमएस माध्यम की तैयारी इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: केमिकल रिपोर्टर स्टॉक समाधानों की तैयारी इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

जैसा कि पहले उल्लेख किया है, इस पत्र में प्रस्तुत दोहरी लेबलिंग आनंद प्रोटोकॉल vivo12,23 मेंएक SPAAC/CuAAC संयोजन के पहले उदाहरणों में से एक है । हर कदम को अच्छी तरह से अनुकूलित और मान्य किया गया था, और यह बहुत महत्वपूर्ण है कि क्रम में दो क्लिक रसायन शास्त्र लेबलिंग प्रतिक्रियाओं क्रमिक रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं का सम्मान किया जाता है (यानी, SPAAC पहले, CuAAC द्वारा पीछा). सभी पार नियंत्रण से पता चला कि प्रत्येक लेबलिंग कदम विशिष्ट है जब आनंद प्रोटोकॉल23 लागू किया जाता है: बाहर ले SPAAC कदम पहले एचAZ azide कार्यों के उच्च chemoselective लेबल की ओर जाता है द्वारा cyclooctyne-कार्यात्मक fluorophore के माध्यम से एक [3 + 2] तेजी से कैनेटीक्स के साथ cycloaddition प्रतिक्रिया । एक बार एचAZ इकाइयों टैग कर रहे हैं, CuAAC कदम महसूस तांबा (I) catalyzed सक्रियण जीALK टर्मिनल alkynes के triazole-azide ५४५ जांच के साथ प्रतिक्रिया द्वारा fluor लिंक उत्पंन करने के लिए बाहर किया जा सकता है । इसके विपरीत, रिवर्स आदेश (यानी, CuAAC पहले, SPAAC द्वारा पीछा किया) के रूप में यह जीALK और एचAZ इकाई पार-युग्मन, जो fluorophore बंधाव के साथ प्रतिस्पर्धा और संकेत के एक नाटकीय नुकसान लाती है की ओर जाता है नहीं होना चाहिए . यह भी गैर विशिष्ट दाग से बचने के लिए मध्यवर्ती धुलाई कदम की आवश्यकता तनाव महत्वपूर्ण है ।

हमें पता चला है कि हमारे विधि विभिंन जैविक प्रयोग डिजाइन करने के लिए लागू किया जा सकता है । आनंद लेबल प्रोटोकॉल पहले मुक्तहस्त पार करने के लिए लागू किया गया था सन उपजी (लगभग 150-250 µm मोटी) है कि पहले काट रहे थे और क्लिक के साथ मशीन तैयार monolignols । हालांकि इस डिजाइन रसायन रिपोर्टर की जरूरत मात्रा को कम करने का लाभ है (के रूप में मशीन मात्रा कम कर रहे हैं) और सांख्यिकीय के उत्पादन को बढ़ावा देने की प्रतिकृति, यह नहीं है, कड़ाई से बोल रहा हूं, एक vivo में प्रणाली और कुछ में मामले, असली spatio-लौकिक lignification गतिशीलता के सभी पहलुओं को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं । एक दूसरे प्रयोगात्मक डिजाइन में, हम इसलिए एक विधि है कि पहले से पाइन और gingko27में radiolabeled monolignols के शामिल अध्ययन किया गया था करने के लिए आनंद प्रोटोकॉल अनुकूलित । इस दृष्टिकोण में, जड़ों और स्टेम संयंत्र के शारीरिक रूप से अलग कर रहे है और पूरे स्टेम के आधार क्या ' फूल ' फूलदान दृष्टिकोण डब किया जा सकता है में monolignol समाधान में मशीन है । छोड़ने के बाद वांछित (गर्मी) समय उपजा है, पार वर्गों में कटौती कर रहे है और आनंद प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया । यह हमें दिखाने के लिए अनुमति दी (मैं) कि संशोधित monolignols स्टेम के माध्यम से ले जाया जाता है और सेल दीवारों के भीतर लिग्निन पॉलिमर बढ़ रही है और (द्वितीय) है कि स्थानीयकरण पैटर्न अनिवार्य रूप से पार की धारा के समान था में शामिल कर रहे है दृष्टिकोण. प्रयोग के इस प्रकार के एक असली जीवित संयंत्र में प्रदर्शन किया जा रहा है की योग्यता है/अब प्रयोग और अधिक गहराई से अध्ययन की अनुमति लाइव सेल दृष्टिकोण, लेकिन रासायनिक रिपोर्टर की अधिक से अधिक मात्रा की आवश्यकता है । अंत में, आनंद प्रोटोकॉल भी सन संयंत्र अंकुर के साथ प्रयोग किया जाता था, एक असली जीवित संयंत्र मॉडल जिसमें रासायनिक पत्रकारों जड़ों के माध्यम से अवशोषित किया जा रहा है पहले स्टेम तक ले जाया जा रहा है का प्रतिनिधित्व । हालांकि इस मॉडल का स्पष्ट लाभ है रहने वाले पौधों में प्रदर्शन किया जा रहा है, व्यवहार में, यह युवा अंकुरों तक ही सीमित है और व्यावहारिक कारणों के लिए पुराने पौधों में lignification गतिशीलता की जांच के लिए वास्तव में उपयुक्त नहीं है (लंबी गर्मी समय, ऊंचा रासायनिक पत्रकारों की मात्रा) । फिर भी, इन तीन प्रयोग डिजाइन पूरक है और सभी के साथ अपने पेशेवरों और विपक्ष व्यावहारिक पहलुओं और जैविक महत्व जैविक प्रश्न के प्रकार पर निर्भर करता है के लिए उत्तर दिया जाना है ।

सन में lignification गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विकसित, हमारे प्रोटोकॉल उच्च अनुकूलनीय न केवल जैविक प्रयोग डिजाइन के मामले में है, लेकिन यह भी अन्य प्रजातियों के पौधे और अंगों के लिए अपने आवेदन के संदर्भ में/ उदाहरण के लिए, आनंद आसानी से Arabidopsis या Populus पीढ़ी है कि और अधिक नॉक आउट के साथ अध्ययन के लिए या दस्तक-नीचे म्यूटेंट विभिंन जीन के लिए उत्तरदाई है स्थानांतरित किया जा सकता है । सिद्धांत रूप में, हमारे दृष्टिकोण के साथ दोहरी लेबलिंग अध्ययन भी संयंत्र सेल दीवार पॉलिमर के दो अलग संशोधित अग्रदूतों का उपयोग करके अंय अणुओं को बढ़ाया जा सकता है-सभी तीन मुख्य monolignols या उनके चयापचय अग्रदूतों सहित के रूप में अच्छी तरह से विभिंन monosaccharides कि polysaccharide मैट्रिक्स का गठन । अपनी स्थापना के बाद से, bioorthogonal रसायन वास्तव में मुख्य रूप से चयापचय oligosaccharide इंजीनियरिंग के माध्यम से glycans/polysaccharides की जांच करने के लिए विकसित किया गया है (मो)4,5,17,28, लेकिन आश्चर्य की बात यह है कि अभी तक जीव विज्ञान संयंत्र के लिए केवल बहुत कुछ आवेदन किया गया है7,8,9,10,11,12। प्रतिक्रियाओं की अनुकूलता के संदर्भ में, लिग्निन के अध्ययन वास्तव में एक जटिल मामले के रूप में दोनों रासायनिक पत्रकारों को एक ही reticulated बहुलक में शामिल कर रहे है हल किया गया । HAZ-gALK पार लिंक गठन की संभावना के लिए 3 डी के भीतर जीALK और एचAZ इकाइयों के स्थानिक निकटता के कारण दूर करने के लिए प्रमुख मुद्दा था लिग्निन23की संरचना, एक सीमा जो मौजूद नहीं हो सकता है यदि दो रासायनिक रिपोर्टर एक ही प्रकार के किसी भी सेल के एक ही स्थानिक क्षेत्र में या जैव बहुलक में शामिल नहीं हैं ।

एक व्यापक क्षेत्र में आनंद पद्धति अनिवार्य रूप से दो अलग रासायनिक एक azide और टर्मिनल alkyne टैग असर पत्रकारों, क्रमशः का उपयोग करते हुए बैक्टीरियल या पशु मॉडल में किसी भी दो रंग प्रतिदीप्ति इमेजिंग अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस तकनीकी पर्यावरण को प्राप्त करने के लिए अनुकूल प्रदान करने के लिए हम अनुसंधान महासंघ FRABio और TisBio इमेजिंग प्लेटफार्म (उणीव. लील, CNRS, फादर ३६८८, FRABio, BiochimieStructurale एट Fonctionnelle डेस Assemblages Biomoléculaires) के ऋणी हैं । काम.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ) Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK) Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338
2% sodium hypochlorite
20 cm high glass tube
250 mL Schott glass bottle
48-well Plate
5/6-TAMRA-PEG3-Azide Jena Bioscience CLK-AZ109-1
Aluminium foil
Cheese cloth
Compost containing clay
Coniferyl alcohol (G) Sigma Aldrich MFCD00002922
Copper (II) sulfate pentahydrate
DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110 Jena Bioscience CLK-A127-1
Milli-Q Ultrapure water
Eppendorf 1,5 mL
EtOH
Flax seeds (L. usitatissimum L.)
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium Electron Microscopy Sciences 17984-25
Glass coverslip
Glass microscope slide
Growth chamber CLF-Plant Climatics For 2-week-old plants culture
Growth chamber Angelantoni Life Sciences For 2-month-old plants culture
Magenta plant culture box For 2-week-old seedling culture
Methanol Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood
Micropipette
Nail polish
Nikon A1R confocal microscope Nikon
Orbital shaker
Parafilm
p-Coumaryl alcohol (H) Carbosynth FC145653
Plastic cap
Plastic pipette
Plastic pot For 2-month-old plants culture
Razor blade
Rubber band
Sodium Ascorbate
Sterile clamp
Vertical support
Vortex
Reagents for liquid and solid ½ MS medium
KH2PO4
KNO3
NH4NO3
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
MnSO4.H2O
ZnSO4.7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
Na2EDTA.2H2O
FeSO4.7H2O
Thiamine.HCl
Pyridoxine.HCl
Glycine
Nicotinic acid
Myo-inositol
Saccharose
MES hydrate
Agar

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References

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Simon, C., Spriet, C., Hawkins, S., Lion, C. Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!. J. Vis. Exp. (131), e56947, doi:10.3791/56947 (2018).

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